文摘

头发细胞死亡引起过多的活性氧(ROS)已被确定为噪音性听力丧失的主要发病机理(NIHL)。最近的研究表明,顺铂,neomycin-induced耳毒性可以缓解ferroptosis抑制剂。然而,对NIHL ferroptosis抑制剂是否有保护作用仍然是未知的。我们调查的保护作用ferroptosis抑制剂ferrostatin-1 (Fer-1) NIHL CBA / J小鼠体内的保护作用研究Fer-1对叔丁基氢过氧化物(TBHP)全身在耳蜗毛细胞损伤体外外植体和HEI-OC1细胞。我们观察到ROS过载和脂质过氧化反应,导致外毛细胞(OHC)凋亡和ferroptosis噪声暴露后的小鼠耳蜗。凋亡诱导因子的表达水平mitochondria-associated 2 (AIFM2)大幅增加后海拔噪声暴露后上游P53蛋白的表达。ferroptosis抑制剂Fer-1was演示后进入内耳的系统性管理。管理Fer-1显著减轻噪音性听觉阈值升高和降低ohc的损失,内毛细胞(包含IHC)带状突触和听觉神经纤维(曾帮工)由噪声引起的。从力学上看,Fer-1显著降低噪音,TBHP-induced毛细胞脂质过氧化和铁积累,减轻ferroptosis因而在耳蜗细胞。此外,Fer-1治疗TfR1的水平下降,P53, AIFM2。 These results suggest that Fer-1 exerted its protective effects by scavenging of ROS and inhibition of TfR1-mediated ferroptosis and P53-AIFM2 signaling pathway-mediated apoptosis. Our findings suggest that Fer-1 is a promising drug for treating NIHL because of its ability to inhibit noise-induced hair cell apoptosis and ferroptosis, opening new avenues for the treatment of NIHL.

1。介绍

听力损失是最常见的感觉障碍,严重影响了超过15亿人的生活质量(1]。在社会发展,个人通常暴露于工业噪声、交通噪声和娱乐噪声不同的强度(2- - - - - -5听到],它构成了严重威胁。噪音性听力丧失(NIHL)的特点是海拔高强度造成的听力阈值或慢性噪音,也会导致其他生理和心理疾病,包括心血管疾病、睡眠障碍和焦虑3,6- - - - - -8]。

高强度噪声导致耳蜗毛细胞的死亡,包括内毛细胞(包含ihc)和外毛细胞(ohc) [9- - - - - -11]。然而,根据研究动物模型和人类的尸体解剖,ohc更容易受到噪声比包含ihc [12- - - - - -14]。在哺乳动物毛细胞无法再生,所以失去了毛细胞造成永久性的阈值变动(PTS) [15]。尽管噪音性毛细胞丢失的详细机制仍不清楚因为它的复杂性,能够很好的接受,代谢损害,包括氧化应激损伤、Ca^{2 +}过载,免疫和炎症损伤,(9,10,16- - - - - -18]。暴露在噪声中,新陈代谢耳蜗发生在一个非常高的水平,导致大量能源的消费和生产的活性氧(ROS) (12,19,20.]。氧化应激损伤毛细胞NIHL(被认为是主要的机制21]。然而,尽管一些抗氧化剂已经被证实对NIHL发挥保护作用在动物模型(22,23),NIHL有几乎没有有效的药物治疗。

Ferrostatin-1 (Fer-1),合成抗氧化剂,被广泛公认为可以抑制ferroptosis [24- - - - - -26]。Ferroptosis,首次提出在2012年迪克森(27),已被确定为一个新的模式不同于凋亡的细胞死亡和沉积特征的铁和脂质过氧化作用。过氧化反应细胞膜的磷脂组成的,主要过程潜在ferroptosis [28,29日]。酰coa合成酶长链家庭成员4 (ACSL4)是关键酶的合成不饱和酰尾巴(PL-PUFAs),因此在ferroptosis[中起着至关重要的作用30.]。铁转铁蛋白受体1 (TfR1)传输到细胞质和促进ferroptosis芬顿反应。谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)谷胱甘肽轴验证消除peroxidized PL-PUFAs抑制ferroptosis [29日]。Ferroptosis已被证实与许多疾病的病理过程,包括神经退行性疾病、中风、创伤性脑损伤、急性肾损伤,和癌症(25,31日,32]。最近,这是表明,抑制ferroptosis Fer-1或Liproxstatin-1(另一个ferroptosis抑制剂)能有效保护头发细胞对顺铂或neomycin-induced耳毒性(33- - - - - -36]。然而,是否Fer-1治疗施加cytoprotective效应对NIHL尚未报道。

凋亡诱导因子mitochondria-associated 2 (AIFM2)缺乏线粒体定位序列但与凋亡诱导因素有着显著的同源性(AIF)和NADH氧化还原酶从细菌到哺乳动物物种,P53的下游目标(37,38]。AIFM2 non-sequence-specific方式可以结合DNA诱导caspase-independent凋亡[39]。一些研究人员报道,AIFM2在腺泡细胞凋亡中起着重要的作用通过ATF6-P53-AIFM2轴(严重急性胰腺炎40]。最近,据报道,AIFM2起到至关重要的作用在抑制ferroptosis ubiquinone-dependent方式(41,42]。然而,AIFM2调节头发细胞死亡的机制尚不清楚。

在这项研究中,我们探讨了保护作用对NIHL Fer-1使用体内小鼠模型和体外氧化应激模型(耳蜗移植组织和HEI-OC1细胞)。此外,我们探讨了氧化应激在这两个模型的底层机制。我们评估能力的系统性管理Fer-1减轻噪音性听力阈值升高,OHC损失,耳蜗突触损伤,和听觉神经纤维(曾帮工)退化。我们假设Fer-1保护听力通过清除ROS和抑制TfR1-mediated ferroptosis和P53-AIFM2 pathway-mediated凋亡信号。

2。方法

2.1。动物

CBA / J小鼠从杰克逊实验室购买,在我们的实验室。所有的老鼠有免费的水和食物,一直在 在一个12°C: 12 h光暗周期。雌性老鼠为本研究选择。基线听觉脑干反应(核)记录在9周。老鼠被暴露于噪声时体重达到20 ~ 23 g(10周。所有动物实验程序制度动物保健和使用委员会批准空军医科大学。

