文摘

氧化应激是一个关键组成部分,肾缺血/再灌注(I / R)损伤。岩藻黄质(外汇),海洋类胡萝卜素与增强抗氧化能力,作为活性氧抑制剂在缺血性中风等疾病和急性肺损伤。我们假设岩藻黄质可以减弱肾I / R-induced氧化损伤。C57BL / 6小鼠( )被随机分配到骗局,红外光谱、 ,和 (25、50、100毫克/公斤)组。肾I / R损伤诱导了老鼠夹紧左肾肾元小费。墨角藻黄素是腹腔内注射手术前24小时。与IR组相比,预处理和岩藻黄质显著提高肾脏功能障碍和组织结构损伤和抑制ROS水平和细胞凋亡。一致的结果在HK-2细胞观察。此外,我们发现肾I / R导致Sirt1的表达减少,Nrf2, HO-1,虽然岩藻黄质调节Sirt1的表达,Nrf2, HO-1。墨角藻黄素的保护作用显著逆转EX527 (Sirt1的选择性抑制剂)或si-Sirt1。总之,我们的研究调查了墨角藻黄素对肾脏的保护作用I / R损伤,和底层的机制可能与激活Sirt1 / Nrf2 HO-1岩藻黄质信号通路来减弱氧化压力诱导细胞凋亡。

1。介绍

急性肾损伤)是一种常见的临床综合征,通常由肾手术和脓毒症引起的,以肾小球滤过率的突然减少在初始阶段(1]。阿基与不良临床结果相关联,包括慢性肾脏疾病(2和死亡率上升3]。近年来已经取得了显著的进展在阿基的紧急治疗,但阿基的发病率和死亡率仍然很高,因此,仍然缺乏有效的治疗药物(4,5]。肾缺血再灌注(I / R)损伤被广泛认为是最常见的临床原因之一阿基(6]。I / R后通常会出现显著的肾小管损伤。研究表明,高浓度的活性氧(ROS)影响组织中肾小管上皮细胞死亡的一个重要原因和肾损伤肾I / R后(7]。缺血期间,线粒体是严重受损的组织,我和III复合物的功能,维持线粒体功能的改变,导致活性氧的生产(8,9]。在再灌注过程中,活化的有氧代谢和氧过多也改变线粒体复合物的功能,导致增加活性氧的生产。ROS的过度生产超过细胞抗氧化能力,进一步诱导组织损伤和细胞凋亡10]。与发病率和死亡率的增加肾I / R损伤,迫切需要寻找新的治疗靶点和开发新的治疗方法。

无声的信息监管机构1 (Sirt1)是一种NAD⁺(烟酰胺腺甘酸二核苷酸)依赖脱乙酰酶可以调节各种细胞活动包括基因转录、衰老,细胞应激反应,葡萄糖代谢和能量代谢调控脱乙酰作用不同因素(11- - - - - -13]。Sirt1可以减弱氧化应激、炎症和细胞凋亡以及调节线粒体功能和自噬(14- - - - - -18]。多项研究表明,Sirt1对I / R-induced肝脏保护作用,心脏和脑损伤(19- - - - - -21]。此外,Sirt1的renoprotective效应已被证明在不同肾脏疾病(22,23]。例如,Sirt1变弱肾I / R损伤通过减少细胞凋亡、促进细胞再生(24]。

核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)是一种胞内抗氧化蛋白的主要转录监管机构。Nrf2减少ROS水平调节下游HO-1抗氧化基因的表达和NQO1防止氧化应激组织损伤和细胞凋亡25,26]。大量研究表明细胞内ROS水平水平I / R后肾的肾损伤程度密切相关[27,28]。此外,几项研究已经证实,Sirt1有助于Nrf2核易位,增强DNA结合活性和转录Nrf2活性,和上调HO-1表达(29日- - - - - -31日]。因此,upregulation Nrf2 Sirt1激活的抑制氧化应激是一个潜在的战略来提高肾I / R损伤的治疗。

