文摘

糖尿病(DM)与线粒体功能障碍和氧化应激可以导致糖尿病心肌病(DCM),可经常保持未被发现,直到疾病晚期。然而,心肌损伤发生在可测量的心脏功能障碍的发病之前,尽管其分子关联知之甚少。在这项研究中,我们做了一个DM大鼠高脂饮食引起的结合低和高剂量链脲霉素(STZ)模仿前和扩张型心肌病早期。RNA-sequencing心室组织的分析揭示了微分转录组剖面和异常激活通路参与脂肪酸代谢,氧化磷酸化,心脏结构和功能、胰岛素抵抗、钙信号、细胞凋亡和肿瘤坏死因子的信号。此外,使用高glucose-treated人类诱导多能干细胞心肌细胞(iPSC-CM),我们重现了心脏细胞表型的DM和识别几个分子可能促进扩张型心肌病的发展的关联。总之,我们已经开发出一个实验框架底层扩张型心肌病的发展目标的途径。

1。介绍

糖尿病(DM)是一种代谢紊乱,导致慢性心血管系统的损伤,肾脏、周围神经系统和视网膜1]。越来越多的证据表明DM(尤其是2型糖尿病患者,2型糖尿病)不利影响患者长期生存(2]。尤其是2型糖尿病与心血管疾病死亡的风险更高(3)是糖尿病心肌病(DCM)耦合,这是独立于高血压、冠心病、心脏瓣膜病(4]。DCM通常无临床症状通常可以保持未被发现,直到疾病晚期,尽管心脏功能异常显然是在疾病的早期阶段。

线粒体的大部分能源供应至关重要的心跳和控制基本细胞功能,包括Ca2 +信号稳态、ROS生成和凋亡细胞死亡调节(5]。在2型糖尿病,基础科学和临床研究表明,心脏损伤发生的结果提供葡萄糖和脂类代谢,从而导致氧化应激增加,多个信号通路的激活导致心肌损伤(6]。高浓度的活性氧(ROS)解开线粒体电子传递链(等),从而减少线粒体ATP生产。这最终触发线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物)开放和心肌细胞死亡7]。虽然心脏性能指标可用于评估亚临床心脏异常,心肌损伤发生早,发病前可衡量的心脏功能障碍。糖尿病状态的程度可能赋予心肌损伤的风险尚不清楚。

本研究旨在描述与心脏异常相关联的潜在分子相关的DM大鼠模型。我们使用全转录组分析总RNA测序(RNA-Seq)捕获的影响基因表达的变化由糖尿病引起的。这些目标是否可以重现测试在一个心脏DM的模拟模型,我们使用高glucose-treated人类诱导多能干细胞——(hiPSC)派生的心肌细胞,探索潜在的治疗目标基因可能促进扩张型心肌病的发展。

2。材料和方法

2.1。大鼠糖尿病模型试验
2.1.1。动物的准备

男性Sprague-Dawley老鼠(250 - 300 g)被随机分为3组:对照组(案子, ),低剂量组(低, ),和高剂量组(高, )。对照组与正常食物饮食喂养含有12%的脂肪,碳水化合物,66%和22%的蛋白质,和其他两组与高脂饮食喂养含有60%的脂肪,碳水化合物,5%和34%的蛋白质,根据协议Mansor et al。8]。2周后,低和高组收到一个STZ腹腔内注射(σ,低:35毫克/公斤;高:50毫克/公斤)9]。空腹血糖水平测试一周一次。所有实验在美国国立卫生研究院的指导方针的使用实验动物,经中国科学院大学动物保健。

注射STZ 9周后,大鼠禁食过夜和血糖,胰岛素,甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白),乳酸脱氢酶(LDH)、游离脂肪酸(FFA)测量。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)如前所述执行(8]。内稳态模型评估胰岛素抵抗(HOMA-IR)计算估计( (10]。心脏重量指数被用来评估肥厚性反应,计算的 如前所述(11]。

2.1.2。实时rt - pcr

心从每组孤立,和总信使rna提取试剂盒试剂(美国表达载体)。PrimeScript RT主组合工具包(豆类Biotechnoly(大连)有限公司,中国)被用来进行反转录,然后快速SYBR绿色主人混合(美国应用生物系统公司)是用于执行实时RT - pcr(美国应用生物系统公司)。rt - pcr进行总量的20倍μl反应混合物根据生产的协议。放大进行了如下:95°C 3分钟,40 95°C的周期15年代和60°C 45 s。引物用于补充表中列出1。基因表达是规范化GAPDH作为内部控制。褶皱的变化使用2基因表达测定- - - - - -ΔΔCT方法。

2.1.3。RNA-Seq和生物信息学

RNA-Seq是基于以前的老鼠研究[12,13]。这里,总RNA提取新鲜分离大鼠左心室组织(4样品每组)通过使用从试剂盒RNeasy工具(试剂盒、希尔登,德国)DNase我治疗使用根据制造商的协议。RNA质量和浓度进行了测试与生物分析仪2100(美国安捷伦,CA)。所有样品满足标准的RNA的完整性 和 。测序图书馆建于北京基因组研究所(中国,北京)使用修改后的协议类似于TrueSeq困总RNA RiboZero设备(Illumina公司Inc .)。RNA序列进行bgiseq - 500平台。