2.2。药品监督管理局

我们解散Fer-1 (Sigma-Aldrich SML0583)在DMSO (MP生物医学,196055)准备一个190毫米原液在4°C和存储它。储备溶液被稀释到适当的浓度(10毫克/公斤)在盐水含20% SBE -βcd (MedChemExpress hy - 1703)之前立即注入。老鼠Fer-1治疗组共3腹腔内注射(i.p),用于免疫组织化学,RNA提取,和蛋白质提取。确定ABR阈值,我们管理2额外ip注射的小鼠第二天(上午和下午)。solvent-control组的小鼠注射DMSO在SBE——20%βcd盐水。

2.3。听觉脑干反应(ABR)测量

我们使用ABR阈值来评估小鼠听力功能。核记录7 d之前和噪声暴露后14 d如前所述[20.]。简单地说,我们适当的麻醉小鼠腹腔注射1%戊巴比妥。然后,老鼠放在附近的一个加热垫保持体温37°C。三个皮下的电极插入顶点的头骨(活动),左乳突区域(参考),和右乳突区域(地面)。核记录8、16和32 kHz闭域语气脉冲刺激通过使用Tucker-Davis技术(TDT) RZ6系统(美国FL Alachua)。1024每个刺激反应平均水平。我们使用ABR波二世决定ABR阈值为每个频率。阈值确定的最低强度引起的波。上测量都是由相同的实验者。

2.4。噪声暴露

女性CBA / J小鼠暴露于噪声分别放置在单独的笼子里(厘米³)安装在一个隔音室。老鼠能够无拘无束地在噪声暴露。宽带噪声(BBN)在99 ~ 100 dB 2 - 20 kHz RZ6噪声产生的软件。由功率放大器放大后(皇冠,XLi800),所产生的噪音是输出4喇叭(CHUANGMU, cp - 75 a),位置就在笼子上面。周围的噪声级的笼子是由一个声级计监测,确保噪声暴露的一致性。控制老鼠暴露在相同条件没有噪声暴露2 h。

2.5。免疫细胞化学耳蜗表面准备

以前的出版物中描述的详细过程(20.,43]。简单地说,老鼠噪声暴露后深麻醉和牺牲1 h。然后,耳蜗被轻轻地用4%多聚甲醛灌注(PFA)。后固定在4% PFA一夜之间在4°C, cochleae脱钙4% EDTA溶液在4°C 5 d(解决方案是改变每一天)。脱钙作用后,我们仔细地孤立的螺旋器消除周围组织。然后,我们把听觉上皮切成四转(顶点、中间、基地和钩)。然后,我们遵循这些标本与Cell-Tak盖玻片。组织与1% permeabilized Triton x - 100在室温下30分钟。与10%阻塞后正常室温下驴血清1 h,标本是孵化主要抗体。

可视化包含IHC突触,标本孵化用下面的抗体在一夜之间37°C:肌球蛋白VIIa抗体(变形杆菌生物科学,sc - 74516;1:1000),CtBP2 IgG1抗体(BD生物科学,# 612044;1:500)和GluR2 IgG2a抗体(微孔,# MAB397;1:2000)。3洗后用PBS, Alexa的标本被孵化萤石647 -共轭山羊anti-mouse IgG1(表达载体,A21240), Alexa萤石488 -共轭山羊anti-mouse IgG2a(表达载体,A21131)和Alexa萤石568 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(表达载体,A11036)稀释1:500 1 h在37°C在黑暗中,然后一夜之间在4°C。

评估其他目标,标本孵化一夜之间在4°C以下抗体:4-HNE抗体(GeneTex GTX17571;1:100)和3 nt抗体(Abcam ab110282;1:100)。与PBS 3洗后,标本沾Alexa萤石594 -共轭驴anti-mouse免疫球蛋白(表达载体,A21203)稀释1:500一夜之间在4°C。与PBS 3洗后,标本沾Alexa萤石488 -共轭phalloidin(细胞骨架,Inc . # PHDG1)稀释1:60和DAPI(罗氏,10236276001)稀释1:在室温下1000 30分钟。

对于头发细胞计数,我们培养的标本肌凝蛋白VIIa抗体(变形杆菌生物科学,# 25 - 6790)稀释1:1000一夜之间在4°C。与PBS 3洗后,标本沾Alexa萤石594 -共轭驴anti-rabbit免疫球蛋白(表达载体,A21207)稀释1:500一夜之间在4°C。与PBS 3洗后,标本染色phalloidin和DAPI如上所述在黑暗中在室温下为30分钟。

最后,所有标本洗3次在黑暗中与PBS和另一个盖玻片覆盖着。然后,我们用指甲油密封边缘。图像是由共焦激光扫描显微镜(奥林巴斯,FV1000)。

2.6。免疫组织化学的冷冻耳蜗部分

冷冻耳蜗部分得到如前所述[19]。短暂,老鼠深麻醉和牺牲1 h或噪声暴露后28 d。耳蜗是收获,固定、脱钙如上所述。梯度脱水后在10%、20%、和30%的蔗糖,标本是嵌入在最佳切削温度(10月)化合物。然后,8μ米冻结部分是由低温恒温器切片机(徕卡,CM1860)。适当的透化作用和阻塞后,标本孵化与以下主要抗体在一夜之间在4°C:肌球蛋白VIIa抗体(变形杆菌生物科学,# 25 - 6790;1:1000),Tuj1抗体(GeneTex GTX631836;1:200),4-HNE抗体(GeneTex GTX17571;1:100),3 nt抗体(Abcam ab110282;1:100),Tuj1抗体(Abcam ab78078;1:1000),P53抗体(Abcam ab26;1:200),GPX4抗体(Abcam ab125066;1:200),SOD2抗体(GeneTex GTX116093 1: 200), ACSL4抗体(Abcam ab155282;1:100)和AIFM2抗体(圣克鲁斯生物技术、sc - 377120; 1 : 50). After 3 washes with PBS, the specimens were incubated with Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-mouse IgG (Invitrogen, A21203) diluted 1 : 500 and Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG (Invitrogen, A21206) diluted 1 : 500 overnight at 4°C. After 3 washes with PBS, the specimens were stained with DAPI diluted 1 : 1000 for 30 min at room temperature. Finally, the specimens were sealed appropriately. Images were taken by a confocal laser scanning microscope (Olympus, FV1000).

