文摘

心房利钠肽(ANP)、规范心脏激素,主要从心房细胞分泌,参与体液的规定,血压体内平衡,和抗氧化剂。缩胆囊素(CCK)也作为小说心脏心肌细胞激素和诱发多种心血管规定。然而,CCK的直接作用在心房机械动力学和ANP分泌尚不清楚。目前的研究旨在探讨CCK的影响八肽(CCK-8)心房动力学和ANP分泌的调节。实验中执行包括大鼠心房跳动。ANP用放射免疫检定法测量。过氧化氢(H的水平2O2)和花生四烯酸(AA)使用ELISA试剂盒测定。的水平相对蛋白质和信使rna被免疫印迹和RT-qPCR检测。结果表明,硫酸CCK-8 (CCK-8s)而不是desulfated CCK-8磷酸化水平增加胞质磷脂酶A2和AA释放通过CCK受体的激活。这导致了upregulation NADPH氧化酶4 (NOX4)表达水平和H2O2生产和发挥了负性肌力影响心房机械动力学通过ATP-sensitive钾离子通道的激活和large-conductance calcium-activated钾离子通道。此外,CCK-8s-induced NOX4随后调节过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)coactivator-1α(PGC-1α)表达水平通过激活p38增殖蛋白激酶以及丝氨酸/苏氨酸激酶信号传导,最终促进通过激活PPAR ANP的分泌α和PPARγ。在ANP受体抑制剂的存在,CCK-8-induced AA释放增加,H2O2生产,猫NOX4表达式的upregulation CCK-8s引起的增强,但SOD表达式被废除了。这些发现表明,CCK-8s促进通过激活NOX4-PGC-1 ANP的分泌α-PPARα/ PPARγ信号,ANP参与抵抗NOX4表达式和活性氧的生产和监管SOD表达式。

1。介绍

心房利钠肽(ANP)、心脏激素,合成和分泌主要来自心房细胞的伸展和其他刺激;它主要是参与体液调节音量和血压1- - - - - -3]。此外,ANP anti-ischemic [4,抗炎5],antihypertrophic [6),和抗癌7]属性。虽然很少有人了解之间的关系ANP和活性氧(ROS)在生理条件下生产或在心血管疾病的发展,ANP与重要的抗氧化剂防御心肌细胞和血管细胞(5]。

缩胆囊素(CCK)是一种肠道激素和古典的有力刺激胆囊收缩,被发现在小肠粘膜提取在1920年代(8,9]。随后,CCK也被发现在神经元10)、免疫细胞(11)、肾细胞和肺细胞(12]。Pro-CCK加工成几个分子形式,如CCK-58 CCK-33, CCK-22, CCK-8, CCK-4;然而,硫酸羧基末端CCK八肽(CCK-8)是CCK的主要生物活性片段,保留了大部分的CCK的生物活性。CCK受体(CCK的两种类型1(CCK受体1R)和CCK2(CCK受体2R))已被列为受体属于G protein-coupled总科(GPCRs)及其分布是tissue-dependent [12- - - - - -14]。最近,它已被证实,pro-CCK CCK,及其受体表达的哺乳动物心肌细胞(15,16]。研究表明,CCK有生理角色在调节血压17)和心率(15和能增强心脏收缩性18]。此外,CCK可以减轻纤维化noninfarcted地区和延迟左心室重构和心脏衰竭的进展在左冠状动脉结扎诱导大鼠的心肌梗死19]。然而,postinfarction心衰的发展与upregulation CCK水平与心脏功能参数和脑利钠肽水平(20.]。此外,信使rna和蛋白质CCK水平增加大鼠肥厚性心肌组织的,它的变化呈正相关,左心室壁厚[12]。在心力衰竭患者的临床研究,提高血浆CCK与老年女性的死亡率(21]。因此,CCK信号诱发多种心血管生理学和病理生理学的影响。不过,CCK的直接作用在心房的规定机械动力学和ANP分泌尚未确定。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶类(nox)、活性氧的主要酶源在心血管系统,激活特定的心血管疾病(22]。以前,我们发现NOX4,由磷脂酶A2 (PLA2),参与ANP分泌的调节隔离大鼠心房跳动在缺氧条件下(23]。此外,它已被证实CCK的不敏感1R磷酸肌醇信号百日咳毒素(PTX)表明它夫妇通过Gq的G蛋白家族,从而连接与PLA2-arachidonic酸(AA)途径调解钙振荡和淀粉酶分泌(24,25]。相比之下,CCK2R是耦合的两个途径通过PTX-sensitive PTX-insensitive G蛋白质,导致AA释放的调节PTX-sensitive G蛋白(24,26)和增殖蛋白激酶(MAPK)信号通路24,27]。由于PLA2-AA信号NOX4活动的影响及其心房ANP分泌的调控作用[23,28),我们假设CCK调节ANP分泌通过激活NOX4通过PLA2-AA信号。本研究验证假设使用CCK-8隔离灌注大鼠心房跳动。这项研究表明,硫酸CCK-8 (CCK-8s)而不是desulfated CCK-8促进ANP分泌通过激活NOX4-peroxisome proliferator-activated受体γ(PPARγ)coactivator-1α(PGC-1α)-PPARα/ PPARγ信号,CCK-8s-induced ANP参与的阻力NOX4表达式和活性氧的生产和监管SOD的表达式。

