抑制前列腺癌细胞的4,通过细胞周期阻滞5-Dicaffeoylquinic酸

文摘

前列腺癌是男性恶性肿瘤死亡率的主要原因。尽管当前的治疗管理有助于降低死亡率,额外的干预策略的进一步改善的结果。为此,我们有调查dicaffeoylquinic酸的功效,在巴拉圭茶成分(冬青属植物paraguariensis),一个常绿栽培在南美洲,用于准备茶的叶子/咖啡豆一样的饮料。的各种模拟测试4 5-dicaffeoylquinic酸(4 5-diCQA)是最活跃的分子对前列腺癌细胞du - 145 50%抑制浓度(IC₅₀5)μm . 4, 5-diCQA活跃在常氧和缺氧条件下。72小时的影响治疗du - 145细胞持续较长时间的单独评估分析。机械的研究显示,毒性作用并不是由于诱导细胞程序性死亡而是通过细胞周期阻滞在S期。另外4 5-diCQA并不影响PI3K / MAPK信号通路也没有影响线粒体膜的去极化。4,5-diCQA-induced积累细胞似乎也产生负面影响的s阶段bcl - 2表达。4,5-diCQA也表现出了抑制前列腺癌细胞活动LNCaP和曲泽表明它有治疗前列腺癌的潜在广泛。综上所述,这部小说抑制活动和4的作用机制,5-diCQA开辟了潜在的治疗选择使用这个分子作为单一疗法以及组合治疗前列腺癌的临床管理。

1。介绍

全球癌症死亡率的统计数据显示,2018年有960万人死于癌症1]。世界癌症报告估计前列腺癌发病率为31.1 100000年,仅次于肺癌是癌症的男性(100000年的34.1)2]。此外,估计年龄标准化发病率为男女癌症乳腺癌后前列腺癌2018年排名第二,而男性相似的标准化的数据显示前列腺癌第二肺癌(3]。因此,更有效的治疗是高死亡率的减少。分子抗癌活动从自然资源是最近特别感兴趣,因为他们经常没有有害的副作用比常规化疗。同时,他们可能结合当前癌症治疗对前列腺癌增加它们的有效性,同时减轻副作用。

巴拉圭茶(YM) (冬青属植物paraguariensis),这是用来准备一个茶/咖啡豆一样喝在南美洲,可以包含许多生物活性物质与一系列健康(4- - - - - -6]。这种饮料的主要成分,即多酚和dicaffeoylquinic酸(diCQAs),研究了生物活性。而一些研究集中在包含diCQAs YM提取物的抗氧化和消炎作用,抗肿瘤药的影响还没有被广泛地研究过了。这些化学物质只有为他们的抗癌特性研究主要是针对一些癌症包括胃肠道癌症,因为口腔产品的消费(7,8]。此外,YM组件还演示了活动对胰脂酶(9]。详细研究抗癌的作用效果和模式缺乏这类化合物。

本研究采取调查diCQAs在前列腺癌细胞的功效。使用前列腺癌细胞系如du - 145, LNCaP,曲泽,我们探索的功效diCQAs抑制细胞增殖。此外,我们阐明的基本机制4,5-diCQA-induced通过高转移性前列腺癌细胞系细胞死亡的du - 145。

2。材料和方法

2.1。细胞系和材料

细胞系使用从美国获得类型文化集合(写明ATCC)。完成du - 145细胞株生长介质是由补充鹰的最低基本培养基有10%胎牛血清的边后卫,青霉素和链霉素1%,2毫米谷酰胺。文化是在37°C的环境大气中5%的有限公司₂和95%的空气。3 4-diCQA 3、5-diCQA和4,5-diCQA都购自σ(分别SMB00224、SMB00131和SMB00221)和溶解在DMSO创建股票的解决方案。

2.2。细胞毒性的评估diCQAs du - 145

du - 145细胞被镀在96 -孔板(5000个细胞/)一式三份的控制和diCQA治疗。孵化24小时后,介质也换成新的介质(控制)或媒体各种化合物的浓度。浓度用于4、5-diCQA共100名μ米、75μ50米,μ25米,μ10米,μ5米,μM, 1μ0.1米,μ而浓度检测3,4-diCQA和3,5-diCQA共100名μ米、75μ50米,μ25米,μ10 M,μm . 72小时的细胞被孵化。产生缺氧条件下,100μ氯化钴的M添加到完整的生长介质。经过72小时的治疗时期,细胞生存能力评估通过执行细胞计数Kit-8 (CCK-8)试验按制造商的协议(Bimake CCK-8协议B34305)。

2.3。单独使用化验

细胞(100000 /)一式三份治疗72小时与5μ4米,5-diCQA 6-well盘子。治疗期后,细胞被胰蛋白酶化收集和统计。确定细胞的集落形成效率,控制和治疗细胞被播种在6-well板块在500细胞的密度和孵化无毒媒体和离开增殖9天。可视化的殖民地形成,文化媒体被移除之后通过与PBS洗文化,修复与冰冷的甲醇,然后用结晶紫染色方案。