类胡萝卜素广泛存在于自然和天然色素,发挥重要的生理功能。数以百计的海洋类胡萝卜素被发现和报告海洋类胡萝卜素的生物功能已在近几十年来逐渐增加(32]。墨角藻黄素(Fx)是一种最丰富的海洋类胡萝卜素主要发现在褐色海藻,约占总数的10%天然类胡萝卜素生产(33]。墨角藻黄素产生生物活性在各种各样的疾病,包括肥胖、癌症和糖尿病(34- - - - - -36]。的抗氧化能力,岩藻黄质包含一个独特的化学结构(补充图S1)包括丙二烯键和5,6-monocyclic氧化物与增强抗氧化能力(37]。发表的研究表明,墨角藻黄素具有独特的优势在一些氧化应激相关疾病的治疗,如缺血性中风,蛛网膜下腔出血,急性肺损伤,动脉粥样硬化性心血管疾病38- - - - - -41]。此外,作为一个可食用的类胡萝卜素,墨角藻黄素具有良好的安全性。当墨角藻黄素的日常摄入量达到200毫克/公斤,仍然没有明显的致畸效应体内,这被认为是非常安全的抗氧化剂(42]。然而,没有报告岩藻黄质是否有利于肾I / R损伤。

在这项研究中,我们调查是否岩藻黄质可以防止肾I / R损伤和探索的潜在机制。我们建立了小鼠肾I / R损伤模型和人工肾近端小管上皮细胞系(HK-2)缺氧/复氧(H / R)损伤模型。老鼠和HK-2细胞使用岩藻黄质,和肾功能改变,病理损伤,氧化水平和细胞凋亡检测。深,我们探索的保护作用是否岩藻黄质与Sirt1的激活/ Nrf2 HO-1信号通路,并进一步验证通过抑制Sirt1的具体机制。

2。材料和方法

2.1。实验动物和肾I / R模型

成年雄性C57BL / 6小鼠(年龄7 - 8周;提供的重量,第23 - 25 g)是武汉大学(武汉,中国)实验动物中心。老鼠被安置在一个特定的无菌设备(温度、研讨会°C,湿度50%,12小时黑暗/光周期)的实验动物中心武汉大学第一临床学院。每个笼子里有两只老鼠。所有的老鼠被允许自由饮水和吃东西。这个项目是我们的实验动物委员会批准,和所有程序后进行指导的实验室动物保健和使用美国国立卫生研究院发布的。

I / R模型被称为我们的先前的报道(43,44]。老鼠完全与戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,i.p。)和放置在一个恒温表来保持体温在37°C。所有的老鼠接受了中线解剖,紧随其后的是右肾切除术。接下来,左肾缺血45分钟执行使用无创性血管夹,其次是切除血管夹和腹部切口的缝合。小鼠腹腔注射0.5毫升PBS保持流体的平衡。再灌注24小时后,小鼠戊巴比妥钠腹腔注射执行(50毫克/公斤),和肾组织和血液立即收集。所有不同小鼠随机分为治疗组( 每组)。在虚假的集团,只有右肾切除手术。IR组的左肾血管夹45分钟;然后,再灌注的夹紧被释放。的外科手术 ( ,σ,F6932)组IR组的一样,但小鼠腹腔注射岩藻黄质(25毫克/公斤,50毫克/公斤,和100毫克/公斤)术前24小时。的外科手术 (选择性Sirt1抑制剂、Abcam Ab141506)组IR组的一样,除了小鼠的腹腔里注射了墨角藻黄素(100毫克/公斤)和EX527(5毫克/公斤)术前24小时。矢量控制集团( )管理等量的DMSO在向量解决方案。

2.2。肾功能

体内再灌注后,新鲜血液样本收集到的老鼠,离心机在3500 r / min 15分钟,和上层的收集。血清尿素氮(BUN)和肌酸酐(Cr)评估使用肌酐和尿素商业工具(南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商提供的说明。

2.3。肾脏组织学染色

肾脏的组织学检查,在4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片在4μm厚度,苏木精和伊红染色())。肾小管损伤是得分的比例在0 - 4根据小管坏死,扩张,管状的形成,细胞溶解:0,没有受伤;1、5% - -25%;2、25% - -50%;3、50% - -75%;4,> 75%。形态学评估是由两名有经验的肾脏病理学家不知道实验。