2。材料和方法

2.1。灌注的大鼠心房跳动的模型在体外

所有动物实验研究进行了综述和批准的延边大学动物保健和使用委员会制度,并按照国家卫生研究院的实验动物保健指南。特定的无菌(SPF) Sprague-Dawley (SD)大鼠(250 ~ 300克,18周,男)获得延边大学实验动物中心(实验动物使用许可证号码:SYXK (Ji) 2020 - 0009),准备打老鼠心房灌注模型。老鼠的环境温度是18°C ~ 26°C,相对湿度为40% ~ 70%,光周期是12 h光明/黑暗,和水可以随意和一个标准的饮食。无菌生理盐水被用来准备戊巴比妥钠溶液,和SD大鼠腹腔麻醉的剂量90毫克/公斤。立即开胸了,左心房的老鼠是收获,固定在一个白手起家的大鼠心房跳动灌注设备。每个大鼠左心房受到心房电刺激,和一个蠕动泵用于注入消息灵通的缓冲区和实验所需的试剂的心房以恒定速率1.0 mL / min。连续供氧是维持以及一个心房温度36°C。消息灵通的缓冲区包含(118.0毫米)氯化钠,氯化钾的4.7,2.5 CaCl21.2 MgCl225.0 NaHCO310.0,10.0葡萄糖,玫瑰与氢氧化钠(pH值7.4),和0.1% BSA。

2.2。实验方案和治疗试剂
2.2.1。实验分组和治疗试剂

大鼠随机分为18个不同的组:(1)控制;(2)CCK-8s(硫酸缩胆囊素八肽,100.0点;- 200741;德国Eurogentec);(3)CCK-8d (desulfated缩胆囊素八肽,100.0点;HY-P0196A;美国MedChemExpress);(4)Loxiglumid (CCK的拮抗剂1R, 0.5毫米;HY-B2154;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(5)YM022 (CCK的拮抗剂2R, 70.0点;hy - 103355;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(6)u - 73122(一种抑制剂的磷脂酶C (PLC), 10.0μΜ;hy - 13419;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(7)CAY10650(胞质磷脂酶A2抑制剂(cPLA2)、120.0 nM;hy - 10801;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(8)GLX351322 (NADPH氧化酶的抑制剂4 (NOX4), 25.0μΜ;hy - 100.0111;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(9)GLX351322 (25.0μΜ);(10)格列本脲(抑制剂ATP-sensitive钾(K三磷酸腺苷)频道,0.1Μ;PHR1287;美国Sigma-Aldrich) + CCK-8s(100.0点);(11)加- 021(拦截器large-conductance calcium-activated钾(BKCa),30.0μΜ;hy - 101422;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(12)SB239063 (p38 MAPK的拮抗剂,15.0μM;hy - 11068;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(13)LY294002(丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(一种蛋白激酶),10.0μΜ;hy - 10108;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(14)sr - 18292(过氧物酶体拮抗剂proliferator-activated受体γ(PPARγ)coactivator-1α(PGC-1α),50.0μΜ;hy - 101491;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(15)GW6471 (PPAR的拮抗剂α,10.0μM;hy - 15372;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(16)GW9662 (PPAR的抑制剂γ,0.1μM;hy - 16578;美国MedChemExpress) + CCK-8s(100.0点);(17)A71915 (ANP的拮抗剂,0.3μΜ;SML2908;美国Sigma-Aldrich) + CCK-8s(100.0点);(18)A71915 (0.3μΜ)。

