文摘
失调的真核翻译起始因子1,x连锁(EIF1AX),已与一些癌症的发病机制。然而,所扮演的角色EIF1AX在子宫内膜癌(EC)仍然是未知的。我们调查了EIF1AX表达在EC患者并评估其tumorigenesis-associated函数和核质传输机制在体外和在活的有机体内。结果表明,胞质EIF1AX表达式显示逐渐增加,当从子宫内膜正常组织,简单的子宫内膜增生,复杂的子宫内膜增生、子宫内膜非典型增生和EC,同时为核EIF1AX表达式亦然。此外,细胞质EIF1AX表达呈正相关,组织学类型,高国际妇产科联合会(FIGO)年级,先进的菲戈阶段,深入渗透,Ki67指数高,短recurrence-free EC患者的生存。在体外,短发卡rna介导EIF1AX损耗或SV40NLS-mediated EIF1AX导入人类EC细胞细胞核在多个强有力地抑制细胞迁移和入侵,epithelial-mesenchymal过渡,和肺转移。此外,间1诱导运输EIF1AX离原子核的细胞质可以抑制leptomycin B治疗或突变EIF1AX位置序列。这些结果说明细胞质EIF1AX可能发挥关键作用的发生率和推广电子商务,因此,针对EIF1AX或其核质运输过程可能会提供一个有效的电子商务的新治疗方法。
1。介绍
诊断子宫内膜癌(EC)是第二大妇科恶性肿瘤和全世界第六大多数诊断癌症的妇女1- - - - - -3]。在中国正经历着急速的社会经济转型,EC的发病率一直呈上升趋势,其发病显示趋势发生在年轻女性在过去的几十年中(1,2,4]。其危险因素包括初潮早、绝经晚,未产妇、肥胖、缺乏运动、他莫昔芬,多囊卵巢综合征,阳性家族史,基因改变(5,6]。虽然治疗策略大大提高,结果在EC晚期或复发性疾病患者远非令人满意(5,7]。目前,更重要的是明确增长背后的分子机制,转移和复发的EC,这可能促进研究早期诊断和基因治疗的潜在目标。
真核翻译起始因子(型),运输的核通过核孔复合体的中央通道(NPC)核质运输受体,调节基因的表达。这可能导致的异常激活或抑制信号通路参与肿瘤进展转移和耐药性,暗示型为各种类型的癌症治疗的目标(8- - - - - -10]。许多启动因素,尤其是eIF2 eIF3, eIF4,已经与许多人类癌症的病因(11- - - - - -15]。然而,很少理解有关的确切作用和机制真核翻译起始因子1,x连锁在EC (EIF1AX)。EIF1AX,对人类X染色体编码,包括一个中央域与寡核苷酸——/ oligosaccharide-binding (OB)褶皱,小螺旋子域名,和两个带电基本和酸性非结构化的氨基端反面(ntt)和c端反面(ctt),分别为(16- - - - - -18]。至关重要的蛋白质合成的起始,特别是对于招聘的三元复杂和组装始发前43年代复杂的(图片)19- - - - - -21]。EIF1AX也可以增加Ago-mediated Dicer-independent微RNA (mi)生物起源和RNA干扰(22]。此外,据报道的一个主要标志基因的哺乳动物胚胎植入前的合子基因组激活(23]。据我们所知,EIF1AX是唯一的例子图片循环地突变在癌症的亚基。EIF1AX突变已报告在葡萄膜黑色素瘤,甲状腺肿瘤,卵巢癌和经常位于NTT域(24- - - - - -27]。最近,人们发现EIF1AX长5的突变主要是提高翻译UTR mrna主要编码蛋白与细胞增殖、分化、血管生成、入侵和转移(28]。观察EIF1AX核质超表达的乳腺癌和攻击行为和糟糕的预后呈正相关。的EIF1AX超表达可能促进G1 / S相变通过转录镇压p21p53-independent的方式(29日]。进一步的调查显示,eIF1A被importin13出口(IPO13)在海拉细胞,和一间1 (XPO1)端依赖途径eIF1A本地化(也可能是重要的30.]。
在目前的研究中,EIF1AX表达了电子商务及其前体病变的临床病理参数并与EC探索的作用EIF1AX表达式。我们也观察到的影响EIF1AX击倒或核条目积极EC细胞的表型和分析核质EIF1AX运输的相关分子机制。
2。材料和方法
2.1。病人
EC(315例),简单的子宫内膜增生无异型(医师、50例),复杂的子宫内膜增生无异型(CEH, 50例)、子宫内膜非典型增生(AEH, 50例)和正常子宫内膜(50例)是来自福建医科大学第一附属医院1月1日至2006年8月31日,2020年。没有一个病人接受化疗、放疗或手术前辅助治疗。欧共体在这项研究包括常见endometrioid类型(286例)和更积极的浆液性癌(29例)。其中,26的子宫内膜样本endometrioid癌(EEC),四个样品的子宫内膜浆液性癌(ESC),和正常子宫内膜的30个样品snap-frozen储存在−80°C。病理诊断及国际妇产科联合会(FIGO)阶段是基于世界卫生组织分类的女性生殖器肿瘤(5th版)。的表达雌激素受体、孕激素受体,p53, Ki67检查在临床病理的诊断。关键的人口和临床特点的病人进行了总结在表1。
