文摘

缺血性中风是最常见的脑血管疾病死亡率高,预后不良,和脑缺血再灌注(CI / R)损伤是主要杀手。在这里,我们试图探索Xuesaitong的效果和机制(XST)结合dexmedetomidine(敏捷)CI / R损伤的老鼠。首先,CI / R损伤鼠模型构造通过大脑中动脉阻塞(MCAO)方法和治疗XST和敏捷单独或组合。然后,在第五和第十天的治疗,神经损伤评估使用修改后的神经严重程度评分(mns) 8-arm径向迷宫测试(8 armt),小说对象识别测试(NORT),和恐惧条件反射试验(FCT)。)进行染色观察海马的病理变化。ELISA和相关工具被用来评估在海马单胺神经递质和抗氧化剂酶活动。ATP,线粒体膜电位水平,存在线粒体功能相关基因的测定来评估在海马线粒体功能和免疫印迹确定Keap1 / Nrf2信号通路和mitophagy-related蛋白质表达。结果表明,XST结合敏捷显著降低mns,改善空间记忆和学习赤字,和增强的恐惧记忆和认知记忆能力在CI / R老鼠,这是优于单药治疗。此外,XST结合敏捷治疗改善海马组织病理学损伤;显著增加的水平单胺神经递质,神经营养因子,ATP,线粒体膜电位; and upregulated the activities of antioxidant enzymes and the expression of mitophagy-related proteins in the hippocampus of CI/R rats. XST combined with Dex treatment also activated the Keap1/Nrf2 signaling and upregulated the protein expression of downstream antioxidant enzymes HO-1 and NQ. Altogether, this study showed that a combination of XST and Dex could activate the Keap1/Nrf2 signaling and mitophagy to protect rats from CI/R-related neurological impairment.

1。介绍

作为一种常见的脑血管疾病,缺血性中风占大约80%的中风和死亡的主要原因之一,收购了残疾(1,2]。脑缺血和缺氧可以诱导缺血性中风,目前,返回血液供给大脑通过手术或药物治疗是主要的治疗缺血性中风(3]。然而,恢复血液流动在脑缺血再灌注脑组织缺血性中风后不可避免地引发(CI / R)损伤,从而加重了条件(4]。CI / R损伤会导致神经赤字,学习和记忆障碍、脑梗死和脑水肿的病人(5,6]。据报道,CI / R损伤不仅参与多种因素的病理过程和路径也与线粒体功能障碍,神经递质紊乱,离子代谢失衡,氧化应激,炎症和细胞凋亡7]。尽管知识CI / R损伤的发病和进展,没有有效的治疗药物和方法减少CI / R损伤患者的缺血性中风。因此,迫切需要探索有效的治疗药物和方法减轻缺血性中风患者的CI / R损伤。

除了细胞能源生产的中心,线粒体还参与细胞的生理活动,如细胞信号传导、分化、增殖和凋亡8]。线粒体也被证明是参与CI / R损伤的病理。在CI / R,线粒体发生一系列变化,如Ca^{2 +}过载,生产过剩的活性氧(ROS),线粒体渗透性转换孔开放(9,10]。上述变化对神经元和大脑组织产生深远的影响。例如,过量的活性氧和Ca^{2 +}超载可以降低线粒体膜电位、膜透性增加,线粒体细胞色素c的释放到细胞质中,从而促进神经元细胞凋亡(9]。过量的活性氧和线粒体受损也基质mitophagy感应(10]。除了降解和回收受损的线粒体,mitophagy还可以防止细胞损伤引起的线粒体DNA突变(11]。Mitophagy CI / R损伤密切相关。一些研究报道,mitophagy扮演了一个角色在中央保护神经元,神经胶质细胞,内皮细胞减少缺血性损伤(12,13]。例如,毛泽东等人指出,川芎内酯对神经保护功能通过激活PINK1 / Parkin-dependent mitophagy和改善CI / R-induced海马神经损伤(14]。

氧化应激是一个关键因素在CI / R损伤的发病机制15]。CI / R-induced线粒体损伤可以过量的活性氧,活性氧积累过度会导致体内氧化还原平衡和诱导氧化应激(15]。Keap1 / Nrf2内生的重要监管途径在体内氧化还原系统。通常,Keap1的绑定Nrf2在细胞质中抑制Nrf2活性的。活性氧在体内过度时,Nrf2 Keap1分离,把核激活下游抗氧化酶基因的转录与血红素加氧酶1 (HO-1) NQO1、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx) [16]。Keap1 / Nrf2信号通路中起着重要的作用在CI / R损伤。具体来说,激活Keap1 / Nrf2基因信号通路及其下游可以改善CI / R-induced神经损伤大鼠(17]。

