文摘
年龄相关性黄斑变性(AMD)是不可逆转的视力丧失的主要原因全球老年人身份不明的发病机理和治疗选择有限。氧化应激损伤视网膜色素上皮(RPE)是中央AMD的开发和发展。Decorin(宽带),一个小富亮氨酸蛋白多糖,具有强大的antifibrotic,抗炎,抗血管新生的属性。宽带也被报告为一个cytoprotective角色在不同的细胞类型,但其对H的保护作用2O2全身的细胞氧化应激和细胞凋亡在ARPE-19尚不清楚。在这项研究中,我们表明,宽带明显减毒细胞生存能力损失的增加,细胞凋亡率,活性氧(ROS)水平ARPE-19引起的细胞H2O2。此外,宽带激活AMPK / mTOR途径促进自噬基因抑制autophagy-related基因5 (ATG5)阻碍了自噬过程和宽带对氧化应激的保护作用减弱ARPE-19细胞。总的来说,这些结果表明,宽带可以保护RPE细胞H2O2通过自噬促进全身的氧化应激和细胞凋亡,从而提供治疗潜力AMD的预防和治疗。
1。介绍
年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种慢性、进行性神经退行性疾病,影响老年人和功能丧失中央视力。AMD占全球8.7%的失明和不可逆转的视力残疾的主要原因在发达国家老年人。到2040年,预计有2.88亿人将被诊断为AMD (1]。广泛地说,AMD可以出现在三个临床形式:早期nonexudative(干),后期nonexudative(萎缩),和渗出性或新生血管性(湿)。早期AMD黄斑的特点是存在老化斑点没有视觉损失(2]。绝大多数的AMD患者患有干燥或萎缩性AMD黄斑的积累,RPE细胞和感光细胞的变性,和地理萎缩(3]。脉络膜新生血管形成是伴随着湿性AMD的一种高级形式,导致黄斑内渗出和出血。湿性AMD患者的治疗涉及重复管理intravitreal antivascular内皮生长因子(VEGF) [4]。然而,目前,没有干预AMD的早期阶段的发展缓慢,并且没有明确的治疗方法是用于nonexudative AMD部分原因是我们不完全理解底层的AMD的发病机理。
AMD是一个高度复杂的神经退行性疾病,影响老化、遗传和环境压力。AMD的确切发病机理仍然未知(5,6]。衰老是主要的风险因素与AMD有关,这个不可逆过程是伴随着积累的氧化应激,慢性炎症,和线粒体功能障碍7]。这些危险因素之一,大量研究表明,氧化应激的积累可能导致形态和功能异常视网膜色素上皮(RPE)细胞,即核心AMD(病理生理变化8,9]。在生理过程中,正常新陈代谢活跃的视网膜包括高氧含量,促进活性氧簇(ROS)的产生,导致一个高度氧化环境RPE暴露(10,11)功能障碍在衰老的抗氧化系统和其他病理因素导致ROS overaccumulation,导致氧化细胞损伤在RPE细胞(12]。
自噬是特别重要的维持体内平衡的RPE因为这些细胞暴露于持续的氧化应激(13]。几项研究已经报道,自噬抗氧化过程中起着至关重要的作用,促进受损细胞器的间隙或错误折叠的蛋白质在RPE细胞氧化应激(14- - - - - -16]。自噬功能障碍也与AMD的发病机理(17]。大量研究表明,自噬活化剂褪黑激素和雷帕霉素等显示巨大的潜力在AMD治疗(18,19]。在这些催化剂中,decorin(宽带)已被证明能够促进各包括内皮细胞自噬,髓核,乳腺癌细胞(20.- - - - - -23]。宽带,确定为一个类我小富亮氨酸蛋白聚糖(SLRP),定位到角膜,皮肤、和其他结缔组织和作为监管机构束缚各种细胞功能的细胞外基质分子或细胞受体(24]。宽带的生物学功能主要包括细胞生长、分化、和扩散通过其互动与不同的分子,如转化生长因子和胰岛素样生长因子受体1 (25,26]。一项研究表明,宽带在氧化应激和细胞凋亡有抑制作用在外伤后的脑损伤大鼠大脑所描述的活动增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(谷胱甘肽)27,28]。此外,宽带可以抑制glucose-induced人类晶状体上皮细胞氧化应激和细胞凋亡和保护RPE细胞的屏障功能high-glucose条件下(23]。然而,宽带在AMD的潜在保护作用尚未研究。在这项研究中,我们旨在调查宽带是否能保护RPE细胞H2O2全身的氧化应激和探索底层机制。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
