中性内肽酶，内皮素-1和核因子κB在前列腺癌中的表达：自由基前列腺切除后前列腺特异性抗原复发的相互关系和关联

摘要

客观的．研究中性内肽酶（NEP）/神经肽（NPS）轴和核因子Kappa B的影响（NFκB)作为根治性前列腺切除术(RP)后前列腺特异性抗原(PSA)复发的预测因子。患者和方法．采用RP治疗70例早期PC患者，观察肿瘤标本中NEP、ET-1和NF的表达情况κB (p65)。PSA复发时间与检查参数相关，并与术前PSA水平、Gleason评分、病理TNM (pT)分期、手术切缘(SM)评估相结合。结果和局限性．Nep的膜状表达（)，细胞质ET-1()和细胞质NFκB ()与PSA复发时间相关。NEP与ET-1相关()和NFκB (）.ET-1也与NF相关κB (）.nep表达（)，pT阶段()，以及短信息()是PSA复发时间的独立预测因子。结论．似乎有一个临床模型的NEP/NPs和NFκB通路相互连接，其成分根据其生物学作用和分子相互关系遵循相反的表达模式。

1.介绍

神经肽(NPs)是一种具有与致癌相关的有丝分裂特性的强效血管收缩肽家族。内皮素-1 (ET-1)是一个主要的代表，通过诱导前列腺癌细胞增殖始终与前列腺癌进展有关在体外,而我n体内，在抗去势PC患者的血浆和组织标本中检测到ET-1水平升高[1.–3.］．

负责切割和灭活ET-1和其他生物活性NPs的酶是中性内肽酶（NEP或CD10）。NEP是一种细胞表面肽酶，通常由各种组织表达，包括前列腺[4.,5.]，但其表达的丧失与肿瘤进展到去势抵抗相关，因为它允许NPs的生长促进作用[6.］．

核因子kappa B (NFκB） 是一种转录因子，在各种类型的肿瘤中具有促生存和抗凋亡作用。研究最多的NF形式κB是p50和RelA (p65)蛋白形成的异源二聚体。新出现的临床前证据暗示了NFκB在PC细胞的生长、存活、血管生成和转移进展中的作用[7.,8.］．NF的构成性激活κB已在抗去势PC异种移植物和PC组织中检测到[9］．

由于PC临床应用的预后生物标志物候选名单不断增加，并且NEP/NPs和NF发挥着核心作用κB通路在PC进展中，来自根治性前列腺切除术(RP)标本免疫组化研究的大体数据已经积累。然而，存在相互矛盾的结果，以及在同一研究中缺乏对这两种途径的综合调查，仍然阻碍了对数据的正确解释，以改进已经存在的疾病预后模型。

2.患者和方法

2．1．病人的选择

该研究纳入了18岁以上新诊断的早期前列腺癌患者，他们在拉里萨大学医院泌尿科住院。所有患者均接受开放性耻骨后根治性前列腺切除术。患者接受激素治疗（化疗和放疗）手术时天真。未报告既往生殖或内分泌疾病史。本研究由我们机构的内部审查委员会批准，所有患者在进入研究前均提供书面知情同意书。

记录患者人口统计学（年龄）和临床病理参数，包括术前PSA水平、原发肿瘤pT分期和Gleason评分、淋巴结状态、SMs、PSA复发和生存数据。

70例患者的苏木精和伊红染色组织切片 RP标本由一名单盲组织病理学家根据充分随访和代表性病理标本的可用性进行检查。根治性前列腺切除标本采用全套技术处理。组织病理学特征的评估是根据2004年世界卫生组织（WHO）主办的前列腺癌会议患者预后预测国际磋商的建议进行的[10.]例分为2组：低剂量组(≤3 + 4;)及高(≥4 + 3;)，根据目前文献建立的3组组织病理学标准(低、中、高)，Gleason评分(2、3、4)样本均较低。病例也根据pT分期分为器官局限性疾病(;）或晚期肿瘤延伸超过前列腺囊泡（;）.pT3组11例为pT3a期，16例为pT3b期;然而，由于患者数量较少，没有进行额外的亚组分析。术前PSA分为<10 ng/mL和≥10 ng/mL 2个亚组。大部分患者术前PSA水平<10 ng/mL ()，但他们也表现出负SM()淋巴结状况()。由于缺少大量患者的相关信息，我们的大多数统计分析中未包括后者(患者的临床和病理特征如表所示1.．