SOAPnuke (v1.5.2)是用于过滤读取并生成FASTQ格式。清洁读取被对齐参考使用Bowtie2老鼠基因组(v2.2.5)使用默认参数和计算基因表达水平与RSEM (v1.2.12)。差异表达基因(度)与两倍多褶皱的变化,确定和纠正 值小于或等于0.05。基因本体论(去)分析和路径分析,度是根据官方分类与分类去京都百科全书(KEGG)基因和基因组注释结果,和Phyper (R的函数)进行去通路功能的浓缩。错误发现率(罗斯福)计算 价值与 定义为明显富集。蛋白质相互作用结果从数据库字符串(v11.5)默认设置。Cytoscape软件(v3.8.2)应用于可视化蛋白质相互作用关系网络和基因分析中心。

2.1.4。组织学分析

Hematoxylin-eosin(他)染色和马森的三色的染色进行了如前所述[14,15]。短暂,切除心脏组织嵌入石蜡,切成5μ米厚的串行部分,然后沾他或马森的三色的。马森的三色的是用于分析在心肌胶原分数与心肌细胞染成红色和蓝色胶原纤维染色。总面积的百分比由胶原蛋白进行了分析与Image-Pro +软件6.0版本,计算如下: 。

2.1.5节讨论。她染色

Dihydroethidine(她)染色法用于测量细胞内ROS根据氧化荧光微貌,最近描述(16]。冻左心室心脏部分老鼠沾10μmol / L她在黑暗和湿润室30分钟37°C。遗漏的她被用作消极的控制。共焦显微镜下她染色是可视化(奥林巴斯阵线1000,日本东京)和图像分析与Image-Pro +软件6.0版。每个部分的平均荧光强度计算,和总节发射信号平均每个字段是数据分析。

2.1.6。Caspase-3表达式

Caspase-3表达式在心里衡量心脏通过免疫荧光染色。短暂的,孤立的心脏组织嵌入在石蜡,切成5μ米厚的串行部分。脱水后,燥热引起抗原检索是由沸腾柠檬酸缓冲部分,pH值6.0,微波炉。阻断内源性过氧化物酶活动,部分被孵化的溶液3% H2O2在室温下为20分钟。然后,caspase-3抗体(1:200;Tocris生物科学)孵化一夜之间在4°C,其次是与相应的荧光检测二次抗体(圣克鲁斯生物技术,CA) 1 h在37°C。核与DAPI复染色。样品被共焦显微镜检查(奥林巴斯阵线1000)。

2.1.7。TUNEL分析

终端deoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP尼克末端标记(TUNEL绿色)进行了分析使用一个原位检测心肌细胞凋亡细胞死亡检测设备(德国罗氏公司)根据制造商的指示。细胞凋亡指数被表示为TUNEL阳性的比例核核的总数(DAPI,蓝色)的百分比。

2.1.8。光学映射的体外心脏准备

老鼠安乐死(异氟烷;1毫升/公斤)和肝素化(120 IU)。心被切除,逆行灌注通过主动脉与KH的解决方案(119年更易/ L:氯化钠,氯化钾,1.8 CaCl21 MgCl21.2不2阿宝425 NaHCO3,10葡萄糖;95% O2/5%有限公司2)在10毫升/分钟和37°C。染料加载与普朗尼克F127(20%被preperfusion输血 在DMSO)。Rhod2-AM灌注(1毫克/毫升)25分钟37°C执行Ca2 +测量。心被照亮 领导(MappingLab)。荧光光带通滤波(波长511 - 551纳米)减少流浪激发光到达染料。发射的荧光信号被过滤590纳米带通滤波器(带宽35海里),然后由CMOS摄像机成像(oms -作为pcie - 2002, MappingLab)。数字图像( 像素)都聚集在0.8 kHz的采样率 的视野。

光学映射数据分析使用商用软件(OMapScope5.7.8 MappingLab)。光信号在空间排列和加工使用高斯空间滤波器( 像素)。本地激活时间分配是基于最大起飞的速度Vm的一击。高峰时间被定义为从启动Ca的时间2 +荧光峰值。CTD90计算。

2.2。人类诱导多能干细胞心肌细胞实验
2.2.1。hiPSC-CM分化和成熟

健康hiPSC证监会- 854行和OX1-19培养在Matrigel-coated mTeSR介质板和分离使用ReLeSR confluency在90 - 100%。3通道后,细胞被转移到Matrigel-coated 12孔板分化。hiPSC-CM分化是根据以前的报告中描述的过程(17]。总之,细胞培养,细胞融合,然后扩大到90%治疗2天6μmol / L CHIR99201在分化培养基(RPMI中补充1% B-27补充-胰岛素)。3天,细胞治疗2.5更易/ L Wnt-C59抑制Wnt信号通路。净化介质应用11和13天通过改变介质的no-glucose RPMI B27 -胰岛素和5 1%更易与L乳酸钠。hiPSC-CM成熟开始从每天16到20成熟培养基(毫米):包含5更易DMEM / L葡萄糖补充0.4更易与BSA / L油酸共轭,50 nmol / L胰岛素,10%胎牛血清不活跃,1%的谷氨酰胺,1% penicillin-streptomycin (P / S)。实现高葡萄糖环境,hiPSC-CM接受5.5,11日和25 L更易与葡萄糖2天。