ARPE-19人类细胞系是购自中国科学院细胞银行(上海,中国)。在实验之前,细胞被播种在约 /厘米2在文化和维护了两周,除非另有说明建立一个健壮的氧化应激模型。细胞培养在杜尔贝科的修改鹰/火腿F-12介质(DMEM / F12)含10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)湿润空气有限公司为5%2在37°C。培养基是改变每两天。
2.2。细胞生存能力分析
ARPE-19细胞的生存能力是评估使用CCK-8试剂(Dojindo、日本)根据制造商的指示。简而言之,ARPE-19细胞被播种在96 -文化板块 细胞每口井和治疗H2O2和宽带表示。随后,包含10%的培养基是媒介取代CCK-8解决方案在37°C 4 h。每个好使用微型板块分光光度计测定的吸光度(美国BioTek)的波长450 nm。OD的吸光度是规范化的治疗控制。
2.3。测量SOD、丙二醛和谷胱甘肽
SOD测定,ARPE-19细胞治疗不同的条件,并使用超氧化物歧化酶SOD活性确定分析工具包(Beyotime,中国)根据制造商的指示。短暂,显示治疗后,这些细胞被洗冷PBS的两倍。随后,样品溶液添加到解决方案,并在37°C的环境工作了30分钟。因此,吸光度测定的波长450 nm如上描述。此外,丙二醛(MDA)、谷胱甘肽的内容决定使用一个商业分析工具(Beyotime,中国)和测量波长532 nm和414 nm,孵化后分别与工作解决方案根据制造商的指示。
2.4。免疫印迹
免疫印迹分析进行了如前所述[29日]。简单地说,这些细胞被与缓冲区包含针对蛋白酶和磷酸酶抑制剂细胞溶解。相同数量的蛋白质接受了钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳和转移到聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔)。随后,转移膜与牛血清白蛋白阻塞1 h和孵化与以下主要抗体ATG5 (60061 - 1 - ig PTG,中国),LC3(美国12741年,春秋国旅),p62(美国5114年,春秋国旅),伯灵顿(50599 - 2 - ig PTG,中国),bcl - 2 (12789 - 1 - ap, PTG,中国),cleaved-caspase 3(美国5 a1e,春秋国旅),AMPK(美国5831年,春秋国旅),p-AMPK(美国50081年,春秋国旅),mTOR(美国2983年,春秋国旅),p-mTOR(美国5536年,春秋国旅),p70S6K(美国9202年,春秋国旅),p-p70S6K(美国97596年,春秋国旅),和β美国CST肌动蛋白(4970)。膜被用Tris-buffered盐水洗净0.1%的渐变20 (TBST)和辣根peroxidase-conjugated二级抗体孵育(美国7074年,春秋国旅)。膜被清洗和使用化学发光系统可视化ECL试剂(Yeasen,中国)。
2.5。mRFP-GFP-LC3转导和分析
宽带治疗前,ARPE-19细胞转导与Ad-mRFP-GFP-LC3 (HanBio,中国)五多样性感染3 h根据制造商的指示。自噬体和自吞噬泡ARPE-19细胞可视化使用徕卡SP5共焦激光扫描显微镜使用ImageJ软件(样品形貌)和量化。
2.6。透射电子显微镜法
ARPE-19细胞培养在6厘米的菜肴和接受不同的治疗方法。细胞被取消仔细清洗并收集。然后,离心后收集细胞,2.5%戊二醛溶液中固定24小时在4°C。随后,ARPE-19细胞颗粒水化与丙酮和嵌入在环氧树脂。超薄部分减少,使用透射电子显微镜观察细胞结构(日立、日本)。
2.7。细胞转染ATG5 siRNA
ARPE-19细胞被播种在6-well盘子小干扰rna或不属预定目标的控制和转染ATG5 siRNA 50 nM Lipofectamine +试剂的浓度(美国英杰公司)根据制造商的指示。转染ARPE-19细胞接受了不同的治疗方法。
2.8。免疫荧光染色
