文摘
皮肤是一个关键的器官完整性的维护和保护的有机体。当发生伤口时,触发一系列愈合机制重建受伤的区域。β石竹烯是一种倍半萜烯Copaifera langsdorffii油性树脂具有抗氧化和抗炎的潜力。先前的研究的基础上c . langsdorffii,β石竹烯被选中来评估其伤口愈合潜力和药理机制。切除伤口模型被用于男性纯种老鼠和宏观、组织学、免疫组织化学和生化分析与皮肤样本,进行比较β-caryophyllene-treated集团关于药物。结果表明宏观收缩的伤口处理β石竹烯。生化检测,显示的抗氧化和抗炎机制β-caryophyllene-treated组il - 10水平增加的GPx和减少炎性分子的水平,包括TNF -α干扰素-γ,il - 1β和il - 6。后β石竹烯治疗,免疫组织化学检测显示增强的组织愈合,通过增加层粘连蛋白-γ2和desmoglein-3 immunolabeling。β石竹烯也在重塑机制,增加胶原蛋白含量马森的三色的染色。这些发现表明愈合的潜力β石竹烯局部制剂在大鼠皮肤伤口,由抗氧化剂,抗炎和愈合的机制。
1。介绍
皮肤伤口是主要的健康问题,影响到数以百万计的人每年,导致生理和心理缺陷时没有正确对待1]。与没有愈合的伤口逐年增加,相关的并发症和治疗治疗的成本已经达到数十亿美元的全球(2]。愈合过程包括重叠和相互依赖的机制(炎症,上皮形成,血管生成,伤口收缩和矩阵重构)重建皮肤(3]。当这些机制之间出现了不平衡,治疗过程进入病理状态,导致错误的治疗,如肥厚性疤痕和无法愈合的伤口4]。为了防止伤口愈合的病理机制,市场上有几种治疗方法用于促进皮肤愈合作为抗菌或抗炎剂,改善组织清创,外皮形成和/或重构机制。然而,现有的治疗方法可能不是有效的治疗皮肤伤口根据类型,扩展和受伤的位置(5]。因此,研究集中在发现替代药物,促进皮肤伤口愈合没有疤痕(6]。
β石竹烯(反式- (9)8-methylene-4, 11日11-trimethylbicycloundec-4-ene)是一种天然bicyclical倍半萜烯中发现一些植物和精油,包括c . langsdorffii(豆科)石油7]。β石竹烯是一种挥发性化合物,不溶于水和具有较高的医药潜力由于其镇痛,抗氧化剂,抗菌和抗炎活动(8- - - - - -10]。之前的研究在c . langsdorffii建议的治疗潜力c . langsdorffii石油树脂配方(10%11]。因此,我们的团队测试了1%β石竹烯emulgel配方分析愈合的潜力和行动的机制的新配方在模型大鼠切除伤口。
2。材料和方法
2.1。化学药品和试剂
参考药物硫酸新霉素(5毫克/克)+杆菌肽锌(250 IU / g), dexpanthenol 5%和胶原酶1.2 IU是购自制药行业。SOD、CAT、MPO、谷胱甘肽、GPx和硅胶60 h chromatoplates获得Sigma-Aldrich化学品(圣路易斯,美国)。肿瘤坏死因子- ELISA试剂盒α干扰素-γ,il - 1β从研发系统、il - 6和il - 10买了(明尼阿波利斯,美国)。生化比色包量化的AST、ALT、γgt,尿素和肌酐从Interteck-Katal购买(巴西贝洛奥里藏特)。主要的抗体林γ2购买从圣克鲁斯生物技术(美国达拉斯)。Dsg3 ki - 67,αsma抗体和免疫组织化学显示包买来Abcam(剑桥,美国)。Sepineo P600、丙二醇、methyldibromo glutaronitrile /苯氧乙醇从光谱获得化工制造公司(美国新不伦瑞克)。Labrafac lipophile WL 1349年从Gattefosse购买(法国里昂)。