2.4。免疫组织化学

免疫组织化学染色法是使用一个商业执行化学工具包(Polink-1一步聚合物检测系统;中国,北京,ZSGB-BIO)。部分(4μ米厚度)是孵化anti-KIM-1抗体(Abcam Ab78494)和anti-cleaved caspase-3抗体(细胞信号,# 9661)一夜之间在4°C,然后用二次孵化抗体30分钟37°C,其次是添加一个污点。在显微镜下,五个不同字段的视图(×400)随机选择评估染色强度。量化,相对的意思是集成光密度(IOD)除以每组的均值IOD的控制,由Image-Pro + 7.0(媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)。所有部分的放大拍摄400×。

2.5。TUNEL染色分析

在组织细胞凋亡检测使用TUNEL试剂盒(Beyotime生物技术、C1089)使用TUNEL原位(终端end-of-cut标签)染色法。简单地说,肾组织石蜡切片脱蜡、水化;组织蛋白酶K处理20分钟在37°C,然后用PBS洗两次。TUNEL检测解决方案添加一滴一滴地和放置在一个黑暗的调湿室在37°C 1小时。细胞核是用DAPI染色观察前5分钟。

2.6。免疫印迹分析

bcl - 2蛋白水平的伯灵顿,cleaved-caspase-3, SOD1, Sirt1, Nrf2, HO-1衡量蛋白质HK-2污点分析细胞和肾组织根据标准协议(补充图S2-S7)。HK-2细胞和肾组织细胞溶解了里帕缓冲区(P0013B Beyotime生物技术,中国)含有蛋白酶抑制剂获得总蛋白。GAPDH是蛋白质的内部加载控制。蛋白质含量由BCA蛋白质分析工具包(P0006 Beyotime生物技术,中国)。蛋白质样本10% SDS聚丙烯酰胺凝胶分离和转移到PVDF膜,关闭了5%脱脂牛奶和抗体免疫印迹。抗体的稀释后使用:Sirt1(1: 2000年,Abcam Ab12193)、裂解caspase-3(细胞信号1:1000年,# 9661),伯灵顿(细胞信号1:200年,# 2772),bcl - 2(1: 1000年,Abcam Ab196495), Nrf2(1: 1000年,Abcam Ab137550) HO-1(1: 2000年,Abcam Ab13243) SOD1(1: 5000年,Abcam Ab13498)和GAPDH(1: 5000年,PROTEINTECH北美,10494 - 1 - ap)。与适当的二次孵化后抗体,蛋白质印迹观察使用化学发光合基板(美国微孔,Billerica的)。数据分析使用Image-Pro + 7.0(美国媒体控制论,罗克维尔市,MD)量化蛋白质水平。

2.7。细胞培养和建立HK-2细胞H / R模型

人类肾近端小管上皮细胞系(HK-2)提供的典型文化收藏、美国HK-2细胞孵化杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)(美国表达载体)37°C,包括不必要的氨基酸,0.05毫克/毫升牛脑垂体提取物、50 ng / ml重组人表皮生长因子,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,10%胎牛血清的边后卫在5%二氧化碳(有限公司₂)和95%的空气。墨角藻黄素治疗,细胞使用0.1,1或5μ墨角藻黄素24小时。HK-2细胞缺氧/复氧(H / R)模型被称为我们的先前的报道43,44]。简而言之,HK-2细胞暴露于低氧(37°C, 1% O₂,94% N₂,5%的公司₂每天服用没有营养素)(即。,glucose-free and serum-free) medium for 12 hours to induce hypoxic injury. Subsequently, the medium was renewed, and the plates were placed in a normal cell culture incubator (5% CO₂和95%的空气)和reoxygenated 6小时根据实验设计。控制是在传统的孵化器孵化(5%股份有限公司₂和95%的空气)。

2.8。流式细胞术

细胞凋亡是评估使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包(多科学生物技术有限公司,AP101-01,中国)根据指令。HK-2细胞与不同的预处理与PBS,洗两次 收集细胞(包括文化上层清液)。细胞与500年resuspendedμl ( 。加5μl膜联蛋白V-FITC和10μlπ到每个管细胞和孵化在黑暗中在室温下5分钟。凋亡细胞检测到CytoFLEX(贝克曼库尔特生物科技(苏州)有限公司,中国)。

