分析Argonaute复杂的绑定mrna在前列腺癌DU145细胞显示新的microrna的目标基因

文摘

转录后的基因调控小分子核糖核酸(microrna)导致的感应和维护前列腺癌(PCa)。确定mrna丰富或从Ago2-containing RISC复合物,这些复合物免疫沉淀物从正常前列腺成纤维细胞(PNFs)和PCa DU145和绑定mrna被微阵列量化。分析前复合物源自PNFs DU145证实了浓缩或损耗的各种各样的mrna已知文献管制。小说分析了潜在目标通过荧光素酶化验microrna在PCa管制。我们证明的mrna死亡效应domain-containing蛋白质(DEDD)、肿瘤坏死因子受体超家族,成员10 b蛋白(TNFRSF10B),肿瘤蛋白质p53诱导核内蛋白1 (TP53INP1)和分泌蛋白、酸性,cysteine-rich (SPARC;骨粘连蛋白)是由microrna mir - 148 a, miR-20a, miR-24,分别和miR-29a / b。因此,这些microrna代表潜在的治疗靶点。令人惊讶的是,过度的miR-24诱导专注DU145细胞的形成和扩散,而miR-29b减少扩散。这项研究证实了基因管制在PCa由于他们的存在/ Ago2-complex缺席。结合PCa的已经发表microrna的概要文件,这些数据可以用来识别miRNA-regulated mrna。

1。介绍

前列腺癌(PCa)是一个全球男性癌症发病率和死亡率的主要原因(1]。PCa的病因复杂,许多基因(2]和[表观遗传学改变3)曾被报道。

可能的功能说明,遗传或表观遗传改变的后果仍然是一个巨大的挑战。小分子核糖核酸(microrna)的18 - 23元长度短的非编码rna转录后的调节基因的表达被绑定到mRNA目标抑制蛋白质合成(了4])。在肿瘤发生的背景下,microrna能函数作为肿瘤抑制和致癌基因(5]。他们注定要目标mRNA在RISC复杂,它包含一个Argonaute(前)蛋白质是拴在mRNA的microrna。绑定的microrna的最初目标抑制蛋白质合成减少翻译但最终导致退化的mRNA目标(6]。

microrna的表达在PCa也已经有了很广泛的研究(综述[7])。我们先前描述的microrna的PCa在肿瘤的不同阶段,可以确认新目标的microrna管制PCa (8- - - - - -12]。虽然已经有实质性进展的理解如何处理microrna并加载到前蛋白复合物(了6,13]),它还不完全理解如果或pre-miRNAs如何选择加载到前复合物如果管制microrna的表达最终导致丰富的改变这microrna在活跃miRISC复合物。建设活动miRISC之后,microrna的组件引导积极miRISC复杂其同源mRNA的目标。有许多其他因素可能会影响最后的互动与目标mRNA(综述[miRISC14])。miRNA-regulated mrna可以孤立的免疫沉淀反应前蛋白(s) (15- - - - - -18]。因此,我们的研究的目的是调查是否改变microrna的表达在PCa导致光谱的改变miRISC-associated mrna在癌症细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞系

人类的PCa细胞系DU145 LNCaP以及HEK293T细胞从德国购买的微生物和细胞培养(DSMZ,布伦瑞克,德国)。主要人类前列腺正常成纤维细胞(PNF-08)请提供的Gerhard Unteregger教授(泌尿外科部门,萨尔州大学医学院)。所有细胞培养(如前所述)(19]。的降水Ago2包含RISC复杂,大约的提取。2×10⁸PNF-08和DU145细胞(见下文)。

2.2。RNA提取

摘录细胞系生成使用试剂盒(生活技术,达姆施塔特,德国)。提取总RNA和蛋白质按试剂盒说明书进行。

2.3。分析Ago2-Bound mrna

从DU145 Ago2-containing RISC复合物被孤立,PNF细胞如前所述(虽然20.]。不久,DU145 PNF-08细胞组成的细胞溶解在缓冲NP40 0.5%, 150毫米氯化钾,25毫米三pH值7.5,2毫米EDTA, 0.5毫米德勤。离心后在4°C 15.000 g×20分钟,上层的孵化4 h在4°C与g蛋白琼脂糖(通用电气医疗集团,索林根,德国)以前充满Ago2-specific抗体11 a9 [16]。珠子被洗多次与一个缓冲区包含300毫米氯化钠,50毫米三pH值7.5,5毫米MgCl₂,0.05% NP40。珠子被孵化15分钟在65°C蛋白酶K消化缓冲区(氯化钠300毫米,200毫米Tris-HCl, pH值7.5,25毫米EDTA, 2% SDS, 20毫克/毫升蛋白酶K) RNA。然后用试剂盒提取根据试剂盒手册。