2.2。的提取和分离β石竹烯
提取和分离β石竹烯之前报道了里贝罗et al。12][12]。简单地说,c . langsdorffii油性树脂收集在巴西北部和东南部地区,和植物凭证被西尔瓦娜Tavares罗德里格斯在标本从亚马逊“巴西农业研究公司”东方(SPFR 10120)。一百毫升的挥发部分油性树脂加入500毫升水和受到hydrodistillation 12小时使用Clevenger-type装置。然后,挥发部分受到一个旋转带蒸馏过程获得分数丰富β石竹烯。β石竹烯采用经典柱层析法纯化从这些分数挤满了Sigma-Aldrich 60 h与AgNO硅胶浸渍3的梯度hexane-ethyl醋酸作为流动相。
2.3。制定emulgel和1%β石竹烯乳液
的emulgel合成了均质化Sepineo P600 (3% w / w),丙二醇(5% w / w), Labrafac lipophile WL1349 (10% w / w), methyldibromo glutaronitrile /苯氧乙醇(0.1% w / w)和水在室温下与Polytron PT (±25°C) 10 - 35 GT(瑞士Kinematica)在600 rpm。1%的β石竹烯乳液合成了均质化β石竹烯(1% w / w)在室温下emulgel (±25°C)。的流变行为emulgel在流变仪分析了R / S + (Brookfield)配备C50-1主轴和变阻器软件2000 2.8版。样本行为监测在一个恒定的温度(25°C)使用水浴/循环器。
2.4。动物
总共有105男性7-week-old纯种大鼠体重250±20 g(中央动物屋,UNESP Botucatu)被用于实验。前一周的动物被安置单独实验并受温度的23±2°C,一个12小时的暗光循环,和动物有免费的食物和水,直到实验的程序被启动。本研究经伦理委员会批准在圣保罗州立大学动物使用协议976/2017。
2.5。试验协议切除伤口
老鼠与腹腔内氯胺酮麻醉(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)13]。他们的头发剃,切除全层皮肤伤口在背部(肩胛下的地区)使用3厘米直径。伤口放置在这方面不能达成的动物,它阻止self-licking [14]。每个老鼠每天两次局部治疗三种不同实验时间:3、7、14天(n = 35动物/期)。每一段时间后,动物安乐死,皮肤伤口和血液的采集样本进行分析。动物被分配到下面的七组(n = 5 /组):(我)置:没有治疗受伤的动物(2)NeBa:受伤的动物对待新霉素5毫克/ g +杆菌肽锌250 IU / g(3)敏捷:受伤的动物对待dexpanthenol 5%(iv)上校:受伤的动物胶原酶处理1.2 IU(v)Emulgel:受伤的动物对待Emulgel(车辆)(vi)汽车:受伤的动物治疗1%β石竹烯emulgel(七)控制:动物没有损伤和治疗——生理模式
2.6。伤口收缩分析
测量受伤区域的收缩,每个伤口使用数码相机拍摄规模门槛天0,3、7和14切除伤口诱导后(天0)。通过测量受伤的形态学分析领域使用特定的软件,和每个老鼠伤口收缩的比例是使用以下公式计算11,15]:
2.7。肝和肾毒性
每个动物的安乐死之后,血立即收集和离心机15分钟在6000 rpm和4°C。上层清液收集,用于确定肝脏和肾脏毒性使用AST、ALT和γgt (IU / L)参数以及尿素和肌酐的浓度(mg / dL)。