2.2.2。细胞面积及核面积测量

细胞大小和核大小测量使用ImageJ (v1.53n,国家卫生研究院、美国)。fluorodish iPSCs-CMs分离和山肩,在成熟培养基培养2天,孵化和5.5,11日和25更易与L葡萄糖48小时。细胞被固定为4%甲醛、卫permeabilized 0.1%,阻止了驴6%血清,然后沾抗体细胞骨架蛋白(ab45932)和临床α辅肌动蛋白(sigmaA7811)和赫斯特的细胞核。免疫荧光图像相同的规模被使用徕卡共焦显微镜(徕卡TCS SP5) 60×油浸的目标,然后加载在ImageJ面积测量。对于每一个图像,所有细胞都是手动的徒手选择工具选择ImageJ测量细胞的大小、细胞核被自动选择阈值图像通道的细胞核。

2.2.3。葡萄糖的吸收

hiPSC-CMs被播种在96孔板( 细胞/好),然后,细胞治疗5.5,11日或25更易与葡萄糖/ L 2天。葡萄糖吸收2-deoxyglucose (2 dg)测定在hiPSC-CMs使用葡萄糖吸收如果留意TM试验设备(Promega J1342),发光强度(相对光单元,RLU)测量根据制造商的指示。

2.2.4。生产活性氧(ROS)

hiPSC-CMs被播种在96孔板( 细胞/)和处理5.5,11日或25更易与葡萄糖/ L 2天。ROS在生活hiPSC-CMs定量评估使用细胞ROS分析工具包(ab113851 Abcam)根据制造商的指示。

2.2.5。ATP测定细胞的生存能力

细胞内ATP的含量与细胞生存能力取决于CellTiter-Glo 2.0细胞生存能力分析(美国Promega G9242)根据制造商的协议。hiPSC-CMs被播种在96孔板( 细胞/),孵化与5.5,11日或25 L更易与葡萄糖2天。

2.2.6款。细胞内自由钙离子浓度测量

细胞内自由钙离子浓度(Ca2 +]我)使用Fura-2-acetoxymethyl酯(Fura-2 / AM)执行与轻微的修改(如前所述18]。简单地说,培养hiPSC-CMs孵化在5μmol / L Fura-2 / AM为30分钟37°C。加载hiPSC-CMs QICLICK数字CCD相机成像(光度)连接到一个OptoLED荧光成像系统安置在一个反向尼康显微镜配备40×油浸的目标。唤起(Ca2 +]我瞬态是由30秒的暴露评估1赫兹场刺激或FCCP (carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone 3μmol / L)。荧光强度的比值(R)排放在510 nm时而兴奋的在340年和380年获得的纳米在每个时间间隔是用来估计细胞内自由钙的变化2 +浓度。

2.2.7。检测线粒体钙

衡量线粒体钙2 +([Ca2 +]米),hiPSC-CMs装满5μ摩尔/ LRhod-2 / AM 25分钟37°C。Rhod-2净正电荷,促进优惠封存在线粒体potential-driven吸收。FCCP-induced(Ca2 +]米发布评估Rhod-2 / AM荧光强度的下降。

2.2.8。线粒体膜电位测量

线粒体膜电位(MMP)变化是评估hiPSC-CMs使用亲脂性的阳离子探针5、5 ,6、6 - - - - - -tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -tetraethylbenzimidazol-carbocyanine碘(JC-1 thermofisher T3168)后,制造商的协议。hiPSC-CMs养殖的密度 细胞/ FluoroDish 2天,然后接受5.5,11日或25 L更易与葡萄糖延长2天。细胞培养与2μmol / L JC-1染料为30分钟37°C。绿色和红色荧光测量使用Airyscan共焦显微镜(蔡司880)。红色比绿色荧光强度是使用ImageJ量化。

2.3。统计分析

统计分析使用棱镜版本9软件(GraphPad软件,拉霍亚,CA)。未配对 - - - - - -测试或单向方差分析是用于确定控制和两治疗组之间的差别。给出的值 。设定在统计上的显著差异 。

3所示。结果

3.1。评估心脏参数和葡萄糖在实验处理组

9周STZ治疗后,心率没有组间差异(图1(一))。从高STZ组大鼠表现出显著的更高的血清葡萄糖,胰岛素,HOMA-IR, TC, TG、FFA与控制。此外,葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR TG、FFA和高STZ组表现出显著差异相对于低组、和血糖水平低STZ增强控制(数据相比1 (b)- - - - - -1 (f)和1(我))。此外,低密度和LDH水平没有组间差异(数字1 (g)和1 (h))。所有的老鼠收到OGTT。图1 (j)口服葡萄糖后显示血清葡萄糖浓度在这些动物的挑战。很明显,血清中葡萄糖浓度对口服葡萄糖低和高STZ组为高,这表明,成功建立糖尿病模型。