2.4。微阵列分析

样品制备的微阵列杂交进行按照Ambion WT表达式工具协议(热科学)和Affymetrix WT终端标签和杂交用户手册(Affymetrix, Inc .,圣克拉拉、钙、美国)。总之,200 - 300 ng提取RNA的反向转录,使用一个rRNA-depleted随机引物组合,提供在Ambion WT表达工具,其次是一种体外转录反应。8 - 12μg体外转录反义RNA的纯化和反向转录成dUTP-containing有义链——(ss)的互补。纯化ss-cDNA分散使用DNA结合尿嘧啶糖基化酶(UDG)和apurinic / apyrimidinic酶1(猿1),其次是终端与生物素标记。这一过程产生了1和3之间μg支离破碎和标记ss-cDNA,杂化Affymetrix人类基因第1.1挂钩板阵列。杂交、洗涤、染色和阵列扫描进行GeneTitan®工具(Affymetrix)。

总结调查设置信号计算通过应用RMA (21)算法的实现Affymetrix GeneChip表达式控制台软件。结果文件出口。txt格式,折叠/意义的计算是在Microsoft Excel进行改变。

2.5。数据分析

首先,文学研究已经完成mrna的丰富或耗尽至少三倍Ago2复合物的DU145相比PNF-08识别基因在前列腺肿瘤发生或癌症发展和进展。发现检查他们的基因表达在前列腺正常和肿瘤组织使用一个在线数据库mRNA表达的微阵列oncomine.org。下一步是分析3′未翻译区(3′utr)选择基因的假定的microrna的目标站点(补充表S2在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/4893921)。预测的microrna的目标站点3′utr是由在线算法targetscan(http://www.targetscan.org/)和microRNA.org使用绑定的种子序列,结合能,和结合位点的保护标准。选择进行进一步分析,假定的绑定microrna之前发表在PCa管制。

2.6。实时定量PCR(存在)的mRNA分析表达式

互补脱氧核糖核酸合成与发电机进行互补脱氧核糖核酸合成装备(Finnzymes男孩,万塔,芬兰)使用200 ng总RNA和随机的六聚体引物。实时PCR进行了一式三份使用TaqMan基因表达分析和TaqMan试剂(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据制造商的协议与StepOnePlus实时PCR系统(生活技术,达姆施塔特,德国)。Sequence-specific引物和EI24 fluorescence-labeled探针互补,YWHAE, TFRC, CORO1C, S100A16, NLK, RAB1B, DEDD, CUL5, PRDX3和内生参考GAPDH。所有pcr测定一式三份的最后一卷10μ包含1 x L TaqMan普遍PCR大师(没有Amperase))和50 ng的互补。热循环条件选择根据制造商的建议。作为参考示例cDNA准备从DU145细胞包含在每个反应板。计算相对RNA表达水平的应用方法(22)都使用了StepOne软件v2.0(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。

2.7。双荧光素酶检测

双荧光素酶检测采用3′UTR记者pMIR-RNLTK(双萤火虫和renilla荧光素酶向量)HEK293T细胞进行了描述(11]。总共有10⁵HEK293T细胞被播种在每个腔24-well组织培养皿和转染使用Nanofectin转染试剂(通用电气医疗集团,索林根,德国)0.2μg /记者向量和0.8μg pSG5-miRNA效应质粒(年代)。荧光素酶检测转染后48小时进行使用双荧光素酶报告实验系统根据制造商的指示(WI Promega,麦迪逊,美国)。化验进行了一式两份,并为每个效应进行至少4次/记者对。