2.8。炎症介质和抗氧化酶
受伤的皮肤样本收集每个动物的量化干扰素-γ,il - 1β、il - 6、il - 10和TNF -α炎性细胞因子和抗氧化酶,包括SOD、CAT、GPx,谷胱甘肽。部分每个伤口使用手术刀被削减,包括病变的边界和中心。皮肤样本立即均质(1:5米/ v)在磷酸缓冲(pH值7.4)和离心机15分钟在10000 rpm和4°C。每个样本收集的上清液,细胞因子被ELISA量化描述的供应商。pg /毫克的蛋白质表达的结果。以下分子参与氧化应激通路是量化通过生化检测,根据协议:SOD (IU /毫克的蛋白质)(16),猫(IU /毫克的蛋白质)(17),GPx (nmol NADPH /分钟/毫克的蛋白质)(18),谷胱甘肽(nmol /毫克的蛋白质)19]。
2.9。组织学参数
受伤的皮肤样本的另一半老鼠与缓冲10%甲醛固定,嵌入在石蜡切片(5μ米)和沾染了他和马森的三色的污渍。每个部分提交通过光学显微镜的形态学分析。他染色,表皮厚度(μ米)、总表皮和真皮细胞(μ米2)和数量的真皮血管(血管)进行了分析。马森的三色的染色,真皮的胶原蛋白含量(μ米2)进行了分析。伤口的边界和中心区域与五种不同的显微照片分析了每个地区的部分。AvSoft BioView光谱软件被用来执行分析。
2.10。免疫组织化学
每个老鼠的皮肤样本处理定期(以10%的缓冲福尔马林固定,嵌入在石蜡切片;5μ米厚度)。免疫组织化学与主层粘连蛋白抗体,然后执行γ2 (1):200μL), desmoglein-3 (1: 200μL), ki - 67 (1): 100μL)和αsma (1): 400μL)根据协议特定的合/民建联检测设备。地区(μ米2)和阳性细胞(计数阳性细胞)为每个抗体在伤口的边界和中心量化每个地区有五个不同的显微照片的部分。AvSoft BioView光谱软件被用来执行分析。
2.11。统计分析
数据表示为±标准差。双向方差分析与Bonferroni测试后的分析中使用伤口收缩。炎性介质、氧化应激和毒性数据提交给单向方差分析与图基的因果检验。组织学参数和免疫组织化学数据进行分析根据克鲁斯卡尔-沃利斯检验邓恩的测试后。GraphPad Prism 5.01软件(美国圣地亚哥GraphPad软件Inc .)被用来执行分析的意义为5%。
3所示。结果
3.1。Emulgel和1%β石竹烯乳液稳定性试验
emulgel的流变行为和1%β石竹烯乳液表现出非牛顿特性,假塑性行为(n < 1)。这一结果表明,随着剪切速率的增加,粘度降低(数据未显示)。
3.2。伤口收缩分析
分析了伤口的收缩3天,7和14(图1)。数据显示宏观伤口收缩和减少局部水肿的治疗组和NeBa车三天浮置板轨道和Emulgel组相比。7到14天的治疗后,上校和汽车配方显示最好的结果相比,在宏观紧缩的置和emulgel配方。此外,在这两个时期的治疗,老鼠接受汽车显示减少纤维素性渗出物与其他组相比。
3.3。肝和肾毒性
分析制定包含的肝和肾毒性β石竹烯、肝酶(ALT和ASTγgt)和肾脏蛋白质(肌酐和尿素)评估在14天的治疗后大鼠的血(最长的疗程)。无显著差异的值测量所有的治疗和正常的参数被发现在三个实验周期的治疗(表1)。
3.4。量化的炎症介质