2.2。动物
四个星期老无胸腺的裸小鼠购自上海SLAC实验动物有限公司有限公司(中国)和居住条件下控制温度( )和光周期(12 h L + 12 h D) 5 - 7天,以适应新的环境。有关老鼠实验协议处理受到机构批准,动物保健和使用委员会(IACUC)福建医科大学。
2.3。细胞培养、稳定的细胞系和药物
HEC-1A MYCOY ECC-1细胞培养S5A介质,而RL95-2细胞在DMEM / F12培养基培养。所有的媒体都用抗生素和补充10%胎牛血清(美国Gibco沃尔瑟姆,MA)。建立稳定的细胞系,lentivirus-mediated EIF1AX-shRNA, EIF1AXsm, EIF1AXsm-SV40NLS Shengzhe生物技术设计的构造都转染到EC细胞根据制造商的协议。感染细胞选择与嘌呤霉素治疗用于实验。从Beyotime Leptomycin B (LMB)购买生物技术(中国,北京)。
2.4。质粒
pcDNA3.1-EIF1AXsm, pcDNA3.1-EIF1AX-shRNA pcDNA3.1-EIF1AX-SV40NLS、pcDNA3.1-EIF1AXsm-SV40NLS pcDNA3.1-EIF1AX-NLSmut都由海南Shengzhe生物有限公司,有限公司(海南、中国)。质粒在大肠杆菌DH5传播α和纯化使用MN NucleoBond字母x工具包(Macherey-Nagel, Dueren,德国)。使用的所有序列中列出补充图1(图S1)。细胞转染Lipofectamine 3000(美国热费希尔科学)根据制造商的指示和收获后48小时内进行进一步的实验。
2.5。RNA干扰
具体的小核RNA) IPO13, XPO1,消极的控制核获得GenePharm(上海,中国)。细胞转染与Lipofectamine RNAiMAX(热费希尔科学、美国)根据制造商的指示和收获后48小时内进行进一步的实验。所使用的核序列补充表中列出1。
2.6。免疫组织化学(包含IHC)和得分
组织微阵列(TMA)是利用ECs的组织构造,前体病变和正常子宫内膜被Zhang et al。31日]。抗原检索是由微波加热30分钟后在0.01 M柠檬酸缓冲(PH值6.0),部分被孵化与anti-EIF1AX抗体1:1000稀释(美国热费希尔科学,猫# HPA002561)在室温下2小时,测试与Dako Envison工具包(美国Dako Carpinteria, CA),并与diaminobenzidine可视化。
包含IHC得分是分级之前报道(32- - - - - -34由两名有经验的病理学家独立)和得分。简而言之,阳性肿瘤细胞的比例得分为0(≤10%的阳性细胞),1(≤50%的阳性细胞),2(≤75%的阳性细胞),3(阳性细胞≥76%)。染色强度分级如下:1(弱),2(中度),3(强)。最后得分然后计算由多个以上两个得分:0 - 1 (-),2 (+),3 - 4 (+ +),6 (+ + +),9 (+ + + +)。我们分类染色结果为阳性(+ - + + + +),表达式(+ + +),低和高表达(+ + + - + + + +)。
2.7。桑格测序
编码区序列EIF1AX使用pcr测序毛细管Sanger测序被马丁et al。17]。所有的引物序列扩增和测序补充表中给出2。
2.8。免疫印迹分析
从子宫内膜组织样本和EC细胞总蛋白提取制备如前所报道(35]。核和胞质分数孤立使用分钟™细胞质和核提取试剂盒(发明生物技术,Inc .,普利茅斯,MN,美国)。主要的抗体被用于以下稀释:单克隆anti-GAPDH-horseradish过氧化物酶配合在1:10000 (GNI、日本猫# GNI4310-GH-S), anti-EIF1AX抗体在1:1000年,anti-Snail抗体在1:1000(美国Proteintech猫# 26183 - 1 - ap), anti-E-cadherin抗体在1:1000(细胞信号技术,美国,猫# 14472),anti-IPO13抗体在1:1000(罗福斯生物制品,猫# nbp1 - 31508),和anti-XPO1抗体1:1000(圣克鲁斯生物技术、猫# sc - 74454)。
2.9。主办Mapper EIF1AX蛋白质序列分析
潜在的核本地化信号(NLS)程度使用开源软件主办映射器(http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi)。NLS算出分数四NLS概要(上课1/2,类3类4,和双方的NLS),每一个都代表一个贡献的每一个氨基酸残基在每一个位置在整个NLS NLS类活动(36]。GUS-GFP记者简单蛋白质融合的NLS得分8,9或10是原子核完全本地化,得分为7或8部分本地化的细胞核,得分3,4或5局部细胞核和细胞质中,而分数最低的1或2局部细胞质。
2.10。免疫荧光分析