在培养皿中一个共焦ARPE-19细胞。评价细胞内ROS,细胞被孵化2 ,7 - - - - - -dichlorodihydrofluorescein二乙酸(美国σDCFH-DA)探针为30分钟37°C根据制造商的指示。然后,孵化细胞被洗了三次PBS和可视化样品形貌。为末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)染色,细胞与4%多聚甲醛固定15分钟洗和PBS三次。最后,这些细胞被孵化与0.1% Triton x - 100 5分钟与原位染色细胞死亡检测设备(Beyotime,中国)根据制造商的指示。然后,细胞被样品形貌可视化。
2.9。Fluorescence-Activated细胞分类分析(流式细胞仪)
细胞内ROS的定量评价,ARPE-19细胞沾DCFH-DA如上所述。ARPE-19细胞被收集和分析流式细胞仪(美国BD流式细胞仪咏叹调III)。对于细胞凋亡的评估,细胞暴露于不同的治疗与冷PBS和洗膜联蛋白孵育V-FITC凋亡检测设备(美国BD)。染色细胞被洗,然后收集的胰蛋白酶。然后,细胞颗粒被冷resuspended PBS,流式细胞术分析。
2.10。统计分析
所有的数据都是一样 (SD)获得的结果从至少三个独立的实验。单向方差分析(方差分析)与Dunnett多个比较测试是用于统计分析。不同之处在于被认为具有统计显著性值小于0.05。GraphPad棱镜8是用于统计分析。
3所示。结果
3.1。宽带保护ARPE-19细胞对H2O2全身的氧化细胞死亡
在这项研究中,H2O2被用来诱导氧化应激,AMD的病理扮演着至关重要的作用。,据报道,ARPE-19细胞更容易受到氧化应激在1周长的文化时期,所有实验细胞培养2周后建立一个有力的氧化应激模型明显的细胞损伤和死亡30.]。首先,我们调查了潜在宽带在ARPE-19细胞的细胞毒性。没有观察到显著变化在细胞生存能力与宽带孵化后24 h浓度的10 - 200纳米(图1(一))。然后,评估宽带的保护作用,ARPE-19细胞暴露于不同浓度的H2O224 h。如图1 (b)ARPE-19细胞经历了H2O2孵化50 - 100的浓度μ米,而细胞生存能力降低了剂量依赖性的方式在200年和300年μ300 m .此外,治疗μM H2O2抑制细胞生存能力的大约50%。基于这些结果,ARPE-19细胞首先受到宽带在不同浓度24 h,然后孵化与h2O2(300μ米)另一个24小时。显著,宽带显著减毒H2O2全身的细胞毒性效应增加了75%的细胞生存能力当ARPE-19细胞被cotreated宽带在100纳米(图的浓度1 (c))。ARPE-19细胞形态变化也被评估。孵化与H2O2导致明显的细胞变化,如细胞收缩。然而,与宽带coincubation减少这些形态变化引起的H2O2(图1 (d))。
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3.2。宽带抑制H2O2全身在ARPE-19细胞氧化应激
评估宽带在氧化应激的影响,ROS生成评估。如图2(一个)H2O2诱导活性氧表达显著增加。相对,cotreatment宽带的调节水平显著降低活性氧引起的H2O2。类似的趋势也发生在ROS的定量评估流式细胞术(数字2 (b)和2 (c))。,脂质过氧化产物MDA是一种生物标记物的氧化损伤(31日]。ARPE-19细胞MDA水平显著增加(-4.95倍)在H2O2治疗,但这种增长是明显被宽带治疗(图2 (d))。氧化应激产生由于氧化剂和抗氧化剂之间的氧化还原平衡系统的细胞。SOD和谷胱甘肽被视为重要的部分在一个复杂的抗氧化防御系统,防止细胞损伤细胞的清除ROS (32]。我们发现H2O2刺激SOD和谷胱甘肽水平降低了58%和43%,分别比未经处理的控制,而预处理与宽带减毒引起的减少H2O2(数据2 (e)和2 (f))。
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3.3。宽带改善凋亡细胞死亡在ARPE-19细胞氧化应激