干扰素-的浓度γ,il - 1β、il - 6、il - 10和TNF -α细胞因子作为评价ELISA图所示2。干扰素-水平γ减少汽车组相比置组后三天。NeBa另外两个治疗周期,敏捷和坳商业配方,以及汽车测试药物,降低干扰素-的水平γ浮置板轨道和Emulgel相比。三天后,减少il - 1β水平NeBa和敏捷观察浮置板轨道组相比,治疗组。七日内,降低il - 1的含量β观察NeBa,敏捷、坳和汽车组浮置板轨道和Emulgel组相比。在过去的疗程,汽车集团降低il - 1β浓度相比,所有受伤的群体。NeBa il - 6水平降低了,敏捷和汽车组相比,三,七天的治疗后置和Emulgel组。il - 10的水平没有不同治疗之间的天三个和7个。在最后一个疗程,观察il - 10的增加NeBa,敏捷、坳和汽车浮置板轨道和Emulgel治疗组相比,治疗组。肿瘤坏死因子-αNeBa水平相对较低,敏捷和汽车组浮置板轨道和Emulgel组相比,十四天,还有其他两个时期(图中没有显著差异2)。
3.5。氧化压力分析
猫活动、GPx活性、SOD活性、谷胱甘肽浓度如图3。猫的活动是减少坳和汽车组浮置板轨道和Emulgel组相比,十四天,与相同级别的控制,展示酶的正常组织。前两个时期的治疗没有显著差异在猫的活动。NeBa GPx活性增加,上校和汽车治疗组相比其他组七天治疗期间无差异在三个和14天。谷胱甘肽浓度和SOD活性并不是不同的受伤的人群在任何时期(图3)。
3.6。组织学参数
没有差别的量化从表皮细胞,边界的中心真皮受伤的人群在任何疗程(数字4- - - - - -6和补充材料1)。形态学分析显示减少的动物的表皮厚度与NeBa治疗,敏捷、坳和汽车相比配方的浮置板轨道和Emulgel组动物后7至14天。此外,汽车集团在14天的结果与对照组相似,导致正常表皮厚度在车里治疗(数字4和7)。血管的量化边界和中心的伤口没有显示显著差异在任何疗程(数据5和6、补充材料2)。量化的总胶原蛋白在边境的伤口没有区别第三天,7和14。中心区域的伤口,在车里有胶原蛋白量的增加浮置板轨道和Emulgel组相比,第三天,相比相同浓度的控制。7到14天后,观察(数据没有差异8- - - - - -10)。
3.7。免疫组织化学
有增加αNeBa -SMA-immunolabeled成纤维细胞,敏捷、坳和汽车浮置板轨道和emulgel样本样品相比,三,七天的治疗后14天没有差异。然而,商业和汽车制定了治疗结果类似于控制,表明正常化αsma在这些团体(数字11和12)。Immunolabeling Dsg3显示减少的标记区域的NeBa浮置板轨道集团和汽车组相比,后三天。有减少Dsg3 immunolabeling坳和汽车组浮置板轨道和Emulgel组相比,七天之后。没有显著差异在最后一个疗程(数字11和13)。林的增加γ2 immunolabeling坳和汽车组浮置板轨道和Emulgel组相比,第三天,增加区域汽车集团浮置板轨道和Emulgel组相比在十四天(数字11和14)。受伤的团体之间没有明显差异的数量ki - 67 immunolabeled表皮细胞,边境地区的中部地区真皮后3、7和14天(数据15- - - - - -17和补充材料3)。
4所示。讨论
β石竹烯是一种倍半萜烯在许多消费品和植物精油与相关的抗氧化、抗炎和抗菌势(8- - - - - -10]。之前的研究使用c . langsdorffii石油树脂用于治疗皮肤切除伤口已经表明,石油树脂的最佳有效浓度为10%,和石油树脂的植物化学的资料已经确定(11,20.]。因此,我们计算倍半萜烯的浓度根据这些研究合成emulgel配方在这项研究中,导致1%的浓度。本研究证实了愈合emulgel配方含有1%的活动β石竹烯在大鼠切除模型,证明抗氧化剂和抗炎活动以及改善重构和愈合的机制介导的倍半萜烯。