田七(傻瓜)。f·h·陈是一种传统的中草药,可以激活血液,解决停滞,减轻肿胀,减轻疼痛18]。现代药理研究显示抗炎,抗氧化,降血脂药,对三七和神经保护作用。三七皂甙(pn)是三七的主要活性成分,包括notoginsenoside R1和皂苷含量如Rg1、再保险、Rb1, Rd (19]。Xuesaitong (XST),一个包含pn的中药制剂,临床上主要用于治疗stroke-induced轻偏瘫。临床研究报道,XST改善脑梗死患者的神经损伤(20.]。另外,我可以减少神经功能障碍和病理损伤CI / R老鼠(21]。相比之下,dexmedetomidine(敏捷)是一种anesthesia-assisted镇静剂和强有力的高度选择性α2肾上腺素能受体激动剂(22]。一些研究报道敏捷的神经保护效应在脑损伤动物模型。例如,赵等人报道,敏捷可以缓解CI / R损伤大鼠通过激活α2-adrenergic受体和阻塞物磷酸化和caspase-3激活22]。太阳等人声称敏捷的神经保护作用是通过抑制脊髓炎症和神经细胞凋亡,减轻脊髓CI / R损伤(23]。然而,XST加上敏捷的疗效和机制在CI / R损伤仍不清楚。

本研究旨在调查的效果和机制的结合XST和敏捷CI / R损伤大鼠。大脑中动脉阻塞(MCAO)方法采用构建CI / R损伤大鼠模型,和多个行为测试进行评估的影响XST结合敏捷CI / R大鼠的神经功能。我们发现XST结合敏捷CI / R的治疗改善神经损伤大鼠和表现出神经保护效应。随后,XST加上敏捷的角色在海马组织氧化应激和线粒体功能的CI / R老鼠了,紧随其后的是调查的机制Keap1 / Nrf2信号通路和mitophagy。总之,这项研究表明,组合方案可以有效地治疗缺血性中风造成的再灌注损伤。

2。材料和方法

2.1。动物

共有100名健康特定病原体免费(SPF)级别Sprague-Dawley (SD)大鼠(年龄:6 - 8周和重量:180克- 200克)是购自湖南SJA实验动物有限公司有限公司一个星期后SPF环境适应性喂养的老鼠被分成组的一个幌子,CI / R组,敏捷集团XST集团和敏捷+ XST组,每组20老鼠。动物保健和使用程序经伦理委员会批准的山东省肿瘤医院和研究所隶属于山东第一医科大学(2022007005),和所有适用的机构和政府规章制度的伦理使用动物。

2.2。建立CI / R损伤大鼠模型

CI / R损伤鼠模型构造使用MCAO方法(24]。简单地说,手术是在无菌环境中执行。首先,老鼠与异氟烷麻醉气体(5%的感应和2.5%的维护),在仰卧位固定在手术台上,从他们的脖子和头发被移除。用75%的酒精消毒后,颈部的皮肤和皮下组织沿途的前中线的脖子,皮下组织和筋膜是直言不讳地解剖暴露右侧颈总动脉(CCA),颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)。接下来,ECA的近端部分和CCA的结扎,和ICA与动脉钳夹紧。一个小孔被一根针扎在CCA的远端结扎介绍线圈栓塞。然后,ICA动脉夹被释放,方向和线圈栓塞的位置进行调整。随后,栓塞线圈被允许进入ICA通过CCA,直到他们遇到了一个轻微的抵抗,由专业的实验证实,ICA闭塞,大脑中动脉闭塞。2 h后,线圈栓塞被启动再灌注过程,和颈部组织和皮肤缝合。