2.2.2。试验协议

每个第一次灌注稳定左心房60分钟,其次是6周期的再灌注根据实验组,每个周期12分钟,如表所示1。评估的影响CCK-8心房脉冲压力和ANP分泌,两个周期控制时期,后注入CCK-8s或CCK-8d四周期。在另一个系列的实验中,一个周期的控制时期之后,一个周期的治疗试剂,然后CCK-8s连续四个周期的治疗试剂的存在。测试的影响GLX和A71心房脉冲压力和ANP分泌,控制时期五GLX周期或A71紧随其后。心房都收获结束后立即灌注和低温贮藏在-80°C的后续实验。

表1
实验性的协议。
2.3。测定ANP和脉压

如前所述(23),发现了ANP水平的灌流液使用碘[125年我]心房利钠因子等装备(北生物技术研究所、北京、中国)。心房脉压变化记录使用多道生理信号采集系统(RM6240BD, 1.5赫兹,0.3毫秒,35.0 V;成都,中国)通过压力感受器(斯坦森P23Db;美国加利福尼亚州奥克斯纳德)。

2.4。ELISA

过氧化氢(H的水平2O2)和AA在相同体积的大鼠左心室裂解方案确定使用老鼠H2O2酶联免疫试剂盒和大鼠AA酶联免疫试剂盒;这些包从SinoBestBio购买(上海,中国)

2.5。免疫印迹分析和抗体

左心房细胞溶解和均质充分使用缓冲区里帕(高)(R0010 Solarbio科技;北京,中国在冰浴)。蛋白质量化就使用一个增强的BCA执行分析工具包(P0009 Beyotime;中国上海)。样品受到蛋白质变性5×钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)加载缓冲区(ComWin生物技术;北京,中国)。变性在8%或15% sds - page凝胶电泳样品在室温下。电泳后,分离蛋白质从凝胶转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜使用潮湿的传输方法和转移60分钟或90分钟在4°C。沾上污渍的膜被封锁的5%脱脂奶粉在PBS 2 h在室温下,紧随其后的是孵化主要抗体在一夜之间在4°C。第二天,孵化与二次抗体2 h后,膜洗了30分钟,使用一个敏感的发射极耦合逻辑开发的化学发光检测设备(PK10002 Proteintech; Wuhan, China). The bands were analyzed grayscale using ImageJ (National Institutes of Health; Bethesda, USA) software, and the results of the analysis were normalized.

以下抗体被用于这个实验:CCK抗体1R (DF4914), CCK抗体2R (DF2793),抗体phospho-cPLA2 (Ser505) (AF3329)抗体的cPLA2 (AF6329)抗体的NOX4 (DF6924) PGC-1的抗体αphospho-PPAR (AF5395)抗体α(Ser12) (AF8392), PPAR的抗体αphospho-PPAR (AF5301)抗体γ(Ser112) (AF3284), PPAR的抗体γ(AF6284)、超氧化物歧化酶(SOD)的抗体(AF5144)、过氧化氢酶(CAT)的抗体(DF7545)抗体的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) (DF6701)抗体的phospho-pan-AKT1/2/3 (Ser473) (AF0016)和抗体pan-AKT1/2/3 (AF6261)都是购买的亲和力生物科学(江苏,中国)。抗体的phospho-p38 MAPK (Thr180 / Tyr182)多克隆(28796 - 1 - ap),抗体p38 MAPK的多克隆(14064 - 1 - ap),以及合山羊anti-rabbit免疫球蛋白都从Proteintech购买(武汉,中国)。利钠肽(NPPA)兔帕布(A14755)和β肌动蛋白兔马伯(高稀释)(AC026)从ABclonal技术(武汉,中国)。

2.6。RT-qPCR

总之,从左心房组织总RNA提取使用RNApure总RNA工具包(RN03 Aidlab;北京,中国)。第一链cDNA然后由高性能逆转录合成使用SweScript RT我第一次链cDNA合成工具包(G3330 Servicebio;武汉,中国)。最后,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)执行了2×SYBR绿色qPCR主混合(高火箭)(G3322 Servicebio;武汉,中国)。结果计算使用2- - - - - -ΔΔCT相对量化方法和规范化。引物序列见表2。