2.4。缪斯®流仪分析

各种流仪分析,1×10⁵每口井的细胞被播种在一式三份6-well细胞培养板和处理5μ4米,5-diCQA为72小时。细胞被收获和彩色的缪斯细胞包协议。各种流仪分析执行缪斯膜联蛋白V &死细胞试验(MCH100105) Mitopotential化验(MCH100110)、Bcl2激活双重检测试验(MCH200105) PI3K-MAPK双重激活检测试验(MCH200108)和细胞周期分析(MCH100106) (EMD微孔)。细胞分析按照制造商的指示提供的工具包(分析工具包中提供的参考数据括号上图)使用一个缪斯细胞分析仪。每个实验独立完成至少3次。

2.5。抑制潜在的5-diCQA LNCaP和曲泽细胞系

调查是否4,5-diCQA在其他前列腺癌细胞具有抑制活性,毒性研究进行LNCaP曲泽细胞系。细胞(5000 /)被播种在RPMI 96孔板中补充10%胎牛血清,1%青霉素、链霉素、谷酰胺和2毫米。24小时后,媒体被移除和贴壁细胞治疗与不同浓度的4,5-diCQA。评估毒性,CCK-8试验72小时后进行。

2.6。4、评估5-diCQA毒性不同组织来源的肿瘤细胞

确定程度的抗癌活性的4,5-diCQA癌症细胞系除了前列腺癌,我们使用人类结直肠恶性腺瘤细胞系(DLD-1),人类食管腺癌细胞系(OE-33),人类liver-derived腺癌细胞系(SK-HEP-1),和人类胶质母细胞瘤细胞系(U87EGFP,绿色荧光蛋白的表达)。细胞被播种在96 -孔板的密度5000细胞/。OE-33和DLD-1细胞,RPMI中补充10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,2毫米谷酰胺使用。U87EGFP和SK-HEP-1 DMEM和EMEM类似的补充剂,分别。细胞治疗5μM的浓度4,5-diCQA 72小时后这段,CCK-8试验进行评估细胞的可行性。du - 145细胞也在相同的浓度。评估影响nontumorigenic细胞,NIH-3T3小鼠成纤维细胞在DMEM培养与10%的边后卫,1%青霉素、链霉素、谷酰胺和2毫米和MC-3T3老鼠preosteoblast细胞培养αmem和10%的边后卫是包括在上面的实验。

3所示。结果

3.1。4,5-diCQA诱发du - 145细胞的毒性

评估的抗癌潜力diCQA人类前列腺癌,du - 145细胞与不同浓度的三个diCQA类似物治疗(3 4-diCQA 3、5-diCQA和4,5-diCQA)在常氧和缺氧条件下72小时。治疗4、5-diCQA产生剂量依赖性抑制IC₅₀5μ4-diCQA和3 m .相比之下,3日,5-diCQA并未引起毒性du - 145细胞即使在高浓度(图1(一))。因此,4,5-diCQA治疗比其同分异构体更有效p值= 0.00022。相同的治疗方法是重复du - 145细胞生长在缺氧条件下所产生的100年μM CoCl₂(如“材料与方法”中描述),和一个类似的剂量依赖性抑制观察(图1 (b)),假定值= 0.00776。CCK-8测定结果表明,4,5-diCQA诱发du - 145细胞毒性剂量依赖性的方式在常氧和缺氧条件下,而其他的同分异构体化合物抑制少得多。

3.2。4,5-diCQA抑制du - 145细胞的增殖和菌落生长后治疗

单独使用进行了分析评估du - 145细胞增殖和殖民地增长治疗后。结果表明,4,5-diCQA治疗72小时影响细胞的能力,形成殖民地,从而减少殖民地在治疗组与控制(数字2(一个)和2 (b))。这表明72小时治疗引发的细胞效应继续影响细胞增殖没有4,5-diCQA。

3.3。4,5-diCQA诱导细胞周期阻滞在du - 145细胞

确定的作用机制4,5-diCQA du - 145细胞增殖,抑制缪斯流仪进行细胞周期分析。细胞(1 x 10⁵细胞/镀好)和治疗6-well板5μ4,5-diCQA并与对照组(无治疗)。结果表明,细胞治疗4、5-diCQA减少数字在G0 / G1期,增加了在S期与闸门设置对照组(数据3(一个)和3 (b))。4,5-diCQA治疗细胞数量的两倍阻塞在s阶段规范化控制封闭细胞s阶段(人口控制s阶段被认为是100%)(图3 (c))。

3.4。4,5-diCQA-Induced毒性不是介导du - 145年通过程序性细胞死亡的细胞

为了阐明4的作用方式,5-diCQA,研究确定du - 145细胞的死亡是由于感应的外在或内在的凋亡通路。为此,膜联蛋白V缪斯流仪测定进行比较细胞处理集成电路₅₀浓度与对照组72小时。控制和治疗组的概要文件是类似的,没有早期或晚期凋亡细胞治疗组排除外在的参与凋亡通路(数字4(一)和4 (b))。数据研究分析线粒体膜的去极化控制和治疗组之间没有差异,这表明4,5-diCQA不发挥其行动通过内在凋亡通路(图5(一个)和5 (b))。