2.2。免疫组织化学（IHC）程序

RP标本固定在10%缓冲福尔马林溶液中，并包埋在石蜡块中。串行部分(4μM)从每个病例中选择1或2个石蜡块。根据苏木精和伊红切片确定的前列腺癌的原发性和继发性结构Gleason模式选择组织块。切片在二甲苯中脱蜡，并通过减少酒精进行再水化n为NF解密κB是通过在a 6中处理切片实现的 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6），共20 在850瓦的微波炉中加热1分钟。通过在Trilogy试剂（Cell Marque，Rocklin，CA）中煮沸切片，在商用蒸汽机中共煮沸1小时，实现NEP和ET-1的抗原揭开。在用3%过氧化氢溶液淬火内源性过氧化物酶10小时后 将载玻片在室温下与以下主要小鼠单克隆抗体孵育30分钟：抗NF的p65亚单位κB(克隆F-6, 1: 500稀释，Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA)和anti-NEP(克隆56C6, 1: 30稀释，DAKO，丹麦)。相邻切片用抗ET-1的小鼠单克隆抗体(克隆TRET-485, 1:10 0稀释，SIGMA, UK)在4°C下孵育过夜。底物显色剂溶液(EnVision, DAKO, Glostrup, Denmark)和二氨基联苯胺染色10分钟。Harris苏木精复染1分钟，脱水，DPX溶液裱片。

2．3.免疫组化染色评估

根据先前研究的评估进行IHC染色的评估。法国试验标准κB免疫染色为细胞质。NEP免疫染色为膜质和顶端细胞质。ET-1免疫染色为细胞质。使用0到3分（0：无染色1：弱染色，2：中度染色，3：强染色）与背景进行比较，评估所有3个检查参数的免疫染色强度[9,11.,12.］．NF的统计分析考虑弱、中度染色(0-2)和强染色(3)κB和ET-1，分别为低表达和高表达[9,12.].NEP高表达定义为2分或以上（2-3分），低表达定义为2分以下（0-1分）[11.］．

评估弱ET-1染色类别小于内皮细胞的弱，测定中等ET-1染色类别等于内皮细胞的弱，并且肌剧ET-1染色类别表现出比内皮更多样的细胞。正常相邻的前列腺腺体用作内部对照标记，用于评估NEP和NFκB的表达。免疫组化反应是腺性的所有测试参数(NEP, ET-1，和NFκB)。

2.4.研究终点

我们的目标是调查Nep，ET-1和NF的IHC表达的可能的相互关系B，以及它们与术前PSA水平、Gleason评分、pT分期、SMs的潜在相关性。我们进一步研究了这些参数与PSA失效时间相关的预测预后作用。反应变量，PSA复发时间，定义为从RP到首次检测(非零)PSA测量>0.2 ng/mL的时间。

2．5．统计分析

费舍尔酒店测试被用来探索NEP, ET-1, NF之间的联系κB表达与Gleason评分、肿瘤分期、SM状态。采用Pearson相关系数测定NEP、ET-1、NF之间的相关性κB表达和术前PSA水平。KAPLAN-MEIER方法用于确定每种分类变量对无复发存活率的影响，并且使用日志秩检验来比较每个变量内的PSA复发存活差异。对于单变量和多变量水平的PSA复发存活分析，COX比例危害模型用于估计95％置信区间（CI）的危害比（HR）。通过使用双尾确定统计显着性值和被报告在的水平。使用SPSS (SPSS for Windows, version 15.0, SPSS, Chicago, IL)进行统计分析。

3.结果

38名（54%）患者在随访期间出现PSA复发，32名（46%）患者没有PSA复发。2名（2.8%）患者已过期。根据反向Kaplan-Meier法计算，估计的中位随访时间为30个月（范围12-86），而PSA复发的中位时间为56个月（范围1-74）在复发患者中，22例接受雄激素联合阻断（CAB），1例接受局部放疗，9例接受CAB联合放疗（5例按顺序，4例同时）。

3.1.NEP与PSA复发的等级、阶段和时间有关

根据NEP表达水平，将患者分为低表达组(，51.4%）和另一个高NEP IHC表达(在单变量分析中，我们观察到NEP与Gleason评分显著相关，因为大多数高NEP表达的肿瘤（30/34或88.2%）与低Gleason评分相关(）.NEP和pT分期之间的关系也类似，25/34或大约73.5%的高NEP表达肿瘤与低pT分期相关()(表2.）.

NEP的表达与PSA复发时间相关(), ()(表2.图形1.）.NEP和术前PSA水平之间没有统计学上的显着相关性（)或者NEP和SMs()(表2.）.