表2
引物序列。
2.7。统计分析

统计分析是由单向方差分析和双向方差分析与图基的多重比较测试使用GraphPad Prism 9.0 (GraphPad软件;美国圣地亚哥)。所有数据是正态分布(Kolmogorov-Smirnov测试)和作为 (SEM)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。CCK-8对ANP的分泌和心房动力学的影响

确定CCK-8对心房动力学的影响和ANP分泌,CCK-8s和CCK-8d用于实验。在隔离大鼠心房跳动,注入CCK-8s显著增加ANP分泌和抑制心房脉冲压力( 与控制阶段;数据1(一)和1 (b)时间的方式)。与此同时,CCK-8d明显抑制心房脉冲压力( 与控制阶段;图1 (d)),但并不影响ANP分泌(图1 (c))。在CCK的存在1R和CCK2R拮抗剂,Loxiglumid YM022, CCK-8s-induced完全废除了ANP分泌增加( 仅与CCK-8s时期;数据1 (e)和1 (g))。CCK-8s-induced抑制心房脉冲压力几乎完全被Loxiglumid ( 仅与CCK-8s时期;图1 (f)),尤其是减毒YM022 ( 仅与CCK-8s时期;图1 (h))。此外,CCK的表达式1R和CCK2R明显调节在心房组织注入CCK-8s而不是CCK-8d ( 与对照组;数据1(我)1 (k))。结果表明,硫酸而不是desulfated CCK-8能够通过CCK受体和促进ANP分泌有负性肌力作用的机械动力学模型包括大鼠心房跳动。

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图1
CCK-8 ANP分泌作用和动态及其对CCK受体表达的影响在孤立的大鼠心房跳动。(a, c, e, g)心房ANP分泌等。(b、d、f、h)心房RM6240BD脉压。(我)蛋白表达的CCK水平1R和CCK2R被免疫印迹检测。(j, k)免疫印迹的统计直方图表示为乐队规范化和密度β肌动蛋白。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;CCK-8d: desulfated CCK-8;罗:Loxiglumid CCK的拮抗剂1受体;YM: YM022 CCK的拮抗剂2受体。数据表示为 。(a) ;(i (k) 。 和控制周期或一组;# # # 与CCK-8s时期或一组;ns:不重要。
3.2。PLC和cPLA2 CCK-8s-Induced ANP分泌的影响

CCK受体夫妇Gq PLC和PLA2蛋白,随后导致下游信号(24- - - - - -27]。因此,调查的机制CCK-8s促进ANP分泌,影响CCK-8s p-cPLA2的水平及其在ANP分泌作用观察。如图2,p-cPLA2的水平明显增加心房组织后注入CCK-8s ( 与对照组;数据2(一个)2 (c)),被预处理与CCK受体拮抗剂( 与CCK-8s组;数据2(一个)和2 (b)PLC)和U73122抑制剂( 与CCK-8s组;数据2(一个)和2 (c))。此外,注入CCK-8s增加ANP分泌也阻止了预处理和U73122 ( 仅与CCK-8s时期;图2 (d))和CAY10650 cPLA2抑制剂( 仅与CCK-8s时期;图2 (f)),而CCK-8s-induced抑制脉冲压力并不影响U73122和CAY10650(数字2 (e)和2 (g))。数据表明,PLC和cPLA2调解的过程CCK-8s-induced心房ANP分泌增加。

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图2
CCK-8s和PLC对cPLA2表达的影响及其在ANP分泌作用和动态分离大鼠心房跳动。(a)的蛋白表达水平p-cPLA2被免疫印迹检测。(b, c)免疫印迹的统计直方图表示为带密度规范化和t-cPLA2。(d, f)心房ANP分泌等。(e, g)心房RM6240BD脉压。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;罗:Loxiglumid CCK的拮抗剂1受体;YM: YM022 CCK的拮抗剂2受体;U: U - 73122 PLC的抑制剂;礁:CAY10650 cPLA2的抑制剂。数据表示为 。(两者) ;(d) 。 和 和控制周期或一组;# # 和# # # 与CCK-8s时期或组。
3.3。CCK-8s对NOX4表达的影响及其在ANP分泌作用