2.3。干预组

敏捷盐酸注入从江苏恒瑞制药有限公司购买,从湖南有限公司(H20090248)和XST方胜药业有限公司有限公司(Z20064307)。我把平板电脑在生理盐水溶解,其次是胃内的政府。虚假的组中,我们只暴露大鼠的颈动脉,但没有添加线圈栓塞。XST CI / R,敏捷,敏捷+ XST组大鼠MCAO手术。所有的老鼠接受介入治疗手术后24小时。具体来说,敏捷组大鼠腹腔注射敏捷(50μ克/公斤)和强饲法同等体积的生理盐水。老鼠XST组被给予XST通过胃内的管理(40毫克/公斤)和腹腔内注射同等体积的生理盐水。老鼠在敏捷+ XST组腹腔内注射与敏捷(50μ克/公斤)和胃内的政府XST(40毫克/公斤)。老鼠在CI / R和虚假的组同时腹腔注射和填喂法与同等体积的生理盐水。所有大鼠治疗10天每天一次,和老鼠死在此期间被排除在外,每组和10个老鼠被随机选择继续实验。行为测试5和10天进行治疗。治疗的第十天,在完成行为测试,通过深度麻醉老鼠牺牲;然后,从每组大鼠海马组织收集;然后,苏木精和伊红染色进行观察())这些组织组织病理学变化。在图所示的实验设计1。

2.4。神经系统评估

MCAO手术前和天1、2、6和10的治疗,神经损伤程度评估使用修改后的神经严重程度评分(mns)系统通过研究者盲实验设计(25]。得分从0到18岁,0表示正常神经功能和18表示最严重的神经功能缺损。

2.5。Eight-Arm径向迷宫测试

大鼠的空间学习和记忆能力是8-arm径向迷宫的评估与测试(8-ARMT) [26]。短暂,8-arm径向迷宫由一个中央平台(直径:25厘米)和8个扩展武器( )。相机被150厘米以上迷宫跟踪运动轨迹的老鼠。此外,中央平台与手臂穿过一个可控的小门前,和小盒子里,可以把食品在每个手臂。在测试之前,老鼠连续2天每天两次进行了适应性训练,在此期间食物放置在所有八臂迷宫,和老鼠自由探索10分钟后进入迷宫。在正式测试阶段,四臂的末端被随机选择食物放置,和老鼠被允许自由地探索迷宫,直到所有食品的四个胳膊被吃掉。实验中断,如果食物是没有完成后10分钟。测试完成后,迷宫是消毒用酒精和残留气味移除。Any-Maze™软件应用于评估老鼠的食物勘探迷宫,基于以下几点:(1)工作记忆错误(WME):返回到武器的数量食物完成;(2)引用内存错误(RME):条目到武器的数量不包含食品;和(3)的条目总数(TE):手臂条目的总数。

2.6。小说对象识别测试(NORT)

这部小说对象识别测试(NORT)进行评价大鼠的认知记忆能力(27]。测试是在一个黑人进行打开箱( ),和一个摄像头安装在盒子来记录他们的运动轨迹。实验分为一个适应阶段,训练阶段和测试阶段。在适应阶段,老鼠被放置在一个开放的盒子,允许自由移动10分钟。在训练阶段,老鼠放在一个10分钟的开放框包含2相同的对象,允许自由探索。2 h后,正式开始测试。在测试之前,一个盒子里的对象换成了新对象使用不同的形状,颜色和材料。老鼠被允许自由地探索开放盒10分钟;然后,Any-Maze™软件应用于分析的探索时间熟悉的对象(TF)和小说对象(TN)以及新对象识别指数(RI)的老鼠。值得注意的是,老鼠的对齐的鼻子到对象不到2厘米或直接接触对象被定义为探索对象,这是使用以下公式计算: 。

2.7。恐惧条件反射测试(FCT)

恐惧条件反射测试(FCT)采用评估老鼠的恐惧记忆能力(28]。简而言之,电击生成器和一个声音发生器被连接到一个光栅恐惧条件反射腔的底部(美国Any-Maze)。具体地说,老鼠在恐惧条件反射室并给予培训。首先,他们给出了循环噪音刺激(声压级:80分贝;频率:4千赫;和持续时间/间隔时间:30年代)和电击(电流强度:0.5 mA和持续时间:2 s)。2分钟后,噪声刺激和电击同时停止。然后,老鼠在室给定的上下文相关的和tone-related测试24小时后。在上下文相关的测试,老鼠在室没有噪音和震动刺激为5分钟。1小时后,tone-related进行测试。 After the rats had moved freely in the chamber for 3 min, they were given noise stimulation (duration/interval time: 30 s) for 5 cycles (total stimulation time: 5 min). The freezing behavior time of the rats in the stimulation process was recorded, and the Any-Maze™ software was utilized to analyze the freezing time percentage in the context-related and tone-related tests. Of note, except for respiration, indiscernible movements of all bones and vibrissa in rats were considered freezing behaviors.