2.8。质粒

pSG5质粒的microrna的表达miR-24和-29 b (11],mir - 148 a [10],mir - 200 c和-375 [12一直在前面描述的。在目前的研究中,microrna miR-15b, 20, -21年和-29年从人类基因组DNA PCR扩增和插入到向量pSG5(安捷伦科技)使用S3补充表中所示的引物。3′utr死亡的基因效应domain-containing蛋白质(DEDD)、肿瘤坏死因子受体超家族,成员10 b蛋白(TNFRSF10B),肿瘤蛋白质p53诱导核内蛋白1 (TP53INP1),分泌蛋白、酸性,cysteine-rich (SPARC;骨粘连蛋白),阿贝尔森关联2蛋白质(ABI2)和periredoxin 3 (PRDX3)蛋白质PCR扩增和插入到pMIR-RNLTK向量使用S3补充表中所示的引物。必要时,microrna的潜在的结合位点突变PCR;引物用于补充表中所示的突变也S3。

2.9。西方墨点法

西方墨点法,2×10⁵DU145细胞生长在10厘米菜肴转染了10μ克的质粒DNA使用jetPRIME (Polyplus转染、Selestat、法国)。48 h后细胞细胞溶解与2倍集中裂解缓冲(130毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液6% SDS, 10% 3-mercapto-1 2-propandiol, 10%甘油)和30μg tricine凝胶分离提取蛋白质的9%,转移到硝化纤维素膜(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。膜被封锁TBST / 5% BSA 30分钟和孵化主要抗体/晚上4°C。与TBST洗涤三次后,细胞膜是孵化HRP-conjugated二级抗体在室温下1 h。蛋白质乐队与ECL试剂检测(通用电气医疗集团)使用富士胶片las - 3000成像系统(富士胶片、东京、日本)。主要兔子anti-SPARC抗体购自细胞信号技术(# D10F10,丹弗斯、马、美国),鼠anti-TP53INP1抗体是一个慷慨的礼物从爱丽丝博士载体(中心de矫揉造作的en Cancerologie de马赛,法国),和二级HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(# 31460)和山羊anti-rat免疫球蛋白(# 31470)抗体购自热科学皮尔斯(费舍尔科学,Schwerte,德国)。

2.10。集落形成实验

2×10⁶DU145细胞被播种在10厘米的菜肴和转染10μ使用jetPRIME g质粒DNA (Polyplus转染、Selestat、法国)。转染24小时后,细胞被胰蛋白酶分离,在10毫升resuspended介质,播种在6-well板(2000个细胞/),并培养了8天。媒介置换后,文化被水晶紫沾0.4%,与4%的多聚甲醛固定30分钟,并与PBS洗3次。井拍摄和densitometrically分析ImageJ 1.48 v(美国国立卫生研究所)。

2.11。细胞增殖实验

1.5×10⁵DU145细胞被播种在6-well盘子,转染2μ使用jetPRIME g质粒DNA (Selestat Polyplus转染,法国)和培养24 - 72 h。测量细胞转染后数字天0到3,细胞分离胰蛋白酶和resuspended 1毫升的媒介。细胞数量测定卡西1细胞计数器(Scharfe系统、Reutlingen德国)在细胞/毫升。

2.12。统计数据

荧光素酶检测的统计评估了SigmaPlot 10 (Systat)使用学生的以及分析。所有统计测试进行双边和值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

识别mrna不同浓缩或排除在RISC复杂,Ago-2前列腺正常成纤维细胞免疫沉淀物从提取物(PNF-08)和PCa细胞系DU145使用前面介绍的Ago-2抗体11 a9和合适的同形像控制(15,16]。中的mrna Ago-precipitate被微阵列分析量化。的相对丰度RISC-associated mrna在补充表中给出的两个细胞系S1。24 mrna,表现出明显的富集或耗尽前复合物的DU145细胞呈现在表1。补充表S4列出了基因的功能(如果已知)表1如果他们是潜在的microrna在PCa管制或已知的目标。例如,丰度最高的前复合物DU145细胞观察层粘连蛋白α3 (LAMA3)。这种基因的表达,以及其他的家庭成员,显著降低前列腺癌(23)符合作为一个潜在的目标microrna miR-20a和mir - 106 a (http://www.targetscan.org/),这两者都是上调的前列腺癌(8,19]。除了LAMA3 mRNA,高度RISC-enriched腺苷酸环化酶3 (ADCY3) mRNA是一个潜在的目标调节microrna miR-25和miR-27a / b。相反,Thy-1细胞表面抗原(THY1)已被证明是调节在PCa (24]。因此,THY1 mRNA水平降低前复杂的DU145细胞。