2.9。免疫荧光

不同的细胞,细胞治疗与4%多聚甲醛固定15分钟根据实验要求;为组织石蜡切片脱蜡和水化。0.5%的部分被permeabilized tritonx - 100在室温下10分钟。洗后用PBS,他们然后用10%的山羊血清封闭1小时在室温和孵化与兔多克隆抗体对Sirt1 / Nrf2(1: 200)在一夜之间在冰箱4°C。第二天,使用二次抗体(山羊anti-rabbit)和孵化在黑暗中在室温1小时。细胞核被用DAPI标记观察前5分钟。

2.10。小核RNA转染

小干扰rna转染HK-2细胞用于Sirt1-specific 6小时。同时,不属预定目标的核(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)被用来使转染HK-2细胞48小时作为一个消极的控制。的浓度转染核是100年μm .转染后细胞在DMEM / F12培养48小时内含有0.2%的边后卫。随后,蛋白质印迹被用来确定小干扰rna转染的影响。

2.11。细胞生存能力分析

细胞生存能力是决定使用细胞计数Kit-8 (C0037 Beyotime生物技术,中国)。简而言之,HK-2细胞接种到96孔板。24小时后孵化,细胞与不同浓度的孵化岩藻黄质(0、0.1、1、5、10、20、50μ米)为24小时。细胞培养与CCK-8试剂60分钟37°C。光密度值被发现在450 nm(美国分子设备)。

2.12。ROS水平测量

细胞内ROS水平测量根据指令的活性氧检测设备(S0033S Beyotime生物技术,中国)。短暂,HK-2细胞使用不同的试剂与10孵化μM dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA) 20分钟37°C在黑暗中。对组织来说,新鲜组织冰冻切片,然后使用Dihydroethidium intratissue ROS水平测量工具(S0063 Beyotime生物技术,中国)。冻结部分新鲜肾脏的不同治疗小鼠孵化与10μM的Dihydroethidium 37°C在黑暗中30分钟。细胞核被用DAPI标记观察前5分钟。

2.13。统计分析

所有数据都表示为 (SEM)。统计分析涉及单向方差分析(方差分析)和Student-Newman-Keuls测试。时被认为是具有统计学意义的差异 。

3所示。结果

3.1。岩藻黄质改善肾脏功能障碍和组织结构损伤后小鼠肾脏I / R

实验流程图如图1(一)。在目前的实验中,我们建立了I / R模型,并证实了墨角藻黄素的保护作用在小鼠肾I / R。与假组相比,I / R导致明显的肾功能障碍,就是明证显著增加血清包和血清铬水平。在治疗组,预处理岩藻黄质显著恢复一些肾功能损害和显示用药剂量(数字1 (b)和1 (c))。此外,他走时染色显示,I / R诱导显著的肾实质损伤,主要表现在大量的管状上皮细胞坏死,肾小管扩张,管状模式形成。100毫克/公斤岩藻黄质预处理极大地降低了管状损伤和主要保留正常肾组织结构(数据1 (d)和1 (f))。免疫组织化学显示高表达KIM-1(肾损伤Molecule-1) I / R小鼠肾组织的虚假的组相比,和墨角藻黄素消除高架KIM-1表达式(数据1 (e)和1 (g))。

3.2。岩藻黄质显著减弱氧化应激细胞凋亡在小鼠肾I / R

氧化应激是一个重要的途径引起的肾损伤I / R和肾细胞中诱导细胞死亡。与假组相比,I / R损伤明显减少肾SOD1蛋白表达,而岩藻黄质预处理明显调节肾SOD1 I / R后蛋白表达水平(数字2(一个)和2 (b))。此外,我们反映了肾脏组织通过检测她ROS水平。如图所示,肾I / R可以显著提高她荧光强度比虚假的集团,而岩藻黄质预处理显著降低荧光强度在剂量依赖性的方式(数字2 (c)和2 (d))。