2.8。苏木精和伊红染色())

老鼠牺牲后,每组五个老鼠的脑组织被收集,和海马组织迅速分离在冰上。)染色后,根据王描述的方法进行et al .,在老鼠的海马组织病理变化观察(29日]。简单地说,组织和4%多聚甲醛固定(Solarbio,中国)48 h,紧随其后的是石蜡包埋准备5μm系列的部分。接下来,部分是沾)(Solarbio,中国),之后他们在显微镜下观察和拍摄(奥林巴斯、日本)。

2.9。酶联免疫吸附试验(ELISA)

添加PBS缓冲(Beyotime,中国)之后,老鼠的海马组织(50毫克)磨成组织匀浆和离心机在12000 rpm和30分钟4°C,和上层的收集。组织匀浆稀释到适当的浓度根据指令的多巴胺(DA)试剂盒(酶联生物科技有限公司,中国),5 -羟色胺(5 -)试剂盒(酶联生物科技有限公司,中国),去甲肾上腺素(NE)试剂盒(酶联生物科技有限公司,中国),脑源性神经营养因子(BDNF)试剂盒(酶联生物科技有限公司,中国),Trk B包(深圳市zik生物科技有限公司),和neurotrophin-3 (NT-3)包(SenBeiJia生物科技有限公司,有限公司,中国)。试剂和样本添加到序列的ELISA板,反应后,板吸光度检测在450海里。根据标准曲线,DA的水平,5 -,不,BDNF, Trk B, NT-3海马组织计算。

2.10。评估超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活动

同样,老鼠的海马组织被磨成组织匀浆后添加PBS缓冲和离心机在12000 rpm和30分钟4°C和上层的收集。相关试剂盒(酶联生物科技有限公司,中国)被用来评估活动的SOD, CAT, GPx海马组织。

2.11。检测腺苷5 - - - - - -三磷酸腺苷(ATP)

PBS缓冲了老鼠的海马组织(50毫克),磨成组织匀浆,然后离心收集上层的。然后,老鼠的海马组织中ATP含量从每组测量操作指令后ATP工具包(酶联免疫吸附试验,中国)。

2.12。线粒体膜电位检测

牺牲的老鼠后,他们的海马组织解剖与预冷汉克冰盘,然后冲洗的解决方案(Solarbio,中国)。随后,软脑膜和血管解剖显微镜下仔细删除(奥林巴斯、日本),以及组织与虹膜剪碎。接下来,胰液素添加0.125%,组织被放置在一个孵化器在37°C的消化。20分钟后,停止了消化DMEM (Solarbio,中国)含10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)。组织当时已筛使用200 -网状细胞筛和离心机在1500 r / min 5分钟收集沉淀细胞。接下来,细胞被洗了汉克的解决方案,和细胞存活率(不低于90%)是利用台盼蓝染色检测解决方案(Solarbio,中国)。然后,JC-I染色的细胞混合解决方案根据JC-I工具包的使用说明书(Solarbio,中国)。最后,荧光强度在490 nm和530 nm)测定与多功能微型板块读者(TECAN、瑞士)。

2.13。中存在

从海马组织总RNA提取使用试剂盒试剂(σ,美国),和核糖核酸的浓度和纯度检测使用NanoDrop。提取的RNA反转录成cDNA根据指令的逆转录工具包(美国热)。然后,cDNA是热循环仪利用合成目标基因序列骰子®SYBR绿色装备后实时系统(豆类、日本)指令。GAPDH是用作内部控制,2^{- - - - - -ΔΔCt}方法采用计算目标基因的相对表达水平。引物序列应用于本研究如表所示1。