评估宽带是否能保护ARPE-19细胞凋亡细胞死亡,我们通过流式细胞仪确定了细胞凋亡,免疫荧光和免疫印迹。如数据所示3(一个)和3 (b),凋亡细胞的数量明显增加了氧化应激条件下的13.9倍。然而,治疗与宽带表现出显著的抑制作用ARPE-19细胞诱导的细胞凋亡2O2。此外,我们执行TUNEL染色,观察到类似的结果(数据3 (c)和3 (d))。bcl - 2 (b细胞lymphoma-2)家族蛋白起着重要的作用在调节mitochondria-dependent外在和内在的细胞凋亡。这个家庭的蛋白质主要是分为不同的凋亡和proapoptotic类,其中凋亡bcl - 2和proapoptotic伯灵顿(bcl - 2相关X-protein)在调节细胞凋亡发挥核心作用[33]。随后,应用免疫印迹评价伯灵顿/ bcl - 2比例伴随着下游蛋白裂解caspase-3。如数据所示3 (e)- - - - - -3 (g),免疫印迹结果表明,H2O2大大增加了伯灵顿/ bcl - 2比例和表达水平的裂解caspase-3 60%和43%,分别。然而,宽带干预可能会扭转效应引起的H以上2O2。这些结果表明,宽带发挥保护作用对H2O2通过antiapoptosis全身的细胞氧化损伤。
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3.4。宽带促进自噬在H2O2对待ARPE-19细胞
自噬是复杂各退化性疾病与细胞凋亡有关。异常的自噬与AMD有关报道。一些证据表明,自噬作为中介在维持活性氧平衡保护ARPE-19细胞免受氧化应激(13,15]。确定宽带可以激活自噬在ARPE-19细胞,我们检查了自噬蛋白免疫印迹。结果表明,ATG5蛋白表达和LC3-II / LC3-I比率增加,伴随着减少P62表达式在宽带刺激剂量依赖性的方式(数字4(一)和4 (b))。进一步研究自噬促进了宽带,ARPE-19细胞治疗与自噬抑制剂3-methyladenine (3-MA)。3-MA治疗在一定程度上减少了自噬过程由宽带,3-MA ATG5表达减少和LC3-II / LC3-I 26%和41%的比例,分别,而p62的积累增加了104%与治疗相比,宽带(数字4 (c)和4 (d))。确认DCN-induced自噬的激活,透射电子显微镜(TEM)超微结构分析作为自噬检测的金标准。TEM图像数量的增加表明,自噬空泡被观察到在DCN-treated ARPE-19细胞,但不是在控制细胞,和cotreatment 3-MA抑制自噬小体的形成引起的宽带(图4 (e)和S1)。进一步证实自噬和验证宽带诱导的自噬流量变化,bafilomycin A1 (Baf)、H + atp酶抑制剂,用于在自噬抑制自噬体与溶酶体的融合。如数据所示4 (f)和4 (g),Baf显著增加的比率LC3-II / LC3-I和55%的p62表达36%,下调ATG5表达26% DCN-treated ARPE-19细胞治疗相比,宽带。此外,我们评估ARPE-19细胞自噬流量使用adenovirus-mediated mRFP-GFP-LC3。转导ARPE-19细胞的自噬小体mRFP-GFP-LC3,表现出红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP),显示为黄色的点。相比之下,只有红点观察自吞噬泡,因为绿色GFP荧光消除在溶酶体的酸性环境。宽带的数量显著增加自噬体和自吞噬泡与控制细胞相比,表明高水平的自噬流量。然而,红色的数量自吞噬泡拒绝Baf在场的情况下自噬流量(图的堵塞4 (h)和S2)。
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3.5。宽带抑制H2O2全身的氧化应激在Autophagy-Dependent方式
进一步调查宽带对氧化应激的保护作用是否在ARPE-19 autophagy-dependent细胞,我们下一个沉默的表达autophagy-related蛋白5 (ATG5),这对自噬是必不可少的。如数据所示5(一个)和5 (b),沉默ATG5 siRNA导致ATG5蛋白表达水平明显下降。氧化应激引起的H2O2导致增强p62积累但没有改变ATG5蛋白质水平和LC3-II / LC3-I比率。正如所料,宽带治疗减少p62的表达水平,同时增加ATG5表达式和LC3-II / LC3-I比率。然而,基因抑制ATG5减少诱导的自噬促进宽带在氧化应激(数字5 (c)和5 (d))。此外,ATG5消声减毒宽带对氧化应激的保护作用增强了活性氧积累109%宽带下治疗H2O2刺激(数据5 (e)和5 (f)和S3)。类似的结果观察MDA的表达水平、SOD,谷胱甘肽(图5 (g))。同时,宽带的凋亡效应对氧化应激显著受ATG5击倒(数字6(一)- - - - - -6 (f))。