2.7。整个耳蜗组织匀浆和免疫印迹

免疫印迹分析如前所述[19]。简单地说,老鼠噪声暴露后深麻醉和牺牲1 h。然后,我们收获的耳蜗冰。我们均质耳蜗组织工作缓冲区(里帕缓冲区包含蛋白酶抑制剂)通过使用低温研磨机。混合物在冰上孵化了30分钟,然后离心机(12000 rpm, 20分钟,4°C)。一个整除每个上层清液的收集,蛋白质含量是由BCA工具包(Beyotime PQ003);剩下的上层清液添加了加载缓冲区和储存在-20°C。大约30μ克蛋白质从每个样本被sds - page分离,然后转移到PVDF膜(微孔,IPVH00010)。然后,膜被5%的脱脂牛奶在室温下TBST 1 h。膜是孵化与以下主要抗体:4-HNE抗体(GeneTex GTX17571;1:2000),3 nt抗体(Abcam ab110282;1:1500),P53抗体(Abcam ab26;1:2000),TfR1抗体(表达载体,13 - 6890;1:2000),GPX4抗体(Abcam ab125066;1:2000),ACSL4抗体(Abcam ab155282;1:4000),AIFM2抗体(圣克鲁斯生物技术、sc - 377120;1:500),SOD2抗体(GeneTex GTX116093 1: 2000),如果抗体(GeneTex GTX113306 1: 2000),伯灵顿抗体(GeneTex GTX109683 1: 2000)和GAPDH抗体(GeneTex GTX100118; 1 : 5000) overnight at 4°C. Following 3 washes with TBST, the membranes were incubated with an appropriate secondary antibody diluted 1 : 2000 for 1 h at room temperature. After sufficient rinsing, the immunoreactive bands were visualized using Immobilon® Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, WBKLS0100).

2.8。RNA提取中存在的分析

的转录水平TfR1 GPX4, P53, AIFM2, ACSL4,如果,SOD2,伯灵顿被存在测量。老鼠( 为每个组)噪声暴露后被牺牲1 h(第三次注射后)总RNA的提取。总RNA提取使用RNeasy +迷你包(试剂盒,# 74134)根据制造商的指示。的引物序列中存在分析表中列出S1。计算的相对mRNA转录水平2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。

2.9。耳蜗外植体培养和药物治疗

耳蜗外植体获得如前所述[44]。总之,在P3 Sprague-Dawley老鼠幼仔牺牲,颞骨收集在汉克的平衡盐溶液。然后,我们小心翼翼地孤立的听觉上皮。标本放在半成品表面胶原凝胶沉浸在无血清培养系统1毫升BME介质(SFM)。然后,耳蜗外植体在孵化器孵化(37°C, 5%有限公司₂)为4 h,加入1毫升SFM紧随其后。第二天,耳蜗Fer-1对照组和外植体 (TBHP) 40组使用μM Fer-1 24 h。第三天,耳蜗TBHP集团和外植体 100年组处理μM TBHP (3 h Sigma-Aldrich, 458139)。然后,耳蜗移植组织的团体都是固定的,如上所述permeabilized,阻塞。耳蜗移植组织的孵化与肌球蛋白VIIa标签毛细胞。最后,所有标本与DAPI染色和密封。

2.10。细胞培养和细胞生存能力分析

HEI-OC1细胞在DMEM培养(HyClone SH30243)含有10%的边后卫(Gibco, 10099)和1%青霉素和链霉素溶液在37°C (HyClone SH40003) 5%的股份有限公司₂。细胞生存能力分析中,我们使用一个细胞计数kit-8 (CCK-8)根据制造商的指示(植物化学药,pc - 1050 - 1)。简单地说,细胞被播种在96 -孔板(5000个细胞/)和孵化24 h。然后,细胞使用Fer-1 24小时。与250年的细胞治疗μM TBHP 90分钟,然后培养基是10所取代μL 90年CCK-8试剂μL新鲜DMEM。2 h细胞被孵化的37°C,和吸光度是决定在450海里一盘读者(BioTek时代™)。

2.11。细胞内ROS和脂质过氧化作用的评估

MDA水平测量评估脂质过氧化(Dojindo M496)。简单地说,老鼠深麻醉和灌注0.9%生理盐水1 h噪声暴露后。然后,耳蜗被迅速在冰上,含有抗氧化剂和耳蜗组织均质在PBS低温研磨机。离心后( ,5分钟,4°C), 200μL整除的上层清液被转移到一个新管。然后,我们增加了200μl(裂解缓冲到新管。涡流之后,我们孵化反应混合物在室温下为5分钟。300年之后,μL工作的解决方案是添加到管,和样品在95°C的环境,持续15分钟。在冰浴冷却5分钟后,所有管离心机 10分钟在4°C。最后,我们增加了200μL反应混合物的96孔板和吸光度的测量在532 nm的标(BioTek时代™)。

我们使用Liperfluo (DojinDo实验室、L248)来评估在耳蜗移植组织脂质过氧化TBHP对待。简而言之,样本与SFM洗两次。然后,40μM Liperfluo工作的解决方案是添加到样本,样本和孵化为30分钟37°C孵化器。用SFM两次,洗净后的样本固定免疫荧光染色如上所述。

我们使用DCFH-DA (Sigma-Aldrich D6883)来评估在HEI-OC1细胞活性氧积累。简单地说,HEI-OC1细胞与冷PBS洗两次。然后,50μM DCFH-DA工作的解决方案是添加到样本,样本和孵化为30分钟37°C孵化器。最后,样本固定在4% PFA和用DAPI标记。

2.12。细胞内铁的评估

我们使用FerroOrange (Dojindo实验室、F374),一种新型荧光探针,使细胞内铁的标签^{2 +}评估铁的变化^{2 +}浓度在耳蜗移植组织TBHP对待。简单地说,人工耳蜗移植组织和SFM洗两次。然后,5μM FerroOrange工作的解决方案是添加到样本,样本和孵化为30分钟37°C孵化器。最后,对免疫荧光染色如上所述样本固定。细胞样本,FerroOrange工作解决方案是2的浓度μM。

2.13。流式细胞术

与流式细胞术测定细胞凋亡进行了分析使用一个膜联蛋白V-FITC /π工具包(BD生物科学Pharmingen, 556547)。简而言之,HEI-OC1细胞被洗冷PBS和resuspended 在一个集中的 细胞/毫升。然后,膜联蛋白V-FITC propidium碘被添加和孵化在黑暗中在室温下15分钟。最后,贝克曼的样本分析流式细胞分析仪在1 h。