我们之前的研究表明,氧化应激在I / R损伤导致严重的细胞凋亡,而氧化应激剂NAC抑制氧化应激,降低细胞凋亡(43]。因此,为了进一步评估后的墨角藻黄素对细胞凋亡的影响肾I / R,我们检查了一系列apoptosis-related蛋白质的表达。正如所料,肾I / R损伤显著降低的水平apoptosis-protecting bcl - 2蛋白和显著调节apoptosis-promoting蛋白质伯灵顿的水平和裂解caspase-3相比虚假的组。然而,预处理小鼠岩藻黄质逆转apoptosis-related蛋白质水平的变化(数据2 (e)- - - - - -2 (h))。此外,免疫组织化学检测caspase-3结果与免疫印迹结果一致(数字2(我)和2 (j))。TUNEL染色结果,apoptosis-positive肾细胞数量显著增加I / R后与虚假的集团相比,预处理的老鼠和岩藻黄质显著降低TUNEL-positive细胞(数据的数量2 (k)和2(左))。这些结果表明,墨角藻黄素能有效地减弱后小鼠肾脏细胞凋亡引起的氧化应激I / R。

3.3。体外,墨角藻黄素抑制细胞凋亡引起的氧化应激后H / R

调查的影响岩藻黄质HK-2细胞暴露于H / R条件,我们首先执行CCK-8确定墨角藻黄素的最佳浓度。与墨角藻黄素HK-2细胞预处理后24 h在常氧条件下,HK-2细胞的生存能力下降,当浓度达到10 85%μM,岩藻黄质明显细胞毒性。因此,我们决定岩藻黄质浓度的0.1,1,5μM(图3(一个))。随后,我们进一步研究了墨角藻黄素对HK-2细胞的氧化应激的影响后进行H / R。如图所示,SOD1蛋白质的表达水平是减少HK-2细胞接触后H / R与对照组相比,虽然岩藻黄质预处理明显调节SOD1蛋白质的表达水平(数字3 (b)和3 (c))。同样,H / R明显调节HK-2细胞ROS水平,而岩藻黄质有效逆转ROS变化(数据3 (d)和3 (e))。

在体外,我们进一步验证了墨角藻黄素对氧化压力诱导细胞凋亡的影响。与对照组相比,bcl - 2蛋白表达明显减少HK-2 H / R组的细胞,但伯灵顿和裂解caspase-3蛋白表达显著增加。和相反的蛋白表达变化与岩藻黄质而观察到预处理 集团(数据3 (f)- - - - - -3(我))。此外,流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果也与免疫印迹结果一致。和5μ墨角藻黄素的最强的凋亡效应(数字3 (j)和3 (k))。因此,岩藻黄质浓度是5μ在所有后续体外实验。

3.4。Sirt1 / Nrf2 HO-1 HK-2细胞信号通路被激活后,墨角藻黄素H / R

进一步探索潜在的机制,可能构成墨角藻黄素的抗氧化应激和衰减HK-2凋亡的细胞,我们检查了一系列相关的蛋白质。我们发现,Sirt1蛋白质的表达水平明显降低当HK-2细胞暴露在H / R与对照组相比,Nrf2的表达水平及其下游HO-1也显著降低。相比之下,墨角藻黄素预处理明显调节Sirt1的表达在HK-2细胞H / R, Nrf2的蛋白质含量和HO-1也由岩藻黄质调节(数字4(一)- - - - - -4 (d))。此外,HK-2细胞的免疫荧光显示,岩藻黄质预处理的红色荧光强度显著增强Sirt1在HK-2细胞蛋白H / R,由半定量的分析更直观地展示了人物4 (e)和4 (f))。此外,有趣的是,我们发现核易位Nrf2墨角藻黄素抑制氧化应激可能是至关重要的。如图,在对照组,Nrf2的绿色荧光强度高,并表示在细胞质和细胞核;而在人力资源 组,Nrf2的绿色荧光强度显著降低,Nrf2的表达是局限于细胞核;然而,岩藻黄质预处理显著调节Nrf2的绿色荧光强度,进一步提升核易位Nrf2(数字4 (g)和4 (h))。这些数据表明,岩藻黄质可以促进Nrf2核易位和激活其下游HO-1抵制H / R-induced Sirt1激活氧化应激和细胞凋亡。