然后我们选择10 mrna,根据我们的研究结果,表明在PCa可能放松管制。我们分析了存在这些基因的相对表达PNF-08细胞DU145与LNCaP细胞。六mRNA选择,表现出的浓缩前从PCa细胞复合物,因此潜在的细胞系和肿瘤中表达下调:依托泊苷诱导2.4 mRNA (EI24,别名p53诱导基因8蛋白),S100钙结合蛋白A16 (S100A16) Nemo-like激酶(NLK), RAS致癌基因家族成员1 b (RAB1B),死亡效应domain-containing蛋白质(DEDD), cullin - 5 (CUL5)。在另一端,我们选择了mrna显示耗尽前复合物的PCa细胞,因此可能在PCa细胞和肿瘤。这些都是酪氨酸3-Monooxygenase (YWHAE,即14-3-3蛋白ε),转铁蛋白受体(TRFC) coronin,肌动蛋白结合蛋白1 c (CORO1C)和periredoxin 3 (PRDX3)。分析结果如图所示1。

我们最初的预期,mRNA富含前复合物进行降解deadenylation或5′-decapping这将导致减少整体全细胞RNA信使RNA含量的准备。有趣的是,定量PCR分析的结果表明,mrna丰富前复合物的PCa出席大量细胞全细胞RNA和mrna耗尽前复合物的PCa细胞表现出减少的数量。只有两个选择的10 mrna (S100A16和PRDX3)跟着我们最初的预期。这些结果说明mRNA的浓缩前复合物并不一定导致增强各自的mRNA退化。

EI24作为Etoposide-inducible基因,被选中,是因为依托泊苷最近被认为是一个组件的结合化疗治疗晚期PCa (25]。YWHAE是14-3-3蛋白调节ETV1转录因子在PCa (26]。TRFC最初显示明显诱导DU145细胞(27),CORO1C / coronin被发现诱导androgen-insensitive PCa (28)和S100A16似乎只在转移性肿瘤细胞调节(29日]。

NLK充当一个β连环蛋白通路抑制剂通过磷酸化和退化的TCF / LEF转录因子(30.]。NLK和DEDD建议诱导细胞凋亡(31日,32)和RAB1B损失被证明提高乳腺癌的攻击性(33]。减少CUL5表达式被发现,例如,在乳腺癌(34),但到目前为止没有前列腺癌。最后,PRDX3被选为之前发现调节在初级PCa (35]。对于这个基因,我们最初的假设是正确的,减少大量的前复合物的PRDX3 mRNA PCa细胞导致整个细胞信使rna含量升高。此外,3′utr DEDD和PRDX3分析作为潜在的目标microrna已知管制在PCa(见下文)。

获得额外的洞察miRNA-based调节肿瘤相关基因,我们选择基因的列表形式Ago-associated mrna的潜在监管microrna(参见补充表S2)。对于这一分析,我们选择了DEDD,肿瘤坏死因子受体超家族,成员10 b蛋白(TNFRSF10B),肿瘤蛋白质p53诱导核1 (TP53INP1),分泌蛋白、酸性,cysteine-rich (SPARC;骨粘连蛋白),阿贝尔森关联2蛋白质(ABI2)和periredoxin 3 (PRDX3)基因。

这些mrna潜在目标之前确定PCa-deregulated microrna miR-15b, miR-20a, mir - 148 a (DEDD), miR-20a和miR-21 (TNFRSF10B) miR-24,和-29 a / b (TP53INP1) miR-29a / b (SPARC) miR-15b, mir - 200 c和mir - 375 (ABI2), miR-23a (PRDX3)。潜在的结合位点的microrna 3′utr mrna分析都是描绘在图2。图3显示了负监管向记者microrna基因的影响下的监管控制响应3′utr。我们可以证明负监管mir - 148 a的影响向DEDD 3′UTR(图3(一个)),向TNFRSF10B miR-20a 3′UTR(图3 (b)),向TP53INP1 miR-24 3′UTR(图3 (c)),miR-29a和米尔-29 b向SPARC 3′UTR(图3 (d))。3′utr ABI2和PRDX3向microrna mir - 375没有响应,mir - 200 c, miR-15b miR-23a,分别,因此没有进一步分析(数据3 (e)和3 (f))。