根据CCK-8s p-cPLA2的水平和所扮演的角色的影响cPLA2 AA释放和NOX4激活(29日),AA的水平,NOX4表情,和H2O2生产由CCK-8s被观察到。结果表明,AA的水平显著增加在心房组织注入CCK-8s ( 与对照组;图3(一个)),这是被预处理与CCK受体的拮抗剂和U73122 ( 和 与CCK-8s组;图3(一个))。此外,NOX4的表达显著调节在CCK-8s-infused心房组织( 与对照组;数据3 (b)3 (d));这种效应被CCK受体的拮抗剂和CAY10650预处理( 与CCK-8s组;数据3 (b)3 (d))。H的水平2O2也明显增加心房组织灌注后CCK-8s ( 与对照组;图3 (e)),它废除了预处理与CCK受体拮抗剂( 与CCK-8s组;图3 (e))。此外,在GLX351322 NOX4的抑制剂,CCK-8s-induced ANP分泌增加(没有被观察到 仅与CCK-8s时期;图3 (f)),抑制心房脉冲压力也删除( 和控制周期和CCK-8s周期; 仅与GLX351322时期;图3 (g))。在格列本脲的存在,一种抑制剂的K三磷酸腺苷,在心房ANP CCK-8s分泌的影响和机械动力学被移除( 分别与CCK-8s独自时期;数据3 (h)和3(我)),汉堡王的拦截器Ca,加- 021,模仿格列本脲的作用( 分别与CCK-8s独自时期;数据3 (j)和3 (k))。这些结果表明CCK-8s调节通过cPLA2-AA NOX4信号的表达,从而增加ANP的分泌和施加负性肌力影响心房机械动力学,K三磷酸腺苷和汉堡王Ca被涉及到。

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CCK-8s对NOX4表达的影响及其在ANP分泌作用和动态分离大鼠心房跳动。(a)水平的AA测试的ELISA方法。(b)的蛋白表达水平NOX4被免疫印迹检测。(c, d)免疫印迹的统计直方图表示为乐队规范化和密度β肌动蛋白。(e)的H2O2由ELISA检测。(f、h、j)心房ANP分泌等。(g, k)心房RM6240BD脉压。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;罗:Loxiglumid CCK的拮抗剂1受体;YM: YM022 CCK的拮抗剂2受体;U: U - 73122 PLC的抑制剂;礁:CAY10650 cPLA2的抑制剂;GLX: GLX351322 NOX4的抑制剂;Gli:格列本脲,K的抑制剂三磷酸腺苷;加:加- 021,BK的拦截器Ca。数据表示为 。(安妮) ;(f - k) 。 和控制周期或一组;# # 和# # # 与CCK-8s时期或组。
3.4。影响CCK-8s-Induced NOX4 p38 MAPK和Akt表达式

按照活动之间的关系的NOX4-dependent p38 MAPK轴和细胞氧化损伤(30.)的影响CCK-8s-induced NOX4 p38 MAPK和Akt蛋白表达在心房组织注入CCK-8s被观察到。数据显示CCK-8s明显增加了水平的磷酸化p38 MAPK (p-p38), ( 与对照组;数据4(一)和4 (b))和磷酸化Akt (p-Akt) ( 与对照组;数据4(一)和4 (c)),由GLX351322消除( 和 与CCK-8s组;数据4(一)4 (c))。此外,CCK-8s-induced ANP分泌被p38 MAPK和Akt抑制剂,SB239063和LY294002 ( 仅与CCK-8s时期;数据4 (d)和4 (f)),而心房脉冲压力诱导的抑制CCK-8s没有明显改变了SB239063和LY294002(数字4 (e)和4 (g))。这些结果表明,p38 MAPK和Akt由NOX4参与CCK-8s-induced ANP分泌的调节。