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图1
实验组大鼠在不同的基本参数。(一)人力资源的三组。血清水平的GLU (b)、胰岛素(c), TC (e)、TG (f)、低密度脂蛋白(g)、LDH (h)和FFA (i)三组。(d)评估胰岛素抵抗的三组。(j)是指血浆葡萄糖浓度在口服葡萄糖的挑战。数据表示为 。 , , , 。(j): , ,高STZ治疗组与控制;# , # # , # # # ,低STZ组与控制;组合 ,低STZ与高STZ组治疗。反对:对照组;低:低STZ组;高:STZ组;人力资源:心率;GLU:葡萄糖;TC:总胆固醇;TG:甘油三酸酯;密度:低密度脂蛋白胆固醇;LDH:乳酸脱氢酶; FFA: free fatty acid. 每组。
3.2。心脏重塑在不同实验小组

确定的程度在糖尿病大鼠心脏重塑,心脏重量指数及心肌胶原沉积测量。如图2(一个)、心脏重量是体重和归一化控制和低STZ组之间没有差别,而在高STZ组心脏重量指数显著提高相对于控制。ANP、BNP基因表达增加了观察存在STZ组相比,控件(数字2 (b)和2 (c))。他染色(图2 (d))显示一个大约正常心肌细胞的微观结构控制。高STZ组心肌细胞间质水肿和淋巴细胞浸润(标有红色箭头)。这些异常结构不太频繁的低STZ组。马森的三色的染色表明,间质胶原沉积显著增加在高组与对照组相比,但低STZ组不显示心肌胶原沉积增加(数据2 (e)和2 (f))。

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图2
心脏重塑在不同实验小组。(一)心脏体重正常体重。中存在的检验ANP(b)和法国巴黎(c) mRNA表达心肌组织。代表他染色的图片(d),箭头表示淋巴细胞浸润;比例尺,12.5μ米)和马森的三色的染色(心肌细胞(e):红色;蓝色,胶原纤维;规模的酒吧,50μ米)。(f)的定量分析胶原蛋白表达的阳性染色(结果从每组3 - 4图像)。 , 。反对:对照组;低:低STZ组;高:STZ组;HW:心脏重量;BW:体重。
3.3。在DM大鼠RNA-Seq转录组分析显示一个微分

先前的研究已经发现多种细胞内途径参与糖尿病心肌病的发病机制(19),但DM的分子信号潜在的心脏损伤仍然是难以捉摸的,尤其是在糖尿病状态不同。进一步探讨糖尿病损伤的发展背后的分子机制,我们进行全基因组RNA-Seq通过比较控制,低和高STZ大鼠治疗。我们发现116个基因的37246个基因(87调节和29个表达下调)总额控制与低STZ差异表达;253个基因(91调节和162下调)在低和高STZ差异表达;1189个基因(582调节,607下调)在控制与高(数据差异表达3(一个)和3 (b))。其中,有两个常见的差异表达基因(度)3组比较:Hist2h2aa22,集群组蛋白H2A家人A2,核小体的核心组件,使蛋白质heterodimerization活动;Decr1是一种参与脂肪酸的酶β多不饱和脂肪酸的氧化和新陈代谢enoyl-CoA酯3。这两个常见基因可以候选人被进一步分析和验证诊断标记来追踪糖尿病心肌病(图的过程4 (b))。根据Log2-fold变化之间的控制和高STZ组,前50名的调节和50个表达下调基因选择,这些基因的和干净的读值显示为一个热图(图3组3 (c)),展示了3组之间的差异基因表达模式。

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图3
RNA-Seq(度)的差异表达基因分析显示左心室从控制,低,高剂量的streptozotocin-injected高脂肪食物的老鼠。(a)条形图显示的数量和表达下调度在大比反对欺诈与高与低,低和高的比较。(b)维恩图解显示单独的和重叠的表达度控制,低,高组相互比较。每个圆圈都代表一组基因集,和叠加的区域不同的圆圈表示这些基因集的交集。(c)排名前50的热图表达调节和表达下调50度,从反对选择与高,和这些基因的读值显示3组。(d)的10个最重要的是( )丰富生物过程分支中去条款在三组比较。反对:对照组;低:低STZ治疗组;高:STZ组治疗。
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图4
(a)基因(PPI)蛋白质间交互作用的分析中心网络通路的候选人。节点包围在粉红色,红色,蓝色,黄色,绿色,棕色表明重要的基因通路参与氧化磷酸化,心肌收缩,钙信号,脂肪酸代谢、胰岛素抵抗、细胞凋亡和肿瘤坏死因子通路分别。(b)的验证关键基因的老鼠在心室组织控制,低和高STZ治疗组使用rt - pcr。 , , 。相比之下,控制。 每组。