进一步验证结果报告基因的负调控microrna的响应3′utr, microrna的预测结合位点突变,与wild-type-constructs并行分析。如图4的突变seed-sequences DEDD mir - 148 a的3′UTR(图4(一)),miR-20a TNFRSF10B 3′UTR(图4 (b)),miR-24 TP53INP1 3′UTR(图4 (c))导致失去响应建立这些mrna目标各自的microrna。在SPARC 3′UTR(图4 (d)),两个潜在的结合位点存在和他们两人可以miR-29a和miR-29b的目标。第一个结合位点的突变(nt 89 - 110)对反应没有影响,而第二个结合位点的突变(121 - 143元)或两者的结合位点miR-29a和miR-29b废除响应性。这表明,第二个结合位点在SPARC 3′UTR是microrna的目标miR-29a和miR-29b。

然后我们化验的影响过度miR-24和miR-29a / b TP53INP1和SPARC蛋白的蛋白质含量,分别。如图5(一)、TP53INP1 DU145细胞蛋白质表达下调后miR-24超表达。同样,microrna miR-29a和miR-29b SPARC蛋白水平降低(图5(b))。的决心是差别相对对这些数据所示5(c)和5(d)。TP53INP1蛋白表达下调了约40%,并减少由miR-29a SPARC miR-29b约。分别为60%和70%。接下来我们测试的效果microrna DU145细胞的生长行为。我们先前表明,这些microrna表达下调在初级PCa组织比良性的前列腺组织(11,19]。首先,我们分析了DU145细胞集落形成能力的过度后三个microrna。有趣的是,miR-24殖民地(图的数量显著增加6(一))以及殖民地的大小。相比之下,miR-29a显示没有影响,而miR-29b显著减少数量以及DU145细胞殖民地(数据的大小6(一)和6 (b))。

4所示。讨论

我们可以证明大量的mrna,我们确定为前复合物的不同代表DU145细胞已经被描述为差异表达主要PCa。尽管microrna作为指导元素RISC因素,它还不完全理解如何决定目标mRNA的命运。绑定miRISC复合物只能同样影响蛋白质的翻译没有明显改变细胞的信使rna的内容。变异存在于事实的另一个来源的一个给定的microrna不一定反映其在RISC复合物(36]。此外,拉罗卡和同事已经证明,microrna在休息时组织主要是发现在低分了体重复合物与mRNA在组织的大部分增长microrna在高分子量复合物绑定到mRNA (37]。在这里,我们用细胞增长,这种影响可能会忽视。

除了已经提到LAMA3 mRNA,高度RISC-enriched腺苷酸环化酶3 (ADCY3) mRNA是一个潜在的目标调节microrna miR-25和miR-27a / b (8,19]。相比之下,MICB的过度表达,同样高纯度mRNA在前复杂,被认为是肿瘤促进而不是抑制函数(38]。也丰富了琥珀酸脱氢酶复杂,亚基,黄素蛋白(SDHA),一个潜在的肿瘤抑制(39),没有发现差异表达在正常和PCa组织(40]。然而,在前复杂可能表明SDHA PCa蛋白质水平降低。符合这样的假设,它已被证实,SDH损失表达导致pseudohypoxia信号(41]。进一步的例子,Ago-IP丰富mrna ATM关联(ATMIN),被认为是肿瘤抑制(42),脂联素受体2 (ADIPOR2),已知的增殖抑制剂(43),都是潜在的目标调节mir - 200 - c。然而,最近的一项研究描述了很强的相关性增加ADIPOR2表达与预后不良的PCa (44]。基因的发现出现在降低水平前复杂的(表1),Thy-1细胞表面抗原(THY1) [24),趋化因子(碳碳图案配体2 (CCL2, MCP1)) (45),矩阵杯子蛋白(MGP) (46),periostin (POSTN) [47,48),分泌蛋白质,酸性,cysteine-rich (SPARC、骨粘连蛋白)49),或者组织蛋白酶K (CSTK) [50在主成分分析中发现了。