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p38 MAPK和Akt ANP CCK-8s引起的分泌和动力学在孤立的大鼠心房跳动。(a)的蛋白表达水平p-p38 MAPK和p-Akt被免疫印迹检测。(b)免疫印迹的统计直方图表示为带密度规范化和t-p38。(c)免疫印迹的统计直方图表示为带密度规范化和t-Akt。(d, f)心房ANP分泌等。(e, g)心房RM6240BD脉压。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;GLX: GLX351322 NOX4的抑制剂;某人:SB239063 p38 MAPK的对手; LY: LY294002, an inhibitor of Akt. Data were expressed as 。(两者) ;(d) 。 , ,和 和控制周期或一组;# , # # ,和# # # 与CCK-8s时期或组。
3.5。CCK-8s对PGC-1的表达式α和PPARα以及PPARγ

下游机制,探讨p38 MAPK和Akt调节ANP的CCK-8s-induced增加分泌,影响CCK-8s PGC-1的表达式α和PPARα以及PPARγ测定。CCK-8s特别是调节PGC-1的表达α( 与对照组;数据5(一个)5 (c)),由SB239063废除和LY294002 ( 和 分别与CCK-8s集团;数据5(一个)5 (c))。在SR18292面前,PGC-1的拮抗剂αANP的CCK-8s-induced增加分泌(没有被观察到 仅与CCK-8s时期;图5 (d)),而脉冲压力诱导的抑制CCK-8s增强( 仅与CCK-8s时期;图5 (e))。

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在PGC-1 CCK-8s的影响α表达及其对ANP分泌的作用和动态分离大鼠心房跳动。(一)PGC-1的蛋白表达水平α被免疫印迹检测。(b, c)免疫印迹的统计直方图表示为乐队规范化和密度β肌动蛋白。(d)心房ANP分泌等。(e)心房RM6240BD脉压。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;某人:SB239063 p38 MAPK的对手;LY: LY294002, Akt抑制剂;SR: SR - 18292, PGC-1的拮抗剂α。数据表示为 。(两者) ;(d, e) 。 和控制周期或一组;# # 和# # # 与CCK-8s时期或组。

此外,CCK-8s PPAR的mRNA水平明显增加α和PPARγ( 与对照组;数据6(一)和6 (b)),伴随upregulation p-PPARα和p-PPARγ蛋白表达水平( 与对照组;数据6 (c)6 (e))。PPAR的CCK-8s-induced增加α和PPARγ信使rna被SR18292(特别是抑制 与CCK-8s组;数据6(一)和6 (b)),PPAR的蛋白表达水平α和PPARγ也被SR18292 ( 与CCK-8s组;数据6 (c)6 (e))。CCK-8s也提高了NPPA mRNA水平( 与对照组;图6 (f)),它被废除的CCK受体抑制剂( 与CCK-8s组;图6 (f))。此外,PPAR的抑制剂α和PPARγGW6471 GW9662,不仅显著抑制NPPA CCK-8s-enhanced mRNA水平的影响( 与对照组; 与CCK-8s组;图6 (f)),但也废除了对ANP CCK-8s分泌的作用( 仅与CCK-8s时期;数据6 (g)和6 (h))。然而,心房脉冲压力诱导的抑制CCK-8s被GW6471和GW9662(数据不受影响6(我)和6 (j))。这些结果表明,PGC-1α监管PPARα和PPARγ参与调节CCK-8s-induced ANP的分泌增加。

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图6
CCK-8s对PPAR的影响α以及PPARγ表达式及其在ANP分泌作用和动态隔离大鼠心房跳动。(a, b, f) PPAR的mRNA水平α,PPARγ,NPPA被RT-qPCR测试。(c) p-PPAR的蛋白质表达水平α和p-PPARγ被免疫印迹检测。(d)免疫印迹的统计直方图表示为带密度规范化和t-PPARα。(e)免疫印迹的统计直方图表示为带密度规范化和t-PPARγ。(g h)心房ANP分泌等。(i, j)心房RM6240BD脉压。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;SR: SR - 18292, PGC-1的拮抗剂α;罗:Loxiglumid CCK的拮抗剂1受体;YM: YM022 CCK的拮抗剂2受体;GW64: GW6471, PPAR的拮抗剂α;GW96: GW9662, PPAR的抑制剂γ。数据表示为 。(f) ;(g-j) 。 , ,和 和控制周期或一组;# # # 与CCK-8s时期或一组;@@ 与Lo + CCK-8s组;& & 与YM + CCK-8s组。
3.6。影响的内生ANP NOX4、SOD和猫表情在CCK-8s行动