基于GO浓缩,十大方面生物过程中富集度根据基因数呈现在图3 (d)。分析表明,基因丰富”脂肪酸机会,”“脂肪酸代谢,”“脂质代谢过程,”和“骨骼肌细胞分化”反对与低;“蛋白质折叠”、“负调控转录的RNA聚合酶II”,“负凋亡过程的监管,”和“细胞反应氧含量”通过比较低和高STZ;和“线粒体呼吸链复杂我大会”,“氧化还原过程,”“脂肪酸代谢过程,”和“脂肪酸机会”从控制与STZ高。根据KEGG途径分类,我们也选择脂肪酸代谢相关的关键基因,氧化磷酸化,心脏结构和功能相关,胰岛素抵抗,钙信号,细胞凋亡,肿瘤坏死因子通路(图1)是控制和高STZ组之间显著的改变。也有相应的低STZ组的趋势。这些结果表明微分表达的转录组剖面的不同阶段糖尿病心肌病。

失调在蛋白质子网可能产生不正常的多个子网。我们执行(PPI)蛋白质间交互作用的分析来识别感兴趣的基因的功能子网KEGG通路使用基于网络的可视化资源字符串。节点包围在粉红色,红色,蓝色,黄色,绿色,棕色表明重要的基因通路参与氧化磷酸化,心肌收缩,钙信号,脂肪酸代谢、胰岛素抵抗、细胞凋亡和肿瘤坏死因子通路(图4(一))。所有基因在这个网络聚类系数量化和排名的测量与cytoscape软件,在前20名的节点被确定为中心基因(在更大的图标表示)和列在表的补充2。

验证所确定的基因控制和STZ大鼠治疗,心肌组织提取测量mRNA水平。两个常见的度比较3组(Hist2h2aa2和Decr1)和7中心基因从上市补充表2(Ndufv2,Ndufa5,Cox7c,Calm2,Ddit3,Scp2,Prkag1基于日志2FC和 值在RNA-Seq分析)。只有Decr1,Calm2,Ddit3表达了统计学意义,与对照组比较(图4 (b))。

3.4。测量心肌氧化应激和细胞凋亡在不同实验小组

基于RNA-Seq的结果,我们证实氧化应激和细胞凋亡是否改变在不同阶段的扩张型心肌病大鼠模型。活性氧积累已知发挥重要作用在糖尿病并发症包括糖尿病心血管疾病。她染色显示左心室趋势向上的活性氧产量低和高STZ组和显著提高在低和高STZ治疗组(图5(一个))。

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图5
心脏氧化应激和细胞凋亡在不同实验小组。(一)代表她对心肌组织染色的图片(红、她;蓝色,DAPI)和平均荧光强度进行了综述。(b)代表的图像为凋亡细胞免疫荧光(红、caspase-3;蓝色,DAPI)。凋亡指数量化Image-Pro +软件。(c)代表的图像为凋亡细胞免疫荧光(绿色,TUNEL;蓝色,DAPI)。凋亡指数量化Image-Pro +软件。结果从每组3 - 4图像。 Data are expressed as 。 , , 。反对:对照组;低:低STZ治疗组;高:STZ组治疗。比例尺,12.5μm。

调查在糖尿病心肌细胞凋亡的心,caspase-3免疫荧光染色法和TUNEL分析被执行。如数据所示5 (b)和5 (c),高剂量组显著高于caspase-3心肌细胞凋亡率,但这并未达到显著差异TUNEL相比,控制。有控制和低STZ组之间无显著差异。

3.5。光学映射的胞内钙在不同实验小组

从RNA-seq分析,我们发现钙信号通路基因,特别是Calm2和Atp2A2STZ治疗组的显著改变。研究细胞内钙瞬态是否受损前和扩张型心肌病大鼠的早期阶段,我们进行了光学荧光映射使用Rhod-2AM sinus-paced Langendorff-perfused心(图6(一))。映射心室前壁细胞内钙瞬变的证明办理时间(数字6 (c)和6 (e))和振幅(图6 (f))的胞内钙瞬变与内在心率没有显著改变。然而,有一个显著延长90%钙瞬态时间(CTD90,数字6 (d)和6 (g)),特别是在高剂量组在高频(5赫兹)刺激。减少Atp2A2(腺苷三磷酸酶肌质/内质网钙2 +运输2)基因表达在高STZ组,负责吸收到肌浆网钙(SR),可能有助于延长CTD90。

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钙Rhod-2光学映射在不同的实验组,每组包括的心。(一)光学映射配置。(b)的比较典型的钙瞬变平均值定义感兴趣的区域。(c)地图的钙瞬态传导在1赫兹的刺激。(d)地图的钙瞬态时间为90% (CTD90)在1赫兹刺激复苏。条形图显示的平均值钙瞬态传导时间(e),振幅(f)和CTD90 (g)变化的控制,低和高STZ组。数据表示为 。 。控制:控制小组;低:低STZ治疗组;高:STZ组治疗。
3.6。人类生理表型出现高Glucose-Treated iPSC-Derived心肌细胞
3.6.1。细胞大小、葡萄糖摄取、ROS和ATP生产高Glucose-Treated iPSC-CM