3.5。抑制Sirt1逆转墨角藻黄素的保护作用HK-2细胞体外

进一步阐明Sirt1在墨角藻黄素的凋亡效应的意义,我们使用了Sirt1的选择性抑制剂,EX527,核抑制Sirt1的表情。正如所料,EX527可以废除upregulation Sirt1的墨角藻黄素在某种程度上,和si-Sirt1 Sirt1击倒的效果更明显。此外,蛋白质的表达Nrf2和HO-1 fucoxanthin-pretreated HK-2细胞也显著下调EX527和si-Sirt1(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。

随后,我们进一步探讨了Sirt1抑制氧化应激和细胞凋亡的影响。SOD1的蛋白表达显著增加了岩藻黄质与H / R组相比,然后这个增加显著抑制EX527和si-Sirt1(数字5 (e)和5 (f)),抑制ROS的墨角藻黄素大大抑制了EX527和si-Sirt1(数字5 (g)和5 (h))。此外,nhibition Sirt1岩藻黄质显著抑制凋亡的能力,如图,抑制Sirt1显著降低apoptosis-protective bcl - 2蛋白的表达,增加了伯灵顿proapoptotic蛋白质的表达和裂解caspase-3(数字5(我)- - - - - -5(左))。与此同时,HK-2细胞凋亡率也显著调节EX527和si-Sirt1(数字5(米)和5 (n))。

3.6。体内,岩藻黄质调节Sirt1 / Nrf2 HO-1蛋白表达在小鼠肾I / R

与虚假的集团相比,肾Sirt1的蛋白表达水平明显下降了I / R,和红外和没有显著区别 组。相比之下,预处理和岩藻黄质显著调节Sirt1蛋白表达在小鼠的肾脏。ddition,当老鼠接受肾I / R, Nrf2和HO-1蛋白质表达水平的肾脏明显减少,和岩藻黄质显著逆转这种变化(数据6(一)- - - - - -6 (d))。免疫荧光检测结果Sirt1和Nrf2肾组织也与西方墨点法(数据的结果一致6(我)和6 (j))。

3.7。共同服用EX527,岩藻黄质提升的氧化损伤引起的肾I / R在老鼠身上

然后我们继续压制Sirt1体内探索的机制岩藻黄质变弱肾I / R损伤。结合预处理的老鼠岩藻黄质和EX527明显下调Sirt1的蛋白表达和显著抑制Nrf2 HO-1蛋白质表达水平相比fucoxanthin-treated组(数字6 (e)- - - - - -6 (h))。肾组织免疫荧光也证实,墨角藻黄素的移植Sirt1 Nrf2蛋白质表达水平极大地消除了EX527(数字6(我)和6 (j))。

然后,我们检查了EX527对氧化应激的影响细胞凋亡在I / R后小鼠肾脏。正如预期的那样,联合使用岩藻黄质和EX527明显抑制SOD1蛋白(数据的表达7(一)和7 (b)),而显著上调在肾组织的红色荧光强度数据7 (c)和7 (d))。在apoptosis-related蛋白质的结果,EX527显著下降bcl - 2蛋白的表达显著调节伯灵顿的表达和裂解caspase-3蛋白质与墨角藻黄素组(数据相比7 (e)- - - - - -7 (h))。墨角藻黄素的能力减少TUNEL-positive细胞也被EX527 TUNEL染色结果(数据7(我)和7 (j))。这些结果表明,抑制Sirt1的岩藻黄质显著抑制效果衰减肾I / R损伤小鼠。

4所示。讨论

在目前的实验中,我们调查的角色岩藻黄质在小鼠肾I / R损伤,探索其潜在机制。首先,我们确定的角色岩藻黄质肾的经典动物模型I / R损伤。我们的结果表明,预处理岩藻黄质减毒肾脏功能障碍,减少组织结构性破坏,减少氧化应激小鼠的细胞凋亡在I / R损伤。随后,我们发现岩藻黄质预处理HK-2细胞暴露于H / R同样减毒氧化压力诱导细胞凋亡。此外,我们发现岩藻黄质可以激活Sirt1 / Nrf2 HO-1信号通路在I / R损伤或H / R损伤的保护作用岩藻黄质可以通过药理抑制剂Sirt1或si-RNA。因此,我们的研究结果表明,墨角藻黄素变弱肾ischemia-reperfusion-induced肾损伤通过激活Sirt1 / Nrf2 / HO-1信号通路,和墨角藻黄素可能小说在肾缺血性损伤的治疗代理。