3.5。4、5-diCQA治疗bcl - 2表达的影响

自从bcl - 2表达中起着重要作用在各种癌症生存,我们调查是否4,5-diCQA bcl - 2表达的影响du - 145细胞。4、5-diCQA治疗显示,复合诱导失活的bcl - 2 nonexpressing细胞(图的比例更高6)。

3.6。4,5-diCQA展品LNCaP和曲泽细胞株抑制活动

LNCaP细胞生存能力分析进行治疗后,前列腺癌细胞曲泽透露,4日5-diCQA影响这些细胞的扩散。剂量依赖性抑制LNCaP曲泽细胞观察。这些细胞株的毒性是类似于观察du - 145。此外,曲泽细胞显示略高灵敏度,5-diCQA(图7)。

3.7。du - 145细胞最敏感,5-diCQA相比不同组织来源的肿瘤细胞

研究结果的敏感性不同癌症细胞系4,5-diCQA透露,这个分子du - 145细胞上有极大的抑制活性。4的抑制活性,各种癌症细胞系5-diCQA du - 145 > U87 > DLD-1 = OE-33 > SK-HEP-1。此外,在测试浓度4 5-diCQA没有抑制活性的非癌变细胞系NIH-3T3和MC-3T3(图8)。

4所示。讨论

尽管癌症的临床管理使用化疗药物产生了一些成功,仍然存在有需要开发更有效的治疗方案。这需要发现和开发新型抗癌分子。当前的地区之一的调查在这方面一直在探索的潜力从天然产物活性抗癌成分。这些衍生品不仅抑制肿瘤细胞增殖,但也可能有更少的副作用比目前使用的化学疗法。

YM,树叶被用在一个受欢迎的饮料在南美洲,建议有几个好处。多项研究都集中在YM提取物的生物活性。Cuelho et al .,在小鼠研究中,观察到chemoprotective YM提取含有多酚对UVB照射的影响(10]。YM消费还降低了与血脂异常受试者的血总胆固醇(11]。此外,政府的YM老鼠积极成果对炎症(12]。大部分的研究都是用提取的YM包含多个成分包括多酚。因此,很难观察到的活动分配给一个特定的分子(s)。这促使我们测试的一些成分的抗癌潜力如diCQAs纯形式。

我们的研究结果,首次展示了强有力的抗癌活性的4,5-diCQA对前列腺癌细胞。此外,单独分析的细胞处理集成电路₅₀浓度为72小时,培养在缺乏5-diCQA表明,细胞增殖抑制活动持续导致只有百分之十二的殖民地框架相比,未经处理的控制。早期的研究已经测试了一些diCQAs对某些类型的癌症。酚类提取包含5-diCQA和3的YM, 5-diCQA连同其他组件,当检测结肠癌细胞系Caco-2,肺癌- 549,食道癌OE-33,降低膀胱癌T24,显示这些细胞的生存能力和扩散率(7]。YM酚提取也抑制scc - 61和OSCC-3鳞状细胞癌细胞系(13]。Puangpraphant等人测试甲醇提取物含有的混合3 4-diCQA和3,5-diCQA以及一小部分包含4,5-diCQA结肠癌细胞株crl - 2577和HT-29。作者猜测,测试分数通过激活半胱天冬酶3抑制细胞增殖和细胞凋亡蛋白酶3降解途径(8]。结果前列腺癌的细胞周期进程阻塞的不同于观察结肠癌细胞。这就提出了一个4的可能性,5-diCQA有不同细胞癌症的不同组织来源的目标。使用化疗是通过不同的机制,与4,5-diCQA,应该在前列腺癌产生协同抑制作用。同样值得注意的是,到目前为止报道文学研究与YM提取物显示了对正常细胞没有抑制活动等非癌变CCD-18Co细胞系(7和成纤维细胞10]。从我们的研究结果与NIH-3T3 MC-3T3细胞进一步证实了缺乏对正常细胞毒性为4,将提供一个更高的治疗指数5-diCQA前列腺癌。额外的研究4的影响,5-diCQA以及它的在活的有机体内功效是必要的,以确定这种化合物的转化潜力。

逮捕耦合影响s阶段早些时候已被证实有抗增殖效果差别bcl - 2对这些基因在卵巢癌细胞(14]。直接抑制相关的bcl - 2在头部和颈部癌症显示S期逮捕和抑制增殖的15]。这些研究证实了我们的观察与du - 145细胞。

未来的研究应该探索的基础微分灵敏度的各种类似物,即3 4-diCQA, 3, 5-diCQA, 4, 5-diCQA。类似于早先的报告(16),我们也观察到,4,5-diCQA是容易降解。工作正在进行中,以稳定化合物达到更好的半衰期有可能转化为增强在活的有机体内功效。发现与4,5-diCQA如果通过复制在活的有机体内研究中,单独或组合,可以为前列腺癌的治疗提供新的治疗策略。

数据可用性

所有的数据结论包含在这篇文章。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们愿意承认BME部门的资金支持的教学实验室,Coulter资金和技术费用由乔治亚理工学院。奥利维亚Lodise是佐治亚理工学院的奖学金获得者总统的本科生研究奖(对于)。

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