暴露在高水平的血糖增加细胞区和核区(数字7(一)和7 (b))。iPSC-CMs 25 L更易与葡萄糖集团提出了一个重大的核增大5.5 L更易与对照组相比,虽然增加的核大小11更易/ L集团的是无关紧要的。细胞大小的海拔也显示出倾向于增加血糖水平,虽然不如核变化显著的区别。细胞和核肥大显示激活细胞代谢生物合成的影响下高葡萄糖。葡萄糖吸收(图7 (c)(图)和ATP生产7 (e))显示显著的抑制;ROS生产(图7 (d)25更易/ L)增强葡萄糖组5.5 L更易与对照组相比。葡萄糖吸收也减少11更易/ L葡萄糖组,但没有检测活性氧和ATP的变化。

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(一)iPSC-CMs染色阳性心肌肌钙蛋白T (cTnT、红色),α辅肌动蛋白(绿色),DAPI(蓝色)。规模的酒吧,25μm。(b)的统计比较核区和细胞区在不同葡萄糖治疗组。葡萄糖吸收的比较(c)、活性氧(ROS, (d))和ATP生产(e)在不同葡萄糖治疗组。数据表示为 。 , , 。
操作。(Ca2 +]我测量hiPSC-CMs

探索如果高葡萄糖环境可能会改变在hiPSC-CMs钙处理,我们首先测量细胞内自由钙离子浓度([Ca2 +]我)使用比率计Fura-2 /录音。微量的钙瞬变响应如图1赫兹场刺激8(一个)。基线比25 L更易与葡萄糖组升高,虽然没有改变被发现从11更易/ L与控制(图5.5更易/ L细胞8 (b))。刺激诱发的增加(Ca2 +]我显著增强在11日和25 L更易与葡萄糖组相比,5.5 L更易控制(图8 (c)),11到25之间的差异更易与L葡萄糖组也显著。这些结果表明,高葡萄糖暴露在hiPSC-CMs受损钙处理。

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功能表型出现高glucose-treated人类iPSC-derived心肌细胞。(a)荧光比例概要显示细胞内自由钙瞬变([Ca2 +]我)应对1赫兹场刺激使用Fura-2AM hiPSC-CMs(左)。测量基线(中)和峰值(Ca(右)2 +]我与5.5 hiPSC-CMs更易/ L(控制),11日或25更易与L葡萄糖治疗。(b) (Ca2 +]我变化的抑制hiPSC-CMs肌浆网钙2 +泵thapsigargin集团之一。峰值和高原被表示为%的比例变化。(Ca (c)的测量2 +]我与Fura-2AM(顶部,黑线)和线粒体钙2 +([Ca2 +]米)使用Rhod-2 / AM(底,红色线)后线粒体Ca2 +商店损耗hiPSC-CMs FCCP。(d)诱发高峰(Ca2 +]我FCCP治疗后组。(e)的减少2 +]米改变FCCP治疗后组hiPSC-CMs之一。(f)分析线粒体膜电位(MMP)变化使用阳离子JC-1 hiPSC-CMs染料作为荧光探针。的变化表示为红/绿荧光强度之比(从6 - 8每组图像结果进行了分析;规模的酒吧,10μ米)。数据表示为 。 , 。 。

唤起(Ca2 +]我反应是受多种因素的影响。检查如果石棺(endo)血浆的网运输钙腺苷三磷酸酶(SERCA)泵、调制的蛋白质产品Atp2a2基因,SERCA的泵抑制剂thapsigargin引入细胞(图8 (b))。1μ(Ca mol / L thapsigargin显示迅速增加2 +]我。这增强倾向于降低葡萄糖水平峰值和高原海拔测量,虽然峰值的差异不显著,表明SERCA的泵的损伤可能参与的机制增强钙处理在高葡萄糖hiPSC-CMs治疗。

3.6.3。线粒体(Ca2 +)和线粒体膜电位hiPSC-CMs (MMP)水平

我们应用质子解偶联剂FCCP (3μmol / L)去偏光内线粒体膜,使用Fura2-AM,监控存储线粒体钙的释放2 +(数据8 (c)和8 (d))或直接测量线粒体Ca2 +内容使用Rhod-2 / (5μmol / L)可选择性地积累在线粒体(数字8 (c)和8 (e))。(Ca的顶峰2 +]我瞬态增加在hiPSC-CMs 11或25 L更易与葡萄糖组与5.5相比更易与L(控制)组,但高葡萄糖组之间没有显著差异(图8 (d))。(Ca2 +]米(图8 (e)),FCCP显著降低线粒体Ca2 +信号25 L更易与葡萄糖组与对照组相比,但最少11更易/ L和对照组之间的区别。有趣的是,有一个显著减少25更易与L相比,更易与11日/ L组。总之,这些数据表明,线粒体发挥重要作用的调制2 +信号产生的高葡萄糖环境。

排除hyperosmolar效应,我们培养iPSC-CMs在5.5更易与L / L葡萄糖+ 19.5更易与甘露醇(高甘露醇组)来达到相同的渗透性25 L更易与葡萄糖培养基。我们没有发现不同基线钙瞬态控制之间的比率(5.5 L更易与葡萄糖, , )和高甘露醇组( , ,图年代2应用FCCP)。后,没有显著性差异,两组之间的胞内钙瞬态峰值( vs。 ,图年代2B)。这些结果表明,我们文化的hyperosmolarity iPSC-CMs条件不影响细胞内钙瞬变。