2.14。TUNEL分析

我们使用TUNEL分析工具包(罗氏12156792910)评价DNA链断裂在细胞发生凋亡。简而言之,HEI-OC1细胞被洗冷PBS PFA和固定在4%。透化作用后,100μL (TUNEL反应混合物被添加到每个样本60分钟的孵化37°C。最后,样本与DAPI标记。

2.15。半定量的分析,荧光信号

美国ImageJ软件(版本1.53)是用于semiquantification荧光信号。短暂,4-HNE的荧光强度和3 nt从原始测量共焦图像从每个实验在相同的设置。Phalloidin(绿色)和DAPI(蓝色)对比染色进行识别上凸轮轴。

内荧光强度上凸轮轴测量基准(耳蜗的~ 32 kHz),然后每个细胞的平均荧光强度计算。最后,相对的值的计算是通过规范化的价值。

2.16。头发细胞和突触数量

最后ABR测试后,我们收获耳蜗和耳蜗表面的准备工作做好了准备。捕捉到的图像 奥林巴斯共焦显微镜。毛细胞从顶点数通过基础计算描述的损失率穆勒的(45]。然后,我们生成了一个cytocochleogram确定的百分比毛细胞丢失(11]。

包含IHC带状突触,量化的图像捕获的 ( )在奥林巴斯共焦显微镜分析了在120年μm片段(包含大约12包含ihc)的表面准备对应的频率大约16赫兹。只有地区CtBP2(红色)和GluR2(绿色),与被认为是配对(功能)突触。成对的突触的总数统计,平均每个包含IHC的配对突触数量计算。

2.17。Coimmunoprecipitation (coIP)测定

检测蛋白质之间的相互作用,HEK293细胞转染FLAG-P53和培养在37°C公司5%₂过夜。第二天,HEK293细胞细胞溶解与IP缓冲区(含蛋白酶抑制剂)对冰20分钟。离心(12000 rpm, 20分钟后,4°C),上层的收集。磁珠(微孔,LSKMAGG02)用PBS含有0.1%渐变20 (PBST),然后孵化anti-FLAG平方米(Sigma-Aldrich SLBT7654)在室温下10分钟(连续混合)。与PBST 3次洗后,珠子是孵化与蛋白质上层清液在4°C连续搅拌过夜。第二天,珠子是洗3次PBST和蛋白质复合体与洗脱缓冲筛选了的珠子。最后,通过免疫印迹分析样品。

2.18。外淋巴提取和样品制备

如前所述执行外淋巴提取和样品制备(19]。小鼠腹腔注射Fer-1 10毫克/公斤。15分钟、1 h和3 h注入后,这些老鼠被斩首,cochleae被移除。然后外淋巴(约1μL)收集使用自定义穿刺圆窗膜管的耳蜗。之后,收集外淋巴添加到500年μL的甲醇。涡流后,样品被过滤,0.22um过滤器。液体是收集并用于液相色谱串联质谱(质/ MS)分析。

2.19。色谱分离和MS / MS检测

质/ MS分析与质谱计(日本岛津制作所,lcms - 8050)如前所述[19]。安捷伦C18柱( 毫米身份证。,1.9μ米颗粒大小)是用于执行色谱分离。进样体积是5μl .列温度保持在35°C。然后,流动相的梯度(0.1% (v / v)甲酸5毫米醋酸铵)和移动阶段B(乙腈)运行在0.4 mL / min。积极的MS / MS分析电喷雾电离(ESI +)模式。源温度保持在400°C。离子喷涂电压是4500 V。离子的检测是在多反应监测(MRM)模式,监测过渡 263.35→180.95 Fer-1。的量化分析了外淋巴中的Fer-1计算峰面积比率使用外部标准。

2.20。统计数据

使用GraphPad棱镜进行了统计分析软件(版本8.0,美国)。比较组间分析单向方差分析(方差分析)和Sidak多个对比测试是用来评估两组之间的差异。OHC损失沿耳蜗螺旋的长度进行了分析与双向方差分析Sidak紧随其后的多重比较测试。一个< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。所有的数据的 (SD)。

3所示。结果

3.1。Fer-1后进入内耳的系统性管理

为了调查Fer-1是否存在于内耳系统管理后,我们分析的浓度Fer-1外淋巴的小鼠耳蜗使用液相色谱串联质谱(质/ MS)。外淋巴提取15分钟,1 h,注射后3小时以内和Fer-1用于检测和量化。如图S3,外淋巴Fer-1的保留时间为5.761分钟。质荷比( )父离子是263.35的,一致的相对分子质量Fer-1氢离子。在15分钟,1 h,注射后3小时以内,外淋巴的Fer-1小鼠耳蜗的浓度分别为2.077,0.301和0.122μ分别g / L。这些结果表明,Fer-1可以进入内耳。

3.2。管理Fer-1减噪音性ABR阈值变化

评估Fer-1的保护作用,实验过程如图1是执行。四组老鼠的听觉功能(DMSO控制、Fer-1控制, ,和 )测试通过测量ABR在8、16、32 kHz 7 d前(基线ABR)和噪声暴露后14 d。ABR在四组中明显不同的老鼠在8 kHz ( , ),16赫兹( , ),和32 kHz ( , ),分析了单向方差分析。没有显著差异之间的基线ABR阈值(图组S1)。在8 kHz ( ),16赫兹( ),和32 kHz ( ),ABR阈值显著增加在噪声暴露组与对照组相比(图2(一个))。相比与组小鼠暴露于噪声( 组vs。 组),Fer-1-treated组表现出显著的减噪音性听力阈值变化的8 kHz ( ),16赫兹( ),和32 kHz ( )(图2(一个))。此外,ABR阈值的老鼠接受Fer-1没有差别的老鼠在DMSO组。这些结果表明Fer-1能够减弱噪音性ABR阈值管理转变。

3.3。管理Fer-1阻止OHC噪声暴露引起的损失

进一步评估Fer-1的保护作用对噪声暴露,然后我们计算头发细胞的数量,这是沾phalloidin(绿色)和肌凝蛋白标记VIIa(红色),在耳蜗表面准备获得噪声暴露后14 d。胞体的损失(肌凝蛋白VIIa)和细胞骨架(phalloidin)被认为是表明OHC损失(图2 (b))。发现在其他文献报道一致(11),我们的结果表明,ohc的损失开始从顶点3.5毫米,接近100%的耳蜗上皮。5 ip注入10毫克/公斤显著降低OHC损失造成的噪声,分析了双向方差分析其次是posthoc测试(具体值,见下表1对图2 (c))。这些结果表明,Fer-1能够防止OHC噪声暴露后死亡。