2.14。免疫印迹

总蛋白提取大鼠的海马组织使用里帕溶解产物(Solarbio,中国),并提取蛋白质的浓度决定使用BCA蛋白质化验用品(热,美国)。蛋白质是煮5×sds - page加载缓冲区(Solarbio,中国)。随后,20μg总蛋白质的分离通过钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),转移到一个聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,并使用5%的脱脂牛奶2 h阻塞。接下来,膜与初级抗体Keap-1(猫孵化。不。60027 - 1 - ig), Nrf2(猫。不。16396 - 1 - ap), HO-1(猫。不。66743 - 1 - ig)、NQO1(猫。不。67240 - 1 - ig)、PINK1(猫。 no. 23274-1-AP), Parkin (cat. no. 66674-1-Ig), LC3 (cat. no. 14600-1-AP), p62 (cat. no. 66184-1-Ig), andβ肌动蛋白(猫。不。美国Proteintech 66009 - 1 - ig),一夜之间在4°C。与TBST三次洗涤后,细胞膜是孵化二级抗体(美国Abcam)在环境温度为2 h。随后,增强化学发光(ECL)试剂(中国Solarbio PE0010)均匀滴到膜上,和一个FluorChem HD2成像系统用于扫描和照片的印迹。使用ImageJ灰度值分析,并计算目标蛋白质的相对表达水平β肌动蛋白作为内部控制。

2.15。统计分析

SPSS v24.0软件被用于统计和分析和GraphPad棱镜v9的策划。所有的结果都一样 。使用独立的两组之间的差异进行了分析 - - - - - -测试和对比多个组使用一个单向方差分析进行评估。 是标准显示显著的统计学差异。

3所示。结果

3.1。XST结合敏捷提高CI / R的老鼠的神经损伤

mns系统使用之前和之后的治疗探索XST结合敏捷治疗的效果在CI / R大鼠神经功能。职场专家手术后,老鼠的mns CI / R组显著增加的价格相比虚假的集团( ),指示成功建设CI / R损伤大鼠模型神经损伤的职场专家手术。天2、6、10治疗后,大鼠在敏捷,XST和XST +敏捷组表现出更低的mns比CI / R组( );并与敏捷和XST组,XST +敏捷组织呈现显著降低了mns(图2)。上述结果表明,敏捷加上XST改善神经损伤在CI / R老鼠,和联合治疗的改善优于单独治疗。此外,老鼠的mns XST +敏捷组与治疗的持续时间减少,表明XST +敏捷的神经功能缺损的改善效果与治疗持续时间增加。

3.2。XST和敏捷提高空间学习和记忆障碍和增强认知记忆和恐惧在CI / R老鼠记忆能力

CI / R-induced神经损伤,表现为学习和记忆障碍和认知能力下降,是一种常见的缺血性中风患者的并发症(5]。在这项研究中,采用8-ARMT评估XST加上敏捷的角色在CI / R大鼠的空间学习和记忆能力。评价结果表明,WME, TE,东CI / R组显著增加的价格相比虚假的集团( ),表明MCAO大鼠的空间学习和记忆能力受损。此外,治疗5天,第十天,敏捷,我,和XST +敏捷组织表现出显著减少WME, TE,东与CI / R组( ,数据3(一个)和3 (b)),这表明单一和联合疗法可以改善在CI / R大鼠空间学习和记忆能力。此外,5日和10天的治疗,WME, TE,东XST +敏捷组低于敏捷和XST组( ,数据3(一个)和3 (b)),显示效果更佳的XST结合敏捷治疗CI / R大鼠的空间学习和记忆障碍的治疗。

随后,老鼠的恐惧记忆和认知记忆能力在每个小组评估了浮置板轨道和NORT通过实验,分别。根据结果,与虚假的集团相比,CI / R老鼠显示上下文相关的冻结时间短和tone-related NORT测试测试和低得多的RI ( ),推断MCAO手术能显著降低小鼠恐惧记忆和认知记忆能力。此外,敏捷和XST,单独或组合,增加冻结时间上下文相关的和tone-related测试和RI NORT测试5日和10天的治疗 )。此外,国际扶轮的NORT在上下文相关的测试和冻结时间,tone-related测试XST +敏捷组显著增加而敏捷和XST组( ,数据3 (c)- - - - - -3(f))。上述结果表明,联合治疗与XST和敏捷提高认知记忆和恐惧在CI / R老鼠记忆能力,比治疗更有效XST或独自敏捷。,我结合敏捷治疗改善空间学习和记忆缺陷和增强认知记忆和恐惧在CI / R老鼠记忆能力。

3.3。XST结合敏捷改善海马组织病理学损伤CI / R的老鼠

海马体是大脑的功能活动,包括学习、记忆、认知、和响应控制。研究表明,脑缺血很容易诱导海马组织病理损害和损害神经系统功能(30.]。在现在的研究中,他走时进行染色观察海马组织病理变化。短暂,虚假的组,细胞形态正常,完整的结构,和普通等级。至于CI / R组海马组织部分显示严重的病理损伤,脊椎受损细胞,致密的和神经细胞核深染,液泡的形成。敏捷和我单独治疗或组合,改善海马组织的病理损害,治疗后,XST +敏捷组大鼠神经元有整齐的排列和减少细胞液泡的海马组织(图4)。总之,我结合敏捷减轻海马病理损害的CI / R的老鼠。