我们使用荧光显微法和定量荧光测量评价MMP的变化在5.5中,11日或25更易与L glucose-treated hiPSC-CMs(图8 (f))。我们观察到显著减少线粒体膜极化的增加MitoProbe JC-1红色:绿色荧光比率在25更易与L glucose-treated hiPSC-CMs,然而,我们没有观察到任何更改11更易/ L葡萄糖组,表明高葡萄糖影响MMP。我们也进行透射电子显微镜(TEM)检查是否有超微结构特征差异5.5和25更易与L glucose-treated hiPSC-CM。肌原纤维组织良好到观察两组显然z轴对齐,而线粒体和内质网(ER)没有形态变化(图3)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们已经成功地建立了不同阶段的DM大鼠模型,喂食高脂肪的饮食结合不同剂量STZ效仿前和扩张型心肌病早期状态。我们提供了多方面的证据证明心肌功能和结构改变,因为代谢和细胞异常的DM的不同阶段,我们表明,Ca2 +信号稳态、ROS生成和凋亡细胞死亡调节特异表达在DCM的早期阶段。我们使用RNA-Seq探索微分转录组剖面和捕获的基因表达变化的影响和重要的信号通路在不同阶段的DM。此外,我们进一步阐明潜在的分子通过使用相关高glucose-treated iPSC-CM模仿致糖尿病的环境。

2型糖尿病的特点是一种代谢紊乱,提高血糖浓度。众所周知,慢性高血糖与很多方面有关健康的2型糖尿病患者,包括严重的心血管疾病的结果。典型的心脏功能障碍的临床特征与2型糖尿病包括减少心室合规和舒张功能、运动能力下降,以及增加心律失常的发生率[20.]。T2DM病人被认为是一个高风险的发展中高频子群。此外,葡萄糖耐量减低(IGT)已被证明有助于预后不良和心力衰竭患者是一个独立的因素21]。虽然糖尿病心脏功能障碍已经承认多年来通过广泛的调查,有效的心脏预防和治疗策略仍然是难以捉摸的。

越来越多的证据表明,高血糖水平与心脏异常在2型糖尿病的风险更大。患者血糖控制不良会增加心血管疾病的发病率和经验更糟糕的临床结果(19]。他等人报道,参与者与2型糖尿病人强化血糖控制降低心血管事件的风险,虽然没有任何证据表明强化血糖控制的死亡率(22]。此外,一些研究证实,没有明显的有利影响强化血糖控制在2型糖尿病患者主要心血管结果和全因死亡率(23]。这些发现表明,强化血糖控制的贡献减少的主要心血管结果仍然是一个悬而未决的问题。

心脏损伤的发病早期出现之前,可测量的心脏功能障碍的发病。更重要的是,有效的方法,可以逆转心脏损伤是有限的。不同血糖水平对心脏损伤的影响,而这些影响机制尚未完全阐明。早期发现2型糖尿病对心脏的影响将使最优实现有效的疗法,预防心衰的发展。因此,本研究的目的是描述潜在的心脏分子机制和心脏畸形在2型糖尿病大鼠糖尿病状态不同,这可能为最佳时机和提供证据的预防和治疗策略。

在这项研究中,我们开发了2型糖尿病动物模型的高脂肪饮食结合注射STZ,如前所述[9]。低剂量组单一的STZ腹腔内注射35毫克/公斤,而高剂量组一腹腔内注射STZ 50毫克/公斤。各种调查人员使用协议从单剂量STZ在50到150毫克/公斤24,25]。我们采取了相对低剂量策略,因为这种策略最小化的非特异性毒性高剂量STZ [14]。9周后,从目前的研究结果显示,高剂量组的老鼠表现出显著的更高的空腹血糖,胰岛素,TC, TG、FFA,和HOMA-IR与低剂量组相比,胰岛素,TC, TG、FFA, HOMA-IR水平不低剂量组和对照组之间的差异。此外,低剂量组的大鼠OGTT,证实了成功的2型糖尿病。据报道,高血糖与心肌基质的改变有关,已假设导致心脏损伤(26]。

间质纤维化是重要机制潜在的心脏损伤的病理机制,这可能加重心肌僵硬。心脏重塑的程度两个2型糖尿病大鼠模型的评估。在高STZ组治疗,心脏重量指数及心肌胶原蛋白沉积和控制相比显著增加。此外,通过RNA-Seq外,我们还发现心脏结构调制基因等Myh6,Tnnt2,Tpm1,Myl3,Tnni3,Ttn,Tnnc1被减少,Tab1(活化激酶1和MAP3K7-binding蛋白1)参与纤维化反应是提高高剂量STZ组(图1)。然而,这些指标没有发现任何统计差异低STZ组治疗。结合基本参数的结果,我们证实,高、低剂量STZ治疗2型糖尿病模型属于pre和DCM的早期阶段。我们还发现ANP和法国巴黎心室组织的mRNA表达增强STZ-treated组相对于控制(数字2 (b)和2 (c))。一些证据表明,法国巴黎银行(BNP海拔代表心脏损伤的早期改变,前心脏重塑的外观(27]。这是与我们的研究结果一致,进一步证实了心脏肥大在我们的2型糖尿病模型。