急性肾损伤是一种临床综合症,其特征是突然减少肾小球滤过率与高发病率和死亡率(45]。大约7%的住院病人和近35%的病人在重症监护患有阿基。在危重患者中,阿基死亡率可能超过50% (46]。阿基的不良预后与慢性肾脏疾病和终末期肾病(47,48]。肾缺血再灌注损伤是公认阿基的常见原因,这可能是由于各种临床因素(6]。多种病理过程是导致阿基由于肾I / R损伤,包括氧化应激、炎症反应、血管损伤,细胞坏死和细胞凋亡(49]。大量研究报道,氧化应激与I / R-induced AKI。肾脏血流再灌注期间产生过多的活性氧,从而导致氧化损伤生物分子和加重缺血组织损伤(50,51]。因此,抑制氧化应激可能是一个有效的方法来治疗肾I / R损伤。墨角藻黄素是一种海洋类胡萝卜素具有独特的化学结构。之前的研究表明,墨角藻黄素具有很强抗氧化应激能力清除活性氧过剩各种疾病(38,39,52]。在目前的研究中,我们发现,预处理和墨角藻黄素肾功能衰减,减少组织结构损伤由于I / R损伤小鼠。墨角藻黄素SOD1蛋白表达增加组织和回收I / R创伤性ROS剂量依赖性的方式。我们以前的研究表明,氧化应激在肾I / R损伤导致严重的细胞凋亡(43]。我们进一步检查apoptosis-related蛋白质的表达水平在fucoxanthin-pretreated小鼠的肾脏。后肾的发生I / R损伤,apoptosis-protective bcl - 2蛋白的表达明显抑制,伯灵顿apoptosis-promoting蛋白质的表达和裂解caspase-3显著增加小鼠肾脏,而岩藻黄质预处理推翻了一些蛋白质的变化。此外,TUNEL染色结果表明,墨角藻黄素apoptosis-positive细胞的数量明显减少。同样地,我们发现在体外细胞实验结果一致。岩藻黄质显著减弱氧化应激在HK-2细胞凋亡后H / R。

Sirt1是一种NAD⁺端依赖脱乙酰酶起着重要的作用在许多细胞活动通过其脱乙酰作用函数,包括基因转录、细胞衰老、凋亡和能源压力(12,13,53]。众多的研究表明,肾缺血性疾病,激活Sirt1明显变弱肾损伤(23,24]。例如,在糖尿病肾缺血再灌注损伤的一项研究中,研究人员使用白藜芦醇激活Sirt1显著减弱引起的内质网应激和细胞的肾I / R损伤在糖尿病大鼠(54]。此外,特定的超表达Sirt1的化疗药物顺铂引起的肾脏在阿基过氧物酶体保存功能,防止急性肾损伤(55]。Nrf2是一个转录因子表达在不同的细胞类型,代理上游的抗氧化防御系统和氧化还原内稳态的调节中发挥着重要作用(56]。在正常情况下,Nrf2主要定位于细胞质和Keap1形式复杂,这是固定在肌动蛋白细胞骨架。当诱导物,如氧化分子,破坏Keap1-Nrf2复杂,Nrf2 Keap1分离并迁移到细胞核。在细胞核,Nrf2绑定到5 - - - - - -上游调节抗氧化反应元素(是)地区下游基因(HO-1和NQO1)和促进他们的转录活动57,58]。最近的研究表明,Sirt1可能是上游调控目标Nrf2-ARE和激活Sirt1可能作用于Nrf2通过其脱乙酰作用[59]。此外,Sirt1激活报道Nrf2-ARE通路在肾小球细胞类囊体29日]。目前的研究表明,墨角藻黄素是一种强有力的Sirt1激活。例如,墨角藻黄素,缓解了高glucose-induced氧化应激,抑制肾纤维化通过一种蛋白激酶/ Sirt1 / FoxO3α信号通路(60]。在一个研究蛛网膜下腔出血,岩藻黄质减少氧化损伤通过Sirt1-dependent途径(39]。此外,墨角藻黄素Sirt1 /激活AMPK信号通路抑制脂质积累在肝细胞(61年]。在我们的研究中,我们发现I / R或H / R损伤导致显著降低Sirt1的表达式,而岩藻黄质显著增加Sirt1的表达式。此外,我们对转录因子的蛋白表达水平Nrf2及其下游HO-1。我们发现Nrf2和HO-1的表达显著下调后的发生I / R或H / R损伤,而岩藻黄质显著调节的蛋白表达水平Nrf2 HO-1。此外,HK-2细胞的免疫荧光显示岩藻黄质提升Nrf2核易位。随后,我们使用EX527抑制Sirt1的体内和体外,Sirt1的选择性抑制剂或si-Sirt1,发现Nrf2和HO-1的表达也显著抑制,和墨角藻黄素对氧化应激的抑制作用和减少细胞凋亡被Sirt1抑制急剧逆转。