我们表明,3′utr DEDD, TNFRSF10B /小道,TP53INP1,和SPARC /骨粘连蛋白mrna mir - 148 a的目标,miR-20a, miR-24, miR-29a和miR-29b分别。在我们之前的分析中,mir - 148 a和miR-20a / b最强的诱导microrna在初级PCa与正常组织(8,19)符合DEDD丰度高、TNFRSF10B / mrna在RISC复合物(表1)。到目前为止,还没有与前列腺癌被描述DEDD协会,但减少这种蛋白质可能保护PCa细胞发生凋亡。DEDD可以减弱epithelial-mesenchymal过渡,作为内源性抑制肿瘤生长和转移的人类乳腺癌[51]。然而,过度的观察DEDD HP16/18改变了宫颈癌细胞(52]。拷贝数增加1 q23.3包括放大的DEDD移行细胞肿瘤最近描述(53)以及增加鼻咽癌DEDD表达式(54]。函数在转录激活通过DEDD NFKB除了它的角色在细胞凋亡被描述55]。DEDD在PCa的重要性从而应进一步探索。同样,我们的结果显示一个角色cullin - 5 (CUL5)在前列腺癌。CUL5 (VACM-1)位于染色体11 q22-q23 [56),一个基因组区域与杂合性丢失在乳腺癌(57),并且可能因此被认为是一个肿瘤抑制。例如,它可以抑制肿瘤抑制蛋白的降解,并出席减少水平细胞系来源于乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌行;降低水平也会降低化疗期间癌症细胞(58]。

的差别,对这些基因的肿瘤坏死因子受体超家族,成员10 b蛋白(TNFRSF10B / TRAIL)通过调节miR-20a [8,19)符合PCa细胞系的耐LNCaP, DU145或生物对小径/ TNFRSF10B-induced凋亡[59在PCa(差别)及其对这些60]。我们进一步证明SPARC /骨粘连蛋白和TP53INP1 microrna miR-29a目标/ b和miR-24,分别。所有三个microrna在PCa表达下调。符合这些观察,我们发现TP53INP1蛋白质含量的降低和SPARC /骨粘连蛋白过度后各自针对microrna在DU145细胞(图5)。SPARC /骨粘连蛋白是调节和促进PCa的恶性行为(49]。这些发现证实了已知函数的microrna miR-29a / b / c抑制的生长和侵袭性PCa (61年)和标签由miR-29b细胞生长的抑制作用。超表达TP53INP1已经观察到PCa和预测生物癌症复发62年]。有趣的是,过度的miR-24施加积极影响DU145细胞的生长行为取决于集落形成试验(图6)。miR-24及其差别有可能对这些可能的肿瘤促进效应只能与其他因素如microrna的合作。在乳房癌,过度miR-24增强扩散和转移潜力(63年]。同样,miR-24过度增加在非小细胞肺癌细胞增殖64年]。此外,miR-24目标PTEN在人舌鳞状细胞癌这也可以解释增长率的增加(65年]。相反,miR-24函数作为一个肿瘤抑制鼻咽癌(66年]。

弗洛雷斯的数据等。36)和拉罗卡et al。37]表明,mrna不同与RISC关联复杂,大多数前复合物并不与mrna在休息组织。目前的方法选择使用越来越多的细胞系,是为了避免后者的问题。与我们先前建立的microrna的表达数据,从力学上看我们可以确认四6选择基因的调控microrna在PCa管制。我们检测的数据可能是有用的小说管制mrna为我们提供一个列表的mrna高纯度前复合物或那些只在低水平。我们的实验数据,然而,并不完全支持我们最初的假设mRNA在这些复合物的存在与否影响相应的基因产物的表达。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作被授予由Wilhelm-Sander-Stiftung Bernd Wullich和弗里德里希·a .肝(批准号2007.025.01)。甘特迈斯特得到了德意志Forschungsgemeinschaft脱硫;Forschergruppe FOR2127)。弗里德里希·a .肝也支持由一个校内的格兰特(HOMFOR)。

补充材料

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