3．2.ET-1与PSA复发的分级、分期和时间有关

ET-1表达平分为两组，一组为低(，48.6%）或偏高(, 51.4%)免疫反应性。ET-1表达升高与较晚期的疾病相关，这在pT期和pT期均得到证实(）和Gleason得分（)在单变量分析中（表1）2.)ET-1也被发现是生化进展的指标，因为其表达与从RP到PSA复发的较小时间间隔相关(), ()(表2.图形2.).ET-1与术前PSA水平之间无统计学显著相关性()或ET-1及短信()(表2.）.

3．3.法国试验标准κB表达与PSA复发的分级、分期和时间相关

法国试验标准κ在60%的患者中发现B染色较低()而在40%的队列中高().与NF有关联κ两阶段的B表达式()和等级()在单变量分析中（表1）2.）.高NFκB表达也被发现与PSA复发时间缩短显著相关(), ()(表2.图形3.).NF之间没有统计学上的显著相关性κB和术前PSA水平()或NFκB和短信()(表2.）.

3.4.NEP表达与ET-1和NF相关κB表达式

在单变量分析中，NEP和ET-1的IHC表达之间存在显著相关性(）.NEP-NF的情况也是如此κB关系()(表3.).ET-1和NFκB的表达也相互关联(）.NEP、ET-1和NF的免疫组化表达模式κB如图所示4.,5.和6.．

3．5．其他单变量的相关性

pT阶段()、格里森分数()，以及SM状态()与PSA无复发生存期相关(表1.).年龄之间没有统计学上的显著相关性()，术前PSA()或淋巴结状态()和PSA复发时间（表1）1.)术前PSA水平与pT分期相关()，但没有格里森分数().阶段和等级是相互关联的(）.

3.6。NEP，PT阶段和SMS是PSA复发时间的独立预测因素

在多变量分析中，在控制术前PSA，肿瘤阶段，GLEASES评分，SMS，NF后，NEP表达和PSA复发时间有显着关联。κB、ET-1 (；95%[CI]=0.228[0.068–0.766]）pT级(；95%[CI]=3.025[1.257–7.277]和SM状态(；95%[CI]=2.061[1.049–4.051]）也保留了其作为PSA复发时间预测因子的显著性（表4.）.

4.讨论

在这项研究中，我们同时检测了两个系统的主要成分的表达，这两个系统分别与PC进展、NEP/NPs和NF相关κB通路。

我们已经证实了先前报道的内皮素轴成分表达与分期、分级之间的相关性[11.,13.,14.］．我们也观察到et -1表达与PSA复发时间的相关性，这与Rosenblatt等人的结果一致[12.]who证明ET-1免疫反应性（IRp）的强度及其强度和程度的组合产物但在对287例RP PC标本的大规模研究中，仅染色程度不能预测生化复发。ET-1染色强的患者的无复发生存期短于表达弱的患者[12.］．

此外，我们还观察到，被检查肿瘤的侵袭性（如分级和晚期的增加所证明）与膜性NEP的丢失相一致，证明了后者在NEP底物诱导的致癌信号减弱中的生物学作用。因此，NEP与PSA复发。

早期PC中NEP表达的预后相关性是关于临床病理参数的局部化和表达模式差异的研究与临床病理学参数的差异之间的争论的争论领域，包括无临床病理参数。与正常前列腺和前列腺上皮瘤（PIN）相比，在219例PC患者的219例前列腺切除术标本中观察到NEP的表达损失或降低，尽管NEP表达与临床参数（GLEASEN得分和病理阶段）或结果（生化复发）没有相关性（生物化学复发）的相关性在这些系列中观察到[15.］．在另一组223名患者中，膜性NEP表达的缺失与PSA复发时间的缩短显著相关[16.］．相比之下，在87名患者的队列中，高NEP表达与较高的PSA复发相关[17.]其中34名患者淋巴结阳性，未纳入复发分析。最广泛的研究NEP作为PC预测因子的系列报告在14年的时间内对2385名在单一机构接受RP治疗的患者进行了研究[18.］．在这些系列中，作者观察到从膜 - 细胞质上的膜上的无复发的存活率下降到专门的细胞质NEP表达[18.］．然而，NEP阴性的预后最好，这一发现与几个临床前模型的结果相反[6.,19.，包括我们的[20.]这也与奥斯曼等人的研究结果不一致[16.]，同一系列的其他结果预测NEP无功能定位的预后更差，以及我们目前的研究结果。我们可以假设，促进NEP启动子甲基化和NEP表达缺失的机制也抑制促癌基因的表达，净效应为预后改善。或者，至少部分样本在组织处理过程中细胞外NEP丢失的伪影仍然存在。重要的是，在他们的研究中没有考虑染色强度进行分析。