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3.6。通过AMPK-mTOR宽带诱导自噬通路
自噬是由各种信号通路的调节。在这些途径中,活化蛋白激酶(AMPK) /哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)是参与调节自噬在氧化应激(34]。如数据所示7(一)- - - - - -7 (d)H2O2刺激的磷酸化AMPK降低了52%,且增加了mTOR的磷酸化及其下游目标p70S6K 18%和13%,分别。治疗与氧化应激下宽带p-AMPK的表达水平增加了375%,而减少的磷酸化水平mTOR和p70S6K 27%和24%,分别为(数字7(一)- - - - - -7 (d))。进一步阐明在DCN-induced AMPK-mTOR自噬的作用,ARPE-19细胞治疗AMPK抑制剂化合物C或mTOR活化剂MHY1485宽带运前治疗。复合C抑制AMPK-mTOR由宽带信号通路引起自噬促进氧化应激。同样,mTOR活化剂MHY1485用于激活mTOR信号,导致衰减DCN-induced自噬(数字7 (e)- - - - - -7 (k))。以上这些结果表明自噬诱导的宽带ARPE-19细胞依赖于AMPK-mTOR信号通路。
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4所示。讨论
AMD造成的不可逆转的视力损害已成为一个重要的临床问题,影响生活质量在全世界的人(1]。有两种形式的高级AMD:湿和干AMD。目前,intravitreal vegf的管理被视为一个标准的治疗湿性AMD的预期的安全性和有效性。但仍然没有有效的治疗干预干AMD (6]。大量研究表明,氧化应激是一个关键的中介RPE死亡或功能障碍的病理生理学的AMD (9,14,35]。通过这种方式,方法,旨在减轻氧化应激在AMD发展治疗干AMD有成功的希望。
在目前的研究中,一个可靠的在体外细胞模型建立,宽带对氧化应激的保护作用进行了研究。宽带是SLRP家族的一员,广泛分布在各种结缔组织,作为重要的监管机构在生理过程21]。之前的研究报道,宽带可以防止氧化应激在glucose-induced晶状体上皮细胞凋亡(23]。在肾脏和神经组织,管理的宽带腹腔内改善MDA水平,增加SOD水平(27,36]。在这项研究中,ARPE-19细胞的生存能力下降了大约50%,H2O2全身的氧化应激,而预处理与宽带增加细胞活力和阻碍了H的氧化损伤2O2反射的刺激,降低MDA和细胞内ROS生产。宽带治疗也增加了SOD的活性和ARPE-19细胞中谷胱甘肽,类似于以前的报告在宽带的氧化作用对创伤后脑损伤(27]。H2O2全身的氧化应激也促进齐聚的伯灵顿,apoptosis-related版本的蛋白质在细胞质中,诱导半胱天冬酶激活,因此导致细胞凋亡(37]。在目前的研究中,我们发现,预处理与宽带的表达水平显著下降和伯灵顿cleaved-caspase 3在bcl - 2表达增加氧化应激。这些发现表明,宽带在阻碍H中起着重要的作用2O2全身ARPE-19细胞氧化应激和细胞凋亡,表明宽带显示潜在的治疗方法在未来干AMD。
自噬是细胞新陈代谢的关键过程和在氧化应激适应中起着重要作用15]。表达下调RPE细胞自噬与AMD的易感性增加氧化应激(38]。先前的研究发现,宽带可以激活自噬在不同种类的细胞包括神经胶质瘤,人类肝癌HepG2,内皮细胞和髓核细胞(22,23,39,40]。探讨宽带对氧化应激的保护机制,自噬标记进行评估。在目前的研究中,我们发现宽带治疗自噬活动增加剂量依赖性的方式,提高了自噬蛋白ATG5。ATG5自噬小体的前体和参与是至关重要的自噬小体的形成,和损失ATG5抑制自噬的41]。进一步确定自噬是否参与了宽带对氧化应激的保护作用,ATG5沉默在ARPE-19细胞抑制自噬。我们观察到宽带显著促进自噬ARPE-19通量和保护细胞免受氧化损伤,但这种影响主要是减少ATG5沉默后,表明宽带ARPE-19细胞autophagy-dependent地保护。