3.4。治疗Fer-1减轻噪音性氧化应激在噪声暴露后的耳蜗

过多的活性氧积累NIHL和听力损失的主要原因是因为ohc是最脆弱的结构损伤之一,据自己的实验室和其他(19,20.]。过多的活性氧氧化脂质诱导脂质过氧化反应,可以通过测量评估4-HNE和MDA水平。评估是否管理Fer-1阻止NIHL通过抑制脂质过氧化反应,我们为4-HNE immunolabeling执行。如图3(一个)噪声暴露后,4-HNE强度大幅增加耳蜗,包括毛细胞,条痕vascularis (SV)和螺旋神经节神经元(胡志明市)。和DMSO溶液相比,Fer-1治疗显著减轻脂质过氧化造成的噪音性过高的活性氧产量。进一步评估氧化应激在胡志明市,我们观察到胡志明市放大(图更高3 (b))。4-HNE荧光是均匀地分布在细胞质中。如图3 (b)Fer-1治疗4-HNE荧光强度下降。因为失去ohc听力损失的主要原因,我们评估氧化应激在耳蜗上凸轮轴表面噪声暴露后准备1 h。如图3 (c)噪声暴露后,4-HNE荧光强度提高约2.5倍,ohc贴上phalloidin - 488。政府ohc Fer-1显著降低4-HNE强度的存在( vs。 , )和没有(DMSO和Fer-1 )噪声暴露的数据3 (c)和3 (d))。值得注意的是,我们没有观察到OHC损失在这个地区1 h噪声暴露后,但OHC损失伴随着海拔4-HNE水平是比较基础的地区(图中观察到3 (c)”)。管理Fer-1显著降低ohc的损失和4-HNE强度比较基础的地区。然后我们评估4-HNE蛋白质表达水平的噪声暴露后耳蜗Fer-1的存在与否。如图3 (e)和图3 (f)的表达水平4-HNE显著增加(DMSO vs。 , )噪声暴露后。Fer-1治疗显著降低( vs。 , )的表达水平4-HNE噪声暴露后的耳蜗,但表达水平仍高于对照组。最后,我们测量了四组MDA水平1 h噪声暴露后,和变化是类似于4-HNE水平(DMSO vs。 , ; vs。 , )(图4 (b))。

活性氧的积累也会引起蛋白质硝化,可以检测到3 nt。因此,我们评估的3 nt水平在不同条件下的耳蜗。结果与4-HNE水平变化一致。具体来说,噪声暴露导致耳蜗中的3 nt含量显著增加。3 nt水平的增加抑制了Fer-1管理局(图5(一个)- - - - - -5 (f))。

Dihydroethidium(她)是一个可以检测超氧化物离子的荧光染料。我们也评估噪音性耳蜗氧化应激通过直接检测她。如图4(一)、治疗与Fer-1明显下降引起的荧光的强度噪声暴露。综上所述,这些数据表明Fer-1减轻噪音性耳蜗氧化应激通过清除活性氧,从而减轻脂质过氧化反应和蛋白质硝化。

3.5。Fer-1治疗减少噪音性损失包含IHC带状突触和曾帮工的退化

最近的研究表明,带状突触位于包含ihc和胡志明市之间是主要的结构受到噪音的影响(46,47]。探索Fer-1的保护作用与包含IHC带状突触损失由噪声引起的,成对带状突触的数量是量化噪声暴露后14 d之前报道(19]。突触前结构与CtBP2标记(红色)和突触后结构与GluR2标签(绿色)。地区CtBP2和GluR2(黄色)是与确认为功能突触(配对)。该地区的耳蜗表面准备包含IHC突触被数与大约16赫兹。如图6(一),成对的突触的数量显著降低噪声暴露后14 d ( )。Fer-1治疗显著降低成对突触噪声暴露引起的损失,和数据具有统计上的显著差异( )(图6 (c))。值得注意的是,CtBP2-positive突触前结构似乎大Fer-1治疗后,特别是在噪声暴露。这些大的突触的突触前结构显示不完整的修复。

此外,当与包含ihc曾帮工,不可避免地出现退化,(46]。因此,我们评估治疗曾帮工Fer-1变性的保护作用通过测量纤维密度噪声暴露后28 d。如数据所示。6 (b)和6 (d),曾帮工的密度显著降低噪声暴露后28 d ( )。Fer-1治疗显著降低曾帮工变性引起的噪声( )。

3.6。治疗Fer-1缓解TBHP-Induced耳蜗移植的头发细胞和HEI-OC1细胞损伤

为了进一步验证Fer-1的保护作用,体外氧化应激实验进行耳蜗移植组织和HEI-OC1细胞。和被TBHP诱导的氧化应激损伤在体外实验。HEI-OC1细胞株是一个永生的耳蜗感觉上皮细胞系表达多个头发细胞标记,所以它被广泛用于研究毛细胞病理。我们首先测试了不同浓度的影响(0 ~ 40μ米)的Fer-1细胞,发现Fer-1没有细胞毒性(图7 (d))。然后我们测试的可行性HEI-OC1细胞暴露于一系列的剂量的TBHP (0 ~ 450μ米)(图7 (e))。与TBHP CCK-8试验表明,治疗250的浓度μM 90分钟减少细胞生存能力约为50%。我们进一步评估的影响的一系列剂量的Fer-1对250的影响μM TBHP。我们发现治疗Fer-1预防细胞死亡后TBHP治疗剂量依赖性的方式,最有效的浓度是10μM(图7 (f))。如图7(一)预处理,10μM Fer-1 24 h 250年之前μM TBHP曝光120分钟明显减少细胞死亡。进一步验证Fer-1治疗减少TBHP-induced HEI-OC1细胞死亡,我们进行了流式细胞术,结果显示大幅减少凋亡细胞 组比TBHP组(图7 (b))。此外,在暴露于250年μM TBHP 120分钟,大量TUNEL-positive细胞观察。然而,没有TUNEL-positive细胞 组(图7 (c))。此外,我们测试了Fer-1对抗氧化应激损伤的保护作用在器官水平。如图7 (g)100年,治疗的耳蜗移植组织μM TBHP 3 h毛细胞造成了严重损害。预处理与40个μM Fer-1 24 h明显缓解头发细胞损失。这些数据表明,Fer-1治疗显著缓解TBHP-induced耳蜗移植头发细胞和HEI-OC1细胞死亡。