定义的影响单子叶植物NOX4 ANP, SOD,猫和蛋白质表达CCK-8s作用下,另一个一系列的实验进行了ANP受体拮抗剂。结果表明,CCK-8s显著增加SOD和CAT而不是GPX蛋白表达水平( 和 与对照组;数据7(一)7 (d));这些影响被封锁CCK受体和PPAR的抑制剂α以及PPARγ( 与CCK-8s组;数据7(一)7 (c)7 (e)7 (g))。在ANP受体的拮抗剂,A71915, AA的CCK-8s-induced增加释放和H2O2水平进一步增强( 和 与CCK-8s组;数据8(一个)和8 (b))。此外,A71915进一步增强的影响CCK-8s-induced增加NOX4猫和蛋白表达水平( 与CCK-8s组;数据8 (c)8 (e)),但CCK-8s-induced增加SOD蛋白表达被废除A71915 ( 与CCK-8s组;数据8 (c)和8 (f))。数据显示,CCK-8s调节SOD和CAT的表达通过PPAR的激活α以及PPARγ。此外,内生ANP参与NOX4表达式的抑制和H2O2生产和SOD活性的调控作用下CCK-8s。

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图7
PPAR的影响α和PPARγCCK-8s-induced SOD和CAT表达式在孤立的大鼠心房跳动。(一)蛋白表达水平的草皮,猫,GPX被免疫印迹检测。(罪犯)免疫印迹的统计直方图表示为乐队规范化和密度β肌动蛋白。(eg) SOD和CAT的乐队,他们的统计直方图。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;罗:Loxiglumid CCK的拮抗剂1受体;YM: YM022 CCK的拮抗剂2受体;GW64: GW6471, PPAR的拮抗剂α;GW96: GW9662, PPAR的抑制剂γ。数据表示为 。(g) 。 和 与对照组;# # # 与CCK-8s组。
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图8
内源性ANP对SOD的影响、猫和NOX4表达式CCK-8s作用下分离大鼠心房跳动。(a, b) AA和H的水平2O2通过ELISA方法进行测试。(c)的蛋白表达水平NOX4,猫,草皮被免疫印迹检测。(d-f)免疫印迹的统计直方图表示为乐队规范化和密度β肌动蛋白。续:控制;CCK-8s:硫酸CCK-8;A71: A71915, ANP受体的拮抗剂。数据表示为 。(f) 。 和 与对照组;# , # # ,和# # # 与CCK-8s组;&&& 与A71 + CCK-8s组。

4所示。讨论

NOX4 ROS生成的酶来源之一在心脏中表达的心血管系统22]。此外,PLA2的角色和AA的激活氮氧化物已经证明(28]。在我们之前的研究中,我们已经表明,激活cPLA2 endothelin-1参与低氧诱导的规定引起的ANP分泌通过激活NOX4和H2O2生产在孤立打老鼠的心房23]。NOX4活动增加的响应频率高节奏也促进了ANP分泌在大鼠心房(31日]。这些结果表明,NOX4监管因素之一的分泌ANP的心房。

在当前的研究中,CCK-8s而不是CCK-8d显著调节CCK的表达1和CCK2受体和p-cPLA2的水平增加,AA释放,NOX4相对蛋白质含量,和H2O2生产,同时增加ANP分泌和抑制机械动力学在孤立的大鼠心房跳动。CCK-8s-induced增加p-cPLA2表达式和AA释放被CCK受体抑制剂和PLC,分别。同样,CCK-8s-induced upregulation NOX4表达和H2O2生产被废除CCK受体的拮抗剂和抑制剂cPLA2也无效的影响CCK-8s NOX4表达式。此外,CCK-8s-induced促进ANP分泌被CCK受体的拮抗剂,PLC和cPLA2,分别,没有变化的抑制心房CCK-8s引起的机械动力学。然而,CCK-8s-induced抑制心房动力学抑制剂被废除的NOX4, K三磷酸腺苷,汉堡王Ca,这是伴随着CCK-8s-induced ANP分泌物堵塞。这些结果表明,CCK-8s(但不是CCK-8d)触发NOX4激活和增加H2O2生产通过CCK受体介导的激活cPLA2,导致ANP分泌增加和负性肌力作用,K三磷酸腺苷和汉堡王Ca被涉及到。当前研究的结果类似于上面提到的先前的研究和支持先前的报道,K三磷酸腺苷和汉堡王Ca是由H2O2(32- - - - - -34]。