有趣的是,我们注意到如图所示的自噬水平降低了中p62表达升高的H2O2对待ARPE-19细胞,一些研究者持有不同意见,氧化应激可以诱导自噬(18]。事实上,它也被报道,氧化应激要么增加或减少自噬活动。在瞬态氧化应激反应,自噬可能与增加活动作为一种自我保护的作用,帮助重建之间的平衡生产和清除活性氧。然而,氧化应激在各种老年性退行性疾病,包括AMD,往往是持久的18,42]。在这种情况下,自噬活动是特异表达,自噬缺陷最终会增加氧化应激由于无法消除有害受损细胞器,为AMD发展,这是符合先前的研究自噬的作用在骨关节炎(43]。
此外,我们调查了潜在宽带诱导自噬的分子机制。AMPK-mTOR调节自噬中扮演着重要的角色。自噬被AMPK提拔,这是一个关键的能源传感器和一个重要的中介在维持细胞内稳态。相反,自噬抑制mTOR,起着关键作用的界面协调的途径调节细胞生长和自噬以响应之间的平衡营养状况、生长因子、压力信号(34,44]。细胞衰老和衰老的过程中,如在RPE细胞的AMD患者,减少的磷酸化AMPK和应对mTOR活动可以观察到45]。调查AMPK-mTOR是否参与了自噬的激活信号宽带治疗后,ARPE-19细胞首先对待AMPK抑制剂化合物C或mTOR活化剂MHY1485宽带运前治疗。我们发现自噬的诱导宽带与3-MA或MHY1485 coincubation之后完全逆转。这些结果表明,宽带激活AMPK抑制mTOR和促进细胞自噬在ARPE-19 AMPK-dependent方式,与先前的研究,观察到宽带诱发自噬通过调节内皮AMPK-mTOR信号,髓核,和神经胶质瘤细胞22,39,46]。
新兴的证据表明,自噬是一把双刃剑在各种生理和病理生理过程47]。调节自噬调控仍然是复杂的和有一个临界点48]。在大多数情况下,当自噬是温和的激活与自噬的水平低于临界点,自噬作为cytoprotective机制,清除受损细胞组件。然而,当自噬水平高于临界点,overactivation自噬可能导致细胞死亡和凋亡引发自噬细胞死亡通路和失去cytoprotective功能,相反的我们的目标(47,48]。探讨长期接触的宽带是否会产生细胞毒性影响ARPE-19细胞,我们孵化ARPE-19细胞与宽带4天,发现宽带没有表现出任何的治疗抑制细胞增殖与未经处理的控制(图S4),这意味着宽带不会长期接触后引起细胞毒性。可能的机制可能与一个负面的反馈机制称为自噬溶酶体的形成(规律)。
规律储备在激活自噬溶酶体恢复体内平衡,耦合自噬的诱导和戒烟49,50]。先前的研究已经表明,规律需要mTOR的激活。mTOR的重新激活启动规律来补充保护溶酶体的溶酶体池体内平衡(50,51]。在我们的研究中,虽然mTOR的激活降低宽带刺激后短时间内,mTOR的磷酸化逐渐恢复到基线在治疗长期宽带(图S5),这意味着宽带担任一个重要的角色在维护溶酶体体内平衡在长期被重新激活mTOR孵化。然而,需要更全面的研究来阐明宽带的确切作用在自噬溶酶体生物学的监管。
5。结论
综上所述,我们证明了宽带对氧化应激和细胞凋亡的保护作用促进自噬AMPK-mTOR ARPE-19细胞介导的信号。我们的研究不仅提供了新的见解的药理机制宽带对氧化应激也支持治疗的潜在宽带在AMD的预防和治疗。
数据可用性
原始数据支持了本文的结论将由作者提供合理的请求,没有过度的预订。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由无锡太湖人才支持计划,支持领导人才医疗卫生行业(没有。2020 - thrctd - 1)。
补充材料
图S1:量化的20个细胞自噬小体条件。数据显示为 和 。图S2: ARPE-19细胞转染mRFP-GFP-LC3和宽带处理。黄自噬小体的数量(R + G)和红自吞噬泡(R + G +)量化。数据显示为 和 。图S3: ROS荧光强度的定量分析。数据显示为 和 。图S4:相对ARPE-19细胞生存能力与宽带孵化后表示次。细胞生存能力由CCK8决定。图S5: p-mTOR的蛋白质含量β在ARPE-19细胞肌动蛋白。ARPE-19细胞处理宽带表示时间。p-mTOR /的密度β肌动蛋白进行了分析。数据显示为 , ,和 。(补充材料)