3.4。结合治疗XST和敏捷增加单胺神经递质和神经营养因子水平在CI / R大鼠海马组织

海马单胺神经递质和神经营养因子与中枢神经功能密切相关。具体来说,单胺神经递质(DA、5和NE)参与中枢神经的功能,比如中央认知、记忆、感觉,和睡眠31日]。神经营养因子(BDNF, Trk B,和NT-3)促进神经生长和神经发生,起到神经保护作用在CI / R损伤的大鼠模型32]。目前尚不清楚我的神经保护作用和敏捷在CI / R-injured老鼠与单胺神经递质和神经营养因子的变化相关联的海马组织。因此,ELISA用于本研究确定的单胺神经递质水平(DA、5和NE)和神经营养因子(BDNF, Trk B,和NT-3)在CI / R治疗后大鼠的海马组织XST和敏捷单独或组合。结果表明,MCAO手术显著降低的水平哒,5 -,不,BDNF, Trk B, NT-3在老鼠的海马组织( )。5日和10天的治疗,我和敏捷单独或结合DA的含量增加,5 -,不,BDNF, Trk B, NT-3 CI / R海马组织的老鼠。XST +敏捷集团尤其是呈现显著调节单胺神经递质和神经营养因子水平相比,对海马组织XST或敏捷组织( ,数据5(一个)- - - - - -5 (f))。因此,敏捷加上XST治疗增加海马单胺神经递质和神经营养因子水平的CI / R的老鼠。

3.5。XST结合敏捷治疗改善氧化应激在CI / R大鼠海马组织

据报道,氧化应激是CI / R损伤的关键因素15]。进一步探索神经系统的改善效果是否XST结合敏捷治疗CI / R老鼠与氧化应激密切相关,我们检查的水平抗氧化酶(SOD, CAT, Gpx)每组大鼠的海马组织。结果表明,SOD水平,猫,GPx CI / R组大鼠的海马远低于那些虚假的集团( ),表明氧化应激水平增加CI / R大鼠的海马。5日和10天的治疗,SOD水平,猫,和GPx XST,敏捷,XST +敏捷组显著增加与CI / R组( ),和SOD, XST +敏捷的猫,GPx水平组高于XST和敏捷组( ,数据6(一)- - - - - -6 (c))。上述结果表明,XST结合敏捷可能增加抗氧化酶水平和改善氧化应激在老鼠的海马组织CI / R。

3.6。结合治疗XST敏捷,改善线粒体功能障碍在CI / R大鼠海马组织

氧化应激改变线粒体膜电位和破坏线粒体内稳态。线粒体功能变化与CI / R损伤的病理过程(9]。探讨XST结合敏捷治疗对线粒体功能的影响,我们对线粒体膜电位和ATP水平在每组大鼠的海马组织。简而言之,与虚假的组相比,线粒体膜电位和ATP水平下降尤其是CI / R组( )。在第五天,第十天的治疗,线粒体膜电位和XST ATP含量显著增加,敏捷,XST +敏捷团体与CI / R组。与XST和敏捷团体相比,线粒体膜电位和XST +敏捷组织中ATP含量高得多( ,数据7(一)和7 (b))。总之,我结合敏捷增加线粒体膜电位和海马组织中ATP含量的CI / R的老鼠。

此外,存在是利用检测线粒体功能相关基因的信使rna表达水平(TFAM, ATP6 Mfn1, Drp1)在每组大鼠的海马组织。检测结果显示,与虚假的集团相比,TFAM的信使rna表达水平,ATP6,和Mfn1显著减少,而Drp1的信使rna表达水平显著增加大鼠的海马的CI / R组( )。5日和10天的治疗与XST敏捷,或XST +敏捷的mRNA表达TFAM, ATP6,和Mfn1是调节,而Drp1下调在CI / R大鼠的海马。与XST和敏捷团体相比,XST +敏捷小组展示了TFAM mRNA表达的增加,ATP6和Mfn1 ( )和减少的mRNA表达Drp1 ( ,数据7 (c)和7 (d))。完全,XST结合敏捷治疗改善线粒体功能障碍在CI / R大鼠的海马组织,和组合效果优于单药治疗。