的PGC-1αPGC-1家族的一员,调节适应性生热作用和线粒体功能(35]。PGC-1α可以直接激活p38 MAPK [36)和参与消除活性氧的心(37,38]。PPARα和PPARγ,作为PGC-1的下游信号分子α,抑制氮氧化物和ROS生成通过增强SOD的活性以及猫,从而抵抗氧化应激损伤(39,40]。此外,人类ANP的启动子区域基因位于染色体的短臂上1包含许多转录因子结合位点,包括PPARα和PPARγ(41]。此外,它已经表明,PPARγ参与ANP分泌的调节大鼠心房跳动在常氧或缺氧条件下(42- - - - - -44]。这些结果表明,PPAR的变化α和PPARγANP的分泌活动密切相关。

在当前的研究中,CCK-8s明显增加的水平p-p38 MAPK和同时p-Akt upregulation PGC-1α表达式。的CCK-8s-induced增加p-p38 MAPK和p-Akt水平被NOX4的抑制剂,和CCK-8s-induced upregulation PGC-1α表达式被废除p38 MAPK和Akt抑制剂,分别。此外,PPAR CCK-8s也明显增加α以及PPARγmRNA水平及其磷酸化蛋白质表达,同时促进ANP分泌。的抑制剂PGC-1α废除了CCK-8s-induced磷酸化PPAR的增加α以及磷酸化PPARγ水平PPAR的衰减α以及PPARγ信使rna水平;它还废除了CCK-8s-induced促进ANP分泌。同样,PPAR的抑制剂α以及PPARγ减毒的CCK-8s-induced upregulation NPPA mRNA水平和废除促进ANP CCK-8s引起的分泌。目前的研究数据表明CCK-8s-induced NOX4上调PGC-1α表达式通过磷酸化p38 MAPK和Akt,导致PPAR的激活α以及PPARγ,从而促进ANP的分泌。数据是类似于上面提到的先前的研究。

SOD, CAT, GPX是重要的抗氧化剂防御,保护生物系统从ROS毒性。产生的超氧化物阴离子氮氧化物可以转化成H2O2和O2行动的草皮,H2O2最终是解毒入水中几种酶的作用,包括猫和GPX [45]。在最近的研究中,CCK-8s显著增加NOX4表达式和H2O2生产与SOD和CAT的upregulation相伴而不是GPX表达式;这是废除CCK受体的抑制剂。CCK-8s-induced SOD和CAT表达式也废除了PPAR的拮抗剂α和PPARγ。基于CCK-8s对PPAR的影响α和PPARγ活动,建议CCK-8s-induced upregulation SOD和CAT的表达式是PPAR激活有关。此外,在ANP受体的抑制剂的存在,AA的CCK-8-induced增加释放,H2O2生产,upregulation NOX4以及猫表达显著增强。这些结果暗示CCK-8s-induced ANP,至少部分的抑制AA释放,NOX4表情,和H2O2生产。至于猫表达的增加引起CCK-8s ANP受体的抑制剂的存在下,我们认为有关H水平进一步提高2O2生产,猫可以解毒H2O2根据H的浓度成水2O2(45]。此外,ANP受体的抑制剂废除CCK-8s-induced SOD的表情。这意味着内生ANP参与SOD的规定表达。当前的研究结果支持先前的研究,ANP刺激抗氧化防御心血管系统(5)和保护终板软骨细胞对H2O2全身的氧化应激损伤,增加SOD水平,抑制凋亡因素(46]。

总之,通过激活NOX4-PGC-1 CCK-8s提升ANP分泌α-PPARα/ PPARγ信号,通过激活K负性肌力的影响三磷酸腺苷和汉堡王Ca。CCK-8s-induced内生ANP参与抵抗NOX4表达式和ROS SOD活性的生产和监管。这表明CCK-ANP信号是与心脏生理学和病理生理学。

数据可用性

数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zhuo-na汉和林Xiao-xue贡献了同样的工作。

确认

我们衷心感谢所有的参与者在这个研究。这项研究得到了国家自然科学基金(81960099)。