3.7。治疗Fer-1缓解TBHP-Induced氧化应激和铁在耳蜗移植组织和HEI-OC1细胞积累

验证的能力Fer-1 ROS生成和脂质过氧化反应,DCFH-DA染色和HEI-OC1 Liperfluo染色进行细胞和耳蜗外植体,分别。如图8(一个)的荧光强度DCFH-DA TBHP治疗后显著增加而控制。相比之下,荧光强度之间的DCFH-DA 组和对照组几乎在同一水平上。此外,荧光强度的DCFH-DA Fer-1只有组明显减少,表明其强烈的活性氧清除能力。过多的活性氧导致脂质过氧化,可以评估Liperfluo染色。如图8 (c)Liperfluo在耳蜗外植体的荧光强度明显下降 集团与TBHP组相比,表明Fer-1发挥保护作用,减轻脂质过氧化反应。

FerroOrange,一种新型荧光探针,使细胞内铁的标签^{2 +},被用来评估铁HEI-OC1细胞中积累和耳蜗外植体。如图8 (b)的荧光强度FerroOrange TBHP治疗后显著增加与控制相比,表明过度引起的铁积累TBHP治疗。然而,治疗Fer-1明显减少了FerroOrange HEI-OC1细胞荧光强度。此外,我们测试了铁浓度耳蜗外植体处理TBHP诱导氧化应激损伤。如图8 (d)后,FerroOrange荧光强度显著增加TBHP治疗。FerroOrange荧光强度Fer-1 + TBHP组与TBHP只有组相比明显下降。这些研究结果表明,氧化应激损伤可能导致HEI-OC1 ferroptosis细胞和耳蜗外植体。和抑制ferroptosis能够改善TBHP-induced HEI-OC1细胞受损和耳蜗外植体。

3.8。治疗Fer-1减轻噪音性耳蜗毛细胞Ferroptosis通过TfR1但不是GPX4或ACSL4

Ferroptosis是一种新近发现的细胞死亡形式,其特征是脂质过氧化和铁积累。耳蜗是一个高度代谢器官,产生丰富的ROS暴露在高强度噪音。我们证实Fer-1显著降低脂质过氧化作用引起的耳蜗的噪音。因此,我们推测,治疗Fer-1变弱NIHL通过抑制ferroptosis部分。如数据所示9(一个)和9 (b),我们评估多个关键蛋白质的表达参与ferroptosis,如GPX4 ACSL4, TfR1。然而,GPX4和ACSL4没有不同的水平在四组。如图S4的比例,我们评估谷胱甘肽(GSSG和鼠标cochleae的谷胱甘肽水平。结果显示四组无统计学差异。此外,我们进行免疫荧光染色GPX4和ACSL4冻结部分(图S4A和图。S5D)。量化的相对GPX4和ACSL4 immunolabeling强度在灰度显示四组之间无统计学差异。此外,信使rna表达水平GPX4和ACSL4四组(图中没有不同S4B和图S5H)。值得注意的是,如图9(一个)和9 (b),TfR1 Fer-1治疗后显著降低(DMSO和Fer-1, )。治疗Fer-1也显著降低噪声暴露后TfR1水平( vs。 , )。然而,TfR1水平显著降低噪声暴露后没有Fer-1 (DMSO vs。 , )。如图S5G的mRNA水平TfR1 Fer-1治疗后显著降低(DMSO和Fer-1, )或噪声暴露(DMSO vs。 , ),这表明Fer-1可以通过转录调节调节TfR1的表达。此外,我们测试了铁浓度耳蜗移植组织和HEI-OC1细胞治疗TBHP诱导氧化应激损伤。如数据所示。8 (b)和8 (d)后,FerroOrange荧光强度显著增加TBHP治疗。预处理与Fer-1 FerroOrange荧光强度明显减少。这些数据表明,Fer-1缓解NIHL部分通过抑制TfR1-mediated ferroptosis(图9 (d))。

3.9。治疗Fer-1减轻噪音性耳蜗毛细胞凋亡P53-AIFM2轴

AIFM2也叫凋亡诱导因子mitochondrion-associated(在)或FSP1死亡的诱导物,被广泛公认为可以诱导caspase-independent凋亡[48]。最近,AIFM2被确认为一个antiferroptotic蛋白由于其函数作为氧化还原酶(37,41,42]。我们首先测试了毛细胞表达这种蛋白质(图S2)。然后,我们评估是否AIFM2改变噪声暴露后的水平。如数据所示。9(一个)和9 (b),AIFM2噪声暴露后显著增加(DMSO vs。 , )。Fer-1治疗显著降低的水平AIFM2噪声暴露后( vs。 , )。我们也为AIFM2进行免疫荧光染色,结果类似于免疫印迹(图S5A)。如图。S5F的mRNA水平AIFM2 Fer-1治疗后显著降低(DMSO和Fer-1, )或噪声暴露(DMSO和DMSO +噪音, )。这些数据表明,AIFM2 prodeath作用而非antiferroptotic作用期间暴露于噪音。因此,我们评估其上游目标P53的表达,一个著名的proapoptotic蛋白质。如数据所示。9(一个)和9 (b)P53的水平治疗后显著降低Fer-1 (DMSO和Fer-1, )。噪声暴露后,P53的水平是显著增加(DMSO vs。 , ),和治疗Fer-1显著降低P53的表达( vs。 , )。我们也表现为P53免疫荧光染色,结果类似于免疫印迹(图S5B)。然而,P53的mRNA水平组之间没有统计学差异(图S5E)。此外,我们评价AIF的表达水平,这与AIFM2共享显著的同源性。然而,如果没有不同的水平在四组。SOD2 (Mn-SOD)是唯一在线粒体超氧化物歧化酶,清除ROS在线粒体发挥着重要的作用。然而,SOD2的水平并不是四组之间的不同。我们也为SOD2进行免疫荧光染色,结果类似于免疫印迹(图S5C)。我们也评价伯灵顿的表达水平,这是线粒体凋亡通路的关键。然而,伯灵顿的水平并不是四组之间的不同。此外,SOD2的信使rna表达水平,伯灵顿,如果没有四组(图中不同S5I,图S5J,图S5K)。4-HNE是脂质过氧化的主要产品,所以我们探索4-HNE是否过度P53-AIFM2通路的影响。如图9 (c),我们证明了4-HNE与P53。这些数据表明,噪声引起的耳蜗毛细胞凋亡部分通过P53-AIFM2途径和治疗Fer-1抑制这一过程(图9 (d))。