市场上有一些外用药物具有不同的作用机制来治疗伤口旨在减少皮肤的愈合和治疗的时间组织修复中的错误。局部含硫酸新霉素和杆菌肽锌配方用于皮肤伤口的初始阶段,以防止受伤感染,延迟伤口愈合的主要因素之一5]。Dexpanthenol(5%)也被运用于皮肤损伤与先前的研究报道这种治疗的角化细胞和成纤维细胞的增殖潜力(21]。另一个常见的药物用于治疗皮肤伤口是胶原酶,蛋白酶histolyticum梭状芽胞杆菌,已经给清创术的临时发挥作用的细胞外基质和重构机制,使它有用的治疗伤口在诊所(22,23]。因此,这三种药物的使用在我们的研究中比较新的治疗包含积极的控制β石竹烯。
AST、ALT和γgt在某些肽酶催化反应和肝细胞中高度表达。药物导致肝毒性作用时,这些酶的增加血流量,并用于评价肝毒性(24]。肌酐和尿素是蛋白质合成的生理身体和由肾脏过滤消除的生物。等离子体水平的这些蛋白质的增加代表肾过滤的不稳定由于毒性作用[25]。等离子体的肝和肾的蛋白质β石竹烯和积极的控制与测量的生理量化(控制),证明包含倍半萜烯没有系统性的局部治疗的毒性。
皮肤的损伤结果的合成和释放介质止血级联受伤和死亡的细胞区域与当地释放活性氧(ROS) (26]。虽然释放自由基和活性氧有抗菌通路中的重要作用,加剧了释放活性氧可能导致慢性炎症和损伤愈合过程,导致肥厚性疤痕或无法愈合的伤口27]。控制ROS的浓度,细胞的合成抗氧化剂介质,参与过氧化物和过氧化氢的途径。超氧化物自由基是加工成过氧化氢的高活性分子,SOD的活性分子,(16]。然而,在高浓度时,细胞过氧化氢是一种有毒的化合物。因此,过氧化氢代谢由猫和GPx谷胱甘肽(消费),导致水和氧气分子(18,28]。先前的研究已经报道了在体外抗氧化剂的潜力β石竹烯(8,29日),我们的研究结果显示,GPx活性增加证实的抗氧化潜力β石竹烯在大鼠切除伤口模型以及在NeBa坳积极控制。
炎症机制对正确的皮肤伤口愈合至关重要。的il - 1β、il - 6和TNF -α促炎细胞因子参与细胞分化和增殖,协调肉芽组织的合成,血管生成,组织愈合和胶原重塑机制(30.]。此外,这些细胞因子与干扰素-相关联γ提高白细胞的迁移和扩散在伤口,改善坏死组织的清创术和吞噬作用的抗原(31日]。il - 10是另一个白介素参与皮肤伤口的炎症机制,作为一种抗炎中介抑制促炎细胞因子的合成和作用在血管生成32]。然而,炎性细胞因子之间的不平衡会导致慢性炎症过程,导致错误在随后的愈合机制和伤口愈合的障碍33]。在目前的研究中,细胞因子量化数据显示抗炎活性β石竹烯在皮肤伤口减少是由于干扰素-γ,il - 1β、il - 6和TNF -α水平以及增加il - 10水平与抗炎潜在NeBa相似,敏捷和坳。
另一个伤口愈合机制涉及到的伤口收缩成纤维细胞和细胞外基质蛋白之间的相互作用导致伤口关闭(34]。TGF -β1是一个生长因子参与机制在伤口愈合的所有阶段,包括成纤维细胞的分化。通过TGF -β1刺激成纤维细胞位于边境受伤的合成αsma,一个细胞内压力纤维蛋白质,获得收缩表型,并分化成为myofibroblasts [35]。myofibroblasts绑定到我细胞外胶原纤维和发起的收缩应力纤维,减少受伤的区域。(35]。因此,所扮演的角色β石竹烯配方在伤口收缩是通过宏观评价、验证,减少受伤的区域观察到治疗组β石竹烯、新霉素/杆菌肽、胶原酶。此外,免疫组织化学数据αsma建议增加这些团体是由伤口收缩αsma的immunolabeling的增加这种蛋白质在这些治疗方法。