氧化应激的主要组件触发心脏DM的变化。ROS增加生产可能会随后诱导细胞凋亡、炎症等病理变化(28,29日]。目前的研究表明,活性氧产量提高在低和高剂量组和高剂量组要高得多(图5(一个))。高剂量STZ组有更高的心肌细胞凋亡率caspase-3活动(图5 (b))。此外,我们的RNA-Seq结果证实脂肪酸代谢,氧化磷酸化,细胞凋亡,肿瘤坏死因子pathway-related基因改变高剂量组。这些结果表明,活性氧的积累发生前的扩张型心肌病的发病早期。我们同意之前的工作报告,生成活性氧过剩被认为是中央T2DM-related心脏细胞凋亡的机制和改造在早期和晚期糖尿病心肌病(30.]。我们还发现两个葡萄糖转运蛋白,Slc2a4(Glut4)和Slc2A1(Glut1)基因在高剂量STZ组减少(图1)。这种诱导损伤的葡萄糖代谢,增加脂肪酸代谢导致线粒体功能障碍,这一起增加活性氧的生产(31日]。我们验证了一些关键的实时PCR和基因的发现Decr1(一种酶参与脂肪酸β氧化),Calm2(与心律失常有关),Ddit3(proapoptotic转录因子)表达显著增加,与对照组进行比较。这些基因可能是治疗糖尿病心肌病的治疗目标。

T2DM-induced心脏损伤的发病率和严重程度保证机制的深入调查和暗示因素。近年来,iPSC的出现使得代iPSC-CMs,来自人体的细胞,可以应用于体外研究[32]。在目前的研究中,iPSC-CMs被培养在生理(5.5 L更易与葡萄糖)或高葡萄糖环境(11到25更易与L葡萄糖)条件。我们演示了细胞和核肥大25更易/ L glucose-treated iPSC-CM,葡萄糖吸收,ROS和ATP生产也显著改变。这些研究结果与我们的DM大鼠模型结果一致。此外,线粒体膜电位明显降低25更易/ L组,这表明受损的电子传递和氧化磷酸化。唤起(Ca2 +]我反应是受到多种因素的影响,包括Ca2 +条目,在质膜挤压,Ca2 +吸收和释放内部商店,内生和外生Ca2 +缓冲(33,34]。目前的研究表明线粒体受损钙瞬变的核心作用,同时减少SERCA的泵活动放缓导致SR的Ca2 +再摄取,这可能导致高胞质钙,以及延长细胞内钙瞬态时间(CTD90)衡量光学映射在高STZ糖尿病大鼠治疗。钙运输是一项基本生物过程关键影响细胞代谢,信号,和生存35]。

总之,心脏重塑,纤维化,刚度增加,心肌细胞损失提供的所有后果是葡萄糖和脂类代谢,引起氧化应激和线粒体功能障碍在DCM(图的发展9)。在这项研究中,我们已经描述了不同阶段的2型糖尿病大鼠模型中的喂养高脂肪饮食结合不同剂量STZ效仿前和扩张型心肌病早期状态。此外,高glucose-treated iPSC-CM模仿致糖尿病的环境。这个实验框架可能利用调查潜在通路DCM的进展。


图9
总结图说明之前的潜在机制和早期糖尿病心肌病的状态在糖尿病心肌病级数高脂肪饮食结合注射链脲霉素引起的大鼠模型。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的披露。

作者的贡献

Dongjuan小王和库恩刘贡献了同样的工作。

确认

我们非常感谢大卫·帕特森教授他的仔细阅读和评论的手稿。我们也感谢丽莎希瑟的建议建立动物模型,Ujang Purnama技术援助,和Errin约翰逊(EM邓恩学校设施,牛津)来执行他们的工作。这项研究受到了画眉医院,中国科学院大学̶牛津大学国际科研合作基金(AVR02500);中国国家自然科学基金(没有。81900340);浙江省自然科学基金、中国(LQ19H020001);中国宁波自然科学基金(2019 a610342);和宁波健康品牌主题基金(PPXK2018-01)。

补充材料

补充表1:引物序列用于rt - pcr分析列表。补充表2:中心基因PPI网络的候选路径。图S1:条形图比较TPM(每百万记录)的值根据KEGG途径关键基因从RNA-Seq分析分类。度列表选择比较的控制与STZ治疗组高,这与脂肪酸的新陈代谢(a),氧化磷酸化(b),钙信号(c)、心脏结构和功能相关的(d)、胰岛素抵抗(e)、细胞凋亡和肿瘤坏死因子通路(f)。图S2:细胞内自由钙离子浓度基线(a)和治疗后3μmol / L FCCP hiPSC-CMs暴露于5.5 (b)更易与L葡萄糖或高甘露醇(5.5更易与L / L葡萄糖19.5更易与甘露醇)媒体。图S3:透射电子显微镜(TEM)的人类诱导多能干细胞治疗心肌细胞(iPSC-CMs)在5.5 (a)和25更易与L葡萄糖(b)培养基。呃:内质网。比例尺:2μm。(补充材料)