3.7。结合治疗XST和敏捷激活Keap1 / Nrf2信号通路在CI / R大鼠海马组织

Keap1 / Nrf2信号是一个关键的信号通路在体内氧化还原系统。激活Nrf2及其下游(即抗氧化酶基因。,HO-1 and NQO1) can ameliorate CI/R-induced damage to the nervous system of rats [17]。调查XST结合敏捷治疗的机制在提高CI / R损伤老鼠,免疫印迹实验的表达水平进行检测Keap1 / Nrf2 pathway-related蛋白质在老鼠的海马组织中。结果表明,与虚假的集团相比,Keap1的蛋白表达显著增加( ),虽然Nrf2的蛋白表达,HO-1 NQO1显著下降( )海马组织的CI / R组。第五天,第十天的治疗,Keap1的蛋白表达显著下调XST,敏捷,XST +敏捷组织( ),虽然Nrf2的蛋白表达,HO-1 NQO1显著调节,而CI / R组( )。此外,与XST和敏捷团体相比,Keap1蛋白表达显著下调( ),虽然Nrf2的蛋白表达,HO-1 NQO1显著调节大鼠的海马XST +敏捷小组第五和第十天的治疗 ,数据8(一个)和8 (b))。这些发现证明了XST结合敏捷治疗激活Keap1 / Nrf2途径活性CI / R大鼠海马组织的。

3.8。我和敏捷激活Mitophagy CI / R大鼠的海马组织

Mitophagy是一种生理过程,身体移除受损的线粒体。PINK1 / Parkin-dependent mitophagy可以减轻CI / R损伤和起到神经保护作用[12]。调查是否联合治疗的神经保护效应XST和敏捷CI / R老鼠与mitophagy有关,免疫印迹进行评估mitophagy疾病相关蛋白表达的变化在老鼠的海马组织XST和敏捷的治疗。与假组相比,结果表明,PINK1帕金蛋白质表达水平显著降低,而蛋白表达水平的CI / R组中p62增加,表明mitophagy受损的老鼠的海马组织CI / R。5日和10天的治疗,治疗XST和敏捷的表达水平显著提高PINK1帕金和LC3-I的价值/ LC3-II虽然p62的蛋白质表达水平降低海马组织的CI / R的老鼠。此外,与XST和敏捷团体相比,PINK1的表达水平,帕金,LC3-I / LC3-II增加XST +敏捷集团(数字9(一个)- - - - - -9 (d))。上述结果表明XST和敏捷的结合可以改善mitophagy障碍CI / R大鼠海马组织的。

4所示。讨论

近年来,缺血性中风的发病率全世界一直在增加。缺血性中风后恢复血流会加重脑损伤,引发CI / R损伤(4]。目前,没有有效的临床治疗和药物来减少CI / R损伤。CI / R损伤能诱导神经赤字、脑梗死和脑水肿5,6]。一些以前的研究报告XST和敏捷的功能在保护神经系统和他们的角色在CI / R减轻神经损伤大鼠(20.- - - - - -22]。在这项研究中,MCAO手术增加mns老鼠被发现。此外,与虚假的集团相比,CI / R老鼠显示赤字在空间记忆和学习能力和减少通过8-ARMT恐惧记忆和认知记忆能力,NORT和FCT。上面的研究我们发现与之前的研究报道相一致的影响MCAO大鼠的神经功能(33]。此外,结合治疗XST和敏捷减少mns CI / R老鼠和改进行为干扰和赤字8-ARMT CI / R老鼠呈现的NORT和FCT。因此,XST结合敏捷表现出协同效应在改善神经损伤在CI / R老鼠也表现出比XST或敏捷单独治疗效果更佳。