在皮肤伤口愈合愈合是重要的角化细胞的增殖和迁移的边界受伤。首先,蛋白酶溶解角质细胞间粘附分子,如desmoglein-3。这些细胞增殖并合成锚定蛋白、层粘连蛋白-γ2、协助角化细胞迁移到细胞外基质,协调组织愈合机制(36,37]。然而,扩散介质导致的过度角化细胞的增生与增加伤口瘢痕疙瘩形成的表皮厚度的标记(38]。因此,表皮厚度的组织学结果和角化细胞的免疫组织化学数据扩散(ki - 67), desmoglein-3和层粘连蛋白-γ2表明β石竹烯和胶原酶治疗增强desmoglein-3和层粘连蛋白-愈合的机制γ2在细胞的迁移。我们的发现证实了小山的结果等。39),报告增强后的皮肤伤口愈合的治疗β石竹烯油老鼠(39]。
最后,临时细胞外基质是被永久组织开始重塑机制所取代。在这个过程中,III型胶原蛋白和其他组件的临时矩阵是由细胞外基质金属蛋白酶代谢。同时,化合物,如I型胶原蛋白,弹性蛋白和蛋白聚糖,合成和组织更多的抵抗组织,和myofibroblasts过剩、成纤维细胞和内皮细胞增殖在治疗和凋亡40]。我们的组织学评估结果马森的三色的染色显示的作用β石竹烯皮肤修复,增加胶原蛋白合成的中心区域,在第一期皮肤的伤口愈合与重构机制更好的结果比参考药物。
5。结论
考虑到我们的结果,我们得出这样的结论:emulgel配方含有1%β石竹烯提高在活的有机体内皮肤伤口愈合通过抗氧化、抗炎、伤口收缩,组织愈合和重构机制。我们的结果证明了的潜力β石竹烯皮肤伤口疗法与三种参考药物相比,更好的结果在伤口愈合药物相比,参考。此外,肝和肾参数的分析测试的安全配方,确认没有系统性毒性。因此,这项研究提供了很好的证据,1%β石竹烯有很大潜力用于治疗全层皮肤伤口,证明药物的安全性和有效性成为未来替代治疗伤口愈合。
缩写
| αsma: | α光滑的肌肉肌动蛋白 |
| γgt: | γ谷酰基转移酶 |
| ALT: | 丙氨酸转氨酶 |
| 方差分析: | 方差分析 |
| AST: | 天冬氨酸转氨酶 |
| 猫: | 过氧化氢酶 |
| Dsg3: | Desmoglein-3 |
| ELISA: | 酶联免疫吸附试验 |
| GPx: | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| 谷胱甘肽: | 减少谷胱甘肽 |
| 他: | 苏木精和伊红 |
| 合/轻拍: | 辣根过氧化物酶/ diaminobenzidine |
| IBB: | 生物科学学院Botucatu |
| 干扰素-γ: | 干扰素-γ |
| il - 10: | 白细胞介素- 10” |
| il - 1β: | Interleukin-1β |
| il - 6: | 白细胞介素- 6 |
| 国际单位: | 国际单位 |
| 林γ2: | 层粘连蛋白-γ2 |
| MMP的: | 细胞外基质metaloproteinases |
| ROS: | 活性氧 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α |
| 英国: | 联合王国 |
| UNESP: | 圣保罗州立大学 |
| 美国: | 美利坚合众国。 |
数据可用性
用于支持本研究的发现的信息都包含在这篇文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
我们要感谢圣保罗州立大学生物科学学院Botucatu和圣保罗研究基金会(FAPESP)必须占州政府拨款支持:2011/13630-7,2017/04138-8 2017/17600-1。
补充材料
补充相关数据可以发现,本文的在线版本。(补充材料)