4所示。讨论

Fer-1是一种新颖的合成抗氧化剂的能力阻止脂质过氧化作用,因此用作ferroptosis抑制剂。在这项研究中,针对NIHL Fer-1的保护作用和可能的潜在机制在体内和体外模型研究。我们证实治疗Fer-1减轻噪音性ABR阈值高度和OHC损失在老鼠身上。然而,我们没有观察到包含IHC损失,这与先前的报道是一致的(11]。此外,我们发现Fer-1政府减少的损失包含IHC带状突触和曾帮工的变性引起的噪声暴露。此外,我们证实Fer-1治疗保护听力通过清除ROS减轻氧化应激,抑制ferroptosis通过下调TfR1表达,减少细胞凋亡,调节P53-AIFM2通路(图9 (d))。

高碳钢对于听力非常重要,因为他们的mechanoelectrical形成听觉信号转导能力和能力。然而,高碳钢脆弱和不可再生的哺乳动物。在目前的研究中,老鼠噪声暴露导致OHC损失,而包含ihc噪声暴露后完好无损。这可能是由于内在的抗氧化能力上凸轮轴和包含ihc是不同的49]。此外,我们发现该地区ohc对应~ 16赫兹是完整的噪声暴露后14 d,而ABR阈值升高了约40 dB。这表明,ohc无法执行其正常功能,尽管不是死亡。底层机制Fer-1减轻ABR阈值变动在16岁kHz可能涉及维护OHC的正常功能,而不是减少OHC损失。最近的研究表明,带状突触,位于包含ihc和胡志明市之间,是最脆弱的耳蜗的结构。符合我们和其他先前的报道(19,46,47),配对带状突触的数量明显减少噪声暴露。曾帮工开始变性一旦断开突触,可能是因为外围提供的胡志明市失去了营养神经突突触。我们还观察到噪声暴露曾帮工变性引起的。Fer-1治疗显著降低噪音性带状突触损失和曾帮工变性。这一发现为治疗提供了希望隐藏噪音性听力损失(NIHHL),主要的病理改变是带状突触的损失(47]。

目前的理论与噪音性人工耳蜗中心代谢损失由过量的噪音所引起的氧化应激刺激。在我们的研究中,氧化应激是由多个评价方法,如分析4-HNE 3 nt,她,MDA水平,Liperfluo染色,DCFH-DA染色,结果与之前的研究一致(11,14,19,20.,35]。过量的活性氧耳蜗这是ferroptosis最重要的特性之一,结果从噪音性脂质过氧化反应与多不饱和脂肪酸在细胞膜。先前的研究已经表明,HEI-CO1细胞可以接受ferroptosis,和治疗Fer-1或Liproxstatin-1(另一种抑制剂的ferroptosis)可以减少顺铂引起的细胞死亡或新霉素,分别。在我们的研究中,我们发现Fer-1治疗显著降低TBHP-induced HEI-OC1细胞死亡。此外,一些研究人员发现,缓解ferroptosis可以部分逆转神经退化的听觉皮层33,35,50]。因此,我们推测Fer-1可以通过抑制减弱NIHL ferroptosis。我们首先证明了保护Fer-1对听力的影响。然后,我们探索底层机制。GPX4,最重要的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),已被证明在保护细胞免受ferroptosis起到至关重要的作用引起膜脂质过氧化作用[51]。我们测量GPX4 mRNA和蛋白表达水平和中谷胱甘肽含量噪声暴露后小鼠耳蜗Fer-1的存在与否。然而,在四组没有变化。然后,我们专注于ACSL4,调节脂质成分的关键酶。ACSL4已经被证明有助于ferroptosis在缺血/再灌注52]。ACSL4 mRNA和蛋白表达水平的鼠标耳蜗GPX4类似。然后,我们专注于铁,ferroptosis的另一个关键因素。我们发现在小鼠耳蜗TfR1的表达水平明显降低Fer-1治疗,不管老鼠暴露在噪音。我们观察到的mRNA水平TfR1降低Fer-1组与对照组DMSO溶液相比,表明Fer-1可以抑制TfR1基因的转录。此外,ROS水平噪声暴露后测量。我们发现活性氧显著消除Fer-1治疗。此外,我们研究了体外HEI-OC1细胞氧化应激和耳蜗外植体。我们的研究结果表明,Fer-1明显下降的头发细胞损失,脂质过氧化反应和铁积累TBHP所致。这些数据表明,Fer-1抑制噪音性毛细胞ferroptosis清除ROS和表达下调TfR1的表达。

过多的活性氧引起细胞凋亡。线粒体是主要ROS-producing细胞器和proapoptotic介质[至关重要53]。我们之前的研究表明,人工耳蜗可以诱导线粒体功能异常噪声暴露在老鼠模型中(19]。因此,我们推测Fer-1可以通过抑制减弱NIHL mitochondria-mediated细胞凋亡。在目前的工作,AIFM2的表达水平是评估因为AIFM2 caspase-independent凋亡诱导物。我们发现的水平AIFM2强劲增加噪声暴露的结果,这种变化是伴随着听阈高程和OHC损失。然而,AIFM2 mRNA不会增加噪声暴露后(图S5F),这表明噪声可以抑制AIFM2蛋白质的降解。有趣的是,AIFM2最近被确定为一个antiferroptotic蛋白由于其能力降低辅酶Q10水平来生成一个亲脂性的radical-trapping抗氧化剂(42]。AIFM2又扮演了什么角色在噪音性毛细胞丢失?一些研究者发现4-HNE,脂质过氧化作用的标志,灭活AIFM2 NADH氧化还原酶的功能,促进其从线粒体易位,最后导致小鼠的心脏组织细胞凋亡(39]。在我们的研究中,噪声暴露水平显著增加了4-HNE和AIFM2耳蜗组织的老鼠。因此,我们推测4-HNE可能抑制AIFM2的退化和AIFM2作为antiferroptotic中介在正常情况下,变成了一个proapoptotic中介当4-HNE水平的增加引起的耳蜗毛细胞是过度的噪音性ROS。这个假设需要进一步调查。