海马体是大脑的边缘系统的关键结构,参与各种功能活动的大脑。例如,海马体中扮演一个重要的角色在学习,记忆和认知功能(29日]。一般来说,海马组织易患脑缺血性损伤和脑ischemia-induced组织病理学变化的主要网站(34]。在这项研究中,组织病理学损伤在CI / R大鼠的海马是严重和神经细胞有液泡的,虽然XST结合敏捷治疗后,病理损害CI / R的大鼠的海马体是改善。单胺神经递质和神经营养因子水平的变化也很重要病变引起的CI / R损伤。单胺神经递质在中枢神经扮演特定角色等功能认知、记忆、睡眠、感觉、运动和恢复自主功能(31日]。先前的研究表明CI / R可以减少DA, NA,脑组织5水平(35,36]。至于神经营养因子,他们维持神经可塑性,影响大脑功能,调节缺血性中风后恢复(32]。脑源性神经营养因子、TrkB NT-3都显示神经保护效应在CI / R损伤的大鼠模型37]。同时,高等人发现,人参皂苷Rg2可以显著增加DA, 5, NE水平在创伤后应激障碍的大鼠模型38]。同样,最近的研究表明,敏捷可以提升单胺神经递质和神经营养因子的水平22,39]。在本研究中,我们发现,CI / R减少哒,NA, 5, BDNF, TrkB, NT-3水平在老鼠的海马组织,这是一致的,在以前的研究报告(32,35]。此外,XST结合敏捷治疗增加了单胺神经递质和神经营养因子水平IC / R大鼠海马组织的。此外,XST和敏捷之间的协同作用观察,治疗XST +敏捷优于治疗XST或敏捷。

线粒体功能的重要指标,以确定CI / R损伤的发展(9,10]。有研究指出,线粒体是人参皂苷的重要目标之一,从而导致了线粒体能量代谢的调节,氧化应激,mitophagy、膜通道的状态(40]。Mitophagy是正常维护细胞的生理平衡的机制。PINK1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在正常状态下,PINK1运输从细胞质中线粒体和线粒体蛋白酶裂解(14]。在CI / R损伤,PINK1线粒体膜上堆积,因为线粒体膜电位下降使PINK1未能把线粒体。积累PINK1诱发帕金磷酸化激活帕金。激活帕金石的泛素结合蛋白,从而诱导mitophagy。此外,一些ubiquitinated蛋白在线粒体基质结合LC3锚线粒体自噬小体,从而激发mitophagy (14]。敏捷可以通过调节改善CI / R损伤的抑制线粒体钙uniporter(单片机)和减少过度mitophagy [41]。在这个报告中,职场专家ATP水平,降低线粒体膜电位,线粒体function-related基因的表达(TFAM, ATP6、Drp1 Mfn1)在大鼠的海马组织和改善线粒体功能障碍。此外,联合治疗XST和敏捷可以激活PINK1 / Parkin-dependent mitophagy CI / R大鼠的海马。先前的报道强调了XST和敏捷的潜在作用mitophagy [40,41]。根据我们的研究发现,XST结合敏捷优于XST或敏捷独自在激活mitophagy和改善线粒体功能障碍。

Keap1 / Nrf2通路是一个重要的调节体内氧化应激机制。减少Nrf2活性可能加剧氧化损伤和炎症损伤(42]。最近的研究报道之间的功能联系Keap1 / Nrf2途径和线粒体43]。具体来说,激活Keap1 / Nrf2可以提高线粒体的活性,降低NADPH氧化酶系统相关的蛋白的表达,抑制线粒体氧化应激通过绑定独联体代理抗氧化反应元素()(43]。人参皂苷的研究表明,Rb1 Rh3可以激活Keap1 / Nrf2信号;移植的转录和表达HO1、NQO1 GCLC;,起到抗氧化作用44]。刘等人发现敏捷显著激活Keap1 / Nrf2 / HO-1通路和缓解神经性疼痛在小鼠模型的性压缩性的伤害(45]。在我们的研究中,结合治疗XST和敏捷提高抗氧化酶活性和改善氧化应激状态的海马组织CI / R的老鼠。此外,我和敏捷也激活Keap1 / Nrf2下游信号和调节蛋白表达的抗氧化酶HO-1 NOQ1。

尽管有趣的发现报道在这项研究中,有一些缺点。XST +敏捷增加海马的神经递质水平的CI / R老鼠,这可能是与合成和释放的神经递质在中枢神经电路和中枢神经系统,应在进一步研究验证。此外,我的角色和敏捷改善由CI / R损伤引起的神经功能障碍仍然需要在更大的临床研究。

5。结论

XST结合敏捷治疗神经损伤,改善空间记忆和认知功能障碍和增强认知记忆和恐惧记忆在CI / R-injured老鼠。此外,结合治疗XST和敏捷激活Keap1 / Nrf2信号和mitophagy,改善氧化应激和线粒体功能障碍,和修复线粒体损伤海马的CI / R的老鼠。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

确认

本研究重点项目支持的山东中医药科技开发项目(2021 z009)。