我们关于NF临床有用性的发现κB证实了以前指示NF之间关联的数据κB表达和等级[21,22]，结合Gleason评分和核NF对预后预测有显著改善κB染色[23］．法国试验标准κB也被报道为SMs阳性组中复发的独立预后指标[24]，或淋巴结侵犯[25］．在亚细胞NF上强调了一些报告κB区隔化，关于两种细胞质[26]，或核免疫反应性[27[PSA失败。一般来说，尽管研究之间的本地化存在差异，但高NFκB与预后差相关。

尽管NEP、ET-1和NF表达之间存在潜在的相互关系，但到目前为止仍有一个问题被低估了κB在PC早期。在这项研究中，我们在临床水平上共同检测了这三个参数，证明NEP表达与ET-1和NF相关κB表达，大多数高NEP表达细胞表现出较低的ET-1和NFκB表达水平相反。

多因素分析包括术前PSA、肿瘤分期、分级、SMs、ET-1和NFκB表达，仅pT分期，SMs和NEP在预测RP后PSA复发方面具有重要意义。事实上，与膜性NEP高表达的男性相比，低表达NEP的患者PSA复发的风险大约高4.386倍。此外，该风险高于pT晚期(3.025倍)和SM阳性(2.061倍)。这些数据证实，在激素naïve PC患者中，NEP表达与PSA复发之间有很强的相关性，并且在现有的预测PC复发的预后工具中整合NEP是非常合理的。有趣的是，显著的NEP、ET-1和NF的出现κB相互关系（表1）3.)说明了两种可能存在密切联系的途径的临床相关性。我们的结果表明，就RP后PSA复发时间而言，激素幼稚PC存在两种临床病理模式。第一种模式的特点是NEP高表达，ET-1和NF低κ与第二种方法相比，第二种方法涉及NEP表达减弱，同时ET-1和NF升高，预测PSA无复发生存期延长κB水平，其特征是PSA无复发生存期缩短。

事实上，在分子水平上，NEP/NPs和NF之间似乎存在功能联系κB途径κB被认为是NPs抗凋亡作用的介质，因为NPs启动的促生存信号涉及激活激酶PI3K和Akt，然后激活NFκ通过磷酸化其抑制剂IκB[28,29］．在最近的一次在体外工作，我们揭示了NEP / NPS和NF的逆基线表达式模式κ雄激素依赖性和雄激素非依赖性PC细胞中的B/蛋白酶体途径[20.］．此外，我们观察到NPS能够诱发NFκB核易位和DNA结合，这一事件在显示低NEP水平的雄激素非依赖性细胞系中更为明显。这些事件被NP抑制剂逆转（Patrickidou等人，未发表的数据）。目前的研究是第一次在临床水平上将NEP表达与et-1和NF联系起来κB的表达。这些结果补充了在体外关于PC细胞系的数据。

然而，应考虑本研究的一些局限性。应承认，本研究中包括的少数患者不允许得出明确的结论。此外，最低Gleason分数（2、3和4）虽然可能假设NEP、ET-1和NF表达之间的差异κB可能更明显，基于疾病早期的潜在生物学。SMs的评价，尽管定义明确，但可能会由于压碎、热和电灼伪象的存在而被误解[30.或与局部晚期疾病临床相关性较低[31］．我们前瞻性收集的数据的回顾性分析和患者相对较短的中位随访也可能对我们的结果产生偏差。此外，NEP、ET-1和NF的预后价值κ如果将其与经验证的列线图的预测结果进行比较，则可能更好地确定B。最后，我们的研究并不打算包括当前的预后标志物，如精囊受累、肿瘤标志物倍性状态和增殖指数。

总之，我们的研究旨在提供NEP/内皮素和NF作用的综合方法κB通路在PC患者临床过程中的作用。复发(考虑到人群的异质性)、肿瘤的分期和分级以及预后之间的关系是一项探索性的(产生假设的)分析，本研究的主要目的是证明NEP/ET-1和NF之间的关系κB信令。虽然需要进一步的潜在评估来证实这种互动，但基于NEP / NPS和NF的像差的PC演化强的临床前模型κB通路似乎在临床环境中发挥作用。最重要的是，我们认为这两个系统之间存在着重要的相互关系，如果在一个大型前瞻性队列中得到证实，可能不仅鼓励将他们的病理评估纳入到当前的预测因素模型中，而且还鼓励他们同时进行药理抑制的概念，以使具有侵袭性生物学的肿瘤获得更大的治疗效益。

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