P53的上游蛋白质AIFM2和具有多个功能,包括诱导细胞周期阻滞、衰老和细胞凋亡。最近的研究总结了prooxidant P53和抗氧化活动,说明P53在调节细胞活性氧代谢的复杂性40,54]。在我们的研究中,我们发现P53蛋白水平显著增加噪声暴露后,但P53的mRNA水平没有变化(图S5E)。治疗Fer-1 P53蛋白表达水平的降低噪音的存在与否。此外,我们还证明了4-HNE与P53交互。所以,我们推测4-HNE P53的引用可能影响泛素化降解,导致过度的P53和细胞凋亡。这个假设需要进一步调查。除了AIFM2, TfR1下游P53的目标。一些研究人员发现TfR1蛋白质水平降低p53诱导后表达(55]。值得注意的是,我们观察到TfR1 mRNA和蛋白水平的降低噪声暴露组与DMSO相比对照组。考虑P53的水平的增加引起的噪声,减少TfR1水平可能是部分P53表达的诱导的结果。此外,P53发现抑制SLC7A11和增强ALOX15表达的转录激活SAT1,触发ferroptosis因此[54]。综上所述,我们的研究结果与其他研究人员表明p53在调节头发细胞死亡中扮演双重角色:它是一个antiferroptotic因素通过抑制TfR1当ROS水平温和而成为proapoptotic proferroptotic因素在ROS过载。Fer-1促进毛细胞生存通过直接清除活性氧和抑制TfR1-mediated ferroptosis和P53-AIFM2 pathway-mediated凋亡信号。

本研究有几个局限性。首先,我们只评估老鼠听到8,16和32 kHz通过ABR测量。这三个频率只覆盖大约一半的耳蜗上皮(从顶点1毫米到4毫米的顶点),不得反映鼠标听力的状态。在未来的工作中,我们将测试ABR在频率和使用更多方法来评估听力,如产品畸变耳声排放(DPOAEs)和复合动作电位(帽)。其次,我们使用整个耳蜗组织匀浆评估蛋白质变化,因为我们无法孤立毛细胞由于技术困难。最后,Fer-1管理系统,耳蜗的浓度可能是低。在未来的研究中,我们将探索的可行性intratympanic(入侵)交付增加耳蜗中的浓度(56]。此外,我们想要探索小说的头发cell-targeting纳米颗粒的能力或者有选择地在内耳药物。

5。结论

总之,我们的研究是第一个探索NIHL ferroptosis与细胞凋亡之间的关系。噪音性过多活性氧引起脂质过氧化作用和激活P53-AIFM2头发细胞信号通路,导致ferroptosis和细胞凋亡。Fer-1治疗有效地保护听力和减轻ohc的损失,带状突触,曾帮工声波引起的创伤。这些保护作用的机制可能部分涉及清除活性氧,抑制TfR1-mediated ferroptosis和P53-AIFM2 pathway-mediated凋亡信号。我们的研究结果为NIHL的治疗开辟新的途径。

缩写

3 nt:	3-Nitrotyrosine
4-HNE:	4-Hydroxynonenal
上:	听觉脑干反应
如果:	凋亡诱导因子
AIFM2:	凋亡诱导因子mitochondria-associated 2
曾帮工:	听觉神经纤维
BBN:	宽带噪声
CCK-8:	细胞计数工具
DMSO溶液:	二甲亚砜
她:	Dihydroethidium
EDTA:	乙二胺四乙酸二钠盐
包含IHC:	内毛细胞
Fer-1:	Ferrostatin-1
MDA:	3,4-Methylenedioxyamphetamine
NIHL:	噪音性听力丧失
OHC:	外毛细胞
PBS:	磷酸缓冲盐
PFA:	多聚甲醛
分:	固定阈值变化
PL-PUFAs:	与不饱和磷脂酰尾巴
ROS:	活性氧
SBE -βcd:	Sulfobutylether -β环糊精
SPL:	声压级
TBHP:	叔丁基氢过氧化物
TDT):	塔克戴维斯技术
TfR1:	转铁蛋白受体1
里帕:	Radio-immunoprecipitation化验。

数据可用性

在这项研究中提出的数据都可以在合理的请求从相应的作者。

伦理批准

动物研究是审查和批准机构动物保健和使用委员会空军医科大学。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

L-JL Z-HH, QY设计研究。P-WM、J-WC W-LW、衔接和P-HL进行了实验。X-RD, WG、RL和Y-QL分析数据。P-WM准备数据。P-WM、Z-HH L-JL写的手稿。所有作者的文章和批准提交的版本。陈Peng-Wei马、王Wei-Long和日本作者的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的军事物流研究项目(18 cxz015)和军事医学向前Tangdu医院的研究项目(2020 qzdy001)。我们感谢南希胡锦涛图像采集的指导。我们也感谢刘Peng-Fei实验教学。

补充材料

图S1:基线听觉阈限的动物。基线的左耳听觉阈值动物8-32 kHz评估通过ABR测试。数据了 。图S2: AIFM2耳蜗中表达。AIFM2荧光均匀分布在细胞质中。 。高碳钢:毛细胞;SV:条纹vascularis;胡志明市:螺旋神经节神经元。的色谱和质谱图S3:外淋巴样本。(一)代表的照片总离子电流(TIC)外淋巴样的色谱图。串联质谱(B)。质荷比( )三个女儿离子分别为180.95,152.90和134.95。(C)在15分钟,1 h,注射后3小时以内,外淋巴的Fer-1小鼠耳蜗的浓度为2.077,0.301和0.122μ分别g / L。图S4: Fer-1治疗或噪声暴露对GPX4影响甚微表达和耳蜗中谷胱甘肽的含量。(一)代表的照片GPX4冻结耳蜗各部分(绿色)。 。SV:条纹vascularis;胡志明市:螺旋神经节神经元;高碳钢:毛细胞。(B) qRT pcr验证GPX4 mRNA表达水平在四组老鼠的耳蜗。(C)耳蜗中的谷胱甘肽(GSSG比四组的老鼠。(D)谷胱甘肽的浓度(μmol / L)耳蜗的四组老鼠。(E)的浓度GSSG (μmol / L)耳蜗的四组老鼠。(F)的浓度谷胱甘肽(GSH和GSSG) (μmol / L)耳蜗的四组老鼠。图S5: Fer-1治疗发挥保护作用对NIHL部分通过抑制ferroptosis和细胞凋亡。(A - D)代表AIFM2的照片,P53, SOD2, ACSL4冷冻耳蜗部分。 。SV:条纹vascularis;胡志明市:螺旋神经节神经元;高碳钢:毛细胞。(E - K)存在P53的验证,AIFM2, TfR1, ACSL4, SOD2,伯灵顿,如果信使rna表达水平在四组老鼠的耳蜗。存在分析表S1:引物。中存在的引物序列分析。计算的相对mRNA转录水平2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。(补充材料)