氧化应激是缺血性疾病的发病机制的主要因素包括肾I / R损伤,在过度氧化应激导致线粒体功能障碍,能量代谢异常,最终细胞凋亡(62年]。类胡萝卜素是天然抗氧化剂,广泛使用在性质和在氧化应激相关疾病的治疗有很大的优势(32]。研究表明,墨角藻黄素能有效地抑制氧化应激和发挥生物活性的受体激动剂Sirt1或者Nrf2在缺血性中风等疾病,蛛网膜下腔出血,酒精肝损伤和肾纤维化38,39,58,63年]。此外,另一个海洋类胡萝卜素:虾青素,主要发现在大马哈鱼,蟹,虾,和海藻,以其强大的抗氧化和消炎作用[64年]。与植物、动物和人类不能合成的类胡萝卜素,必须获得他们通过饮食32]。因此,食用类胡萝卜素具有潜在的优势成为一种新的抗氧化剂治疗。总之,我们的研究表明,墨角藻黄素变弱氧化损伤,清除ROS在肾缺血再灌注损伤和过度生产的机制可能与激活Sirt1 / Nrf2 / HO-1信号通路。

5。结论

总之,我们的结果表明,我们最初显示海洋类胡萝卜素岩藻黄质肾保护作用的I / R损伤。此外,我们发现,墨角藻黄素抑制氧化应激通过激活细胞凋亡在I / R损伤的Sirt1 / Nrf2 / HO-1信号通路。然而,岩藻黄质作用于肾I / R损伤是否通过其他机制仍需进一步探索,Sirt1相互作用的具体机制和Nrf2也需要深入研究。总之,我们的研究表明,墨角藻黄素可能成为一种新型药物肾缺血性疾病的治疗,Sirt1 / Nrf2 HO-1信号通路可能成为新的治疗目标。

缩写

阿基:	急性肾损伤
bcl - 2:	b细胞淋巴瘤2
包子:	血尿素氮
克雷格:	肌酸酐
DCFH-DA:	Dichlorodihydrofluorescein二乙酸
她:	Dihydroethidium
外汇:	墨角藻黄素
HO-1:	血红素oxygenase-1
H / R:	缺氧/复氧
HK-2:	人肾近端小管上皮细胞线
我/ R:	缺血/再灌注
南京:	N-acetyl-cysteine
NQO1:	NAD (P) H醌氧化还原酶1
Nrf2:	核转录因子2红细胞两个相关因素
ROS:	活性氧
核:	小干扰RNA
Sirt1:	无声的信息监管机构1
SOD1:	超氧化物歧化酶1
TUNEL:	终端原位dUTP尼克末端标记。

数据可用性

本研究的数据集可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

胡锦涛毛和王磊的贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。82000639)。

补充材料

图S1:墨角藻黄素的化学结构图。图2图S2:免疫印迹的数据。图3图S3:免疫印迹的数据。图4图S4:免疫印迹的数据。图5图S5:免疫印迹的数据。图6图S6:免疫印迹的数据。图7图S7:免疫印迹的数据。(补充材料)