HEC-1A、ECC-1 RL95-2细胞治疗如上所述。然后,细胞( )是生长在玻璃盖玻片24-well盘,随后以0.1% PVA-PBA洗了三次,和固定在4%多聚甲醛在室温下(RT) 30分钟。细胞治疗0.5% Triton x - 100在RT 30分钟,阻止3% BSA在RT 60分钟,然后用稀释孵化一夜之间主要的抗体在4°C。细胞用0.1% PVA-PBS孵化,Alexa萤石488 -标记驴anti-rabbit二级抗体(1:1000稀释)60分钟,再次清洗,处理DAPI(1: 5000稀释)30分钟。细胞被立即徕卡TCS SP8共焦显微镜下检查。样本成像较低与高分辨率放大使用×20/0.80数值孔径物镜和(NA) 图像像素分辨率为0.25μm。主要抗体被用于以下稀释:多克隆抗体兔子anti-EIF1AX 1: 100(热费希尔科学、猫# HPA002561)。
Photoshop软件是用于分离蛋白表达在细胞核和细胞质根据DAPI图像。ImageJ被用来分析免疫染色图像的灰度值。简而言之,图像是由相同的归一化参数减去背景染色。然后,灰色的每个细胞的细胞核和细胞质的值分别计算。
2.11。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定
HEC-1A(2000细胞/ 100μ左)和RL95-2细胞(3000 / 100μL)在96孔板镀。细胞被分成四组,每组五重复井:Ctrl集团(空载体质粒),KD组(EIF1AX-shRNA), KD + Esm集团(EIF1AX-shRNA + pcDNA3.1-EIF1AXsm)和KD + NLSsm集团(EIF1AX-shRNA + pcDNA3.1-EIF1AXsm-SV40NLS)。细胞增殖活性检测使用CCK-8试验(美国多国评价)每24 h。光密度检测在使用标450海里。
2.12。愈合划痕试验
目标细胞转移到6-well盘子和孵化在37°C到80 - 90%的融合。一个200μL无菌塑料尖被用来创建一个伤口的线在表面的井,并与PBS悬浮细胞被移除。细胞培养在降低血清MYCOYS5A或DMEM / F12培养基在湿润有限公司5%2孵化器在37°C 48 h,然后被用相差显微镜图像。每个实验重复三次。
2.13。Transwell迁移和入侵检测
迁移和入侵检测进行了使用transwell钱伯斯(美国微孔,Billerica的)。移民化验,转染细胞被播种到参议院无血清培养基( 细胞)和室的底部包含MYCOYS5A或与10%胎牛血清的DMEM / F12培养基。对入侵检测,商会是涂层与基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国),和后续步骤中使用的类似迁移试验。细胞迁移或入侵24 h后,他们是固定的,与结晶紫染色。迁移和入侵EC细胞一个倒置光学显微镜下计数。迁移或入侵细胞的数量被计数量化细胞的数量从10×100放大随机字段。
2.14。Coimmunoprecipitation化验
蛋白质溶解产物是准备使用里帕裂解缓冲(Beyotime生物技术、中国)和蛋白酶抑制剂补充。与100年全细胞溶解产物被孵化μL的蛋白质或G磁珠(美国圣克鲁斯生物技术)prebound anti-EIF1AX(热费希尔科学、猫# HPA002561), anti-FLAG(微孔,猫# F7425) anti-IPO13(罗福斯生物制品,猫# nbp1 - 31508), anti-XPO1(圣克鲁斯生物技术、猫# sc - 74454),正常兔免疫球蛋白控制,或正常小鼠免疫球蛋白控制。使用西方墨点法分析了免疫沉淀反应在洗脱样品缓冲在95°C。
2.15。肺转移
HEC-1A细胞稳定表达质粒是裸体小鼠尾静脉注入了静脉注射。每组动物后5周(5),老鼠被牺牲掉了。肺收集,中性缓冲福尔马林固定在10%,嵌入在石蜡连续切片紧随其后。五个部分(100μ米)从每个肺与苏木精和伊红染色())和拍照。肺转移的面积由ImageJ决定。
2.16。统计分析
使用SPSS 22.0统计分析软件和GraphPad Prism 7.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。包含IHC表达与临床病理参数之间的关系进行了分析使用测试。生存分析是使用kaplan meier执行方法和生存率较。多元的生存分析使用Cox比例风险模型。意味着内的组或组之间比较单向方差分析。值< 0.05被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。EIF1AX是人类EC的过表达在细胞质中,也没有突变EIF1AX编码区域
使用包含IHC,我们发现EIF1AX的表达在正常子宫内膜,前体病变,EC组织。如图1和表2与正常子宫内膜细胞相比,EC细胞显示更强的EIF1AX细胞质染色( ),而较弱的染色出现在细胞核( )。此外,细胞质EIF1AX欧共体的表达高于正常子宫内膜,医师,CEH或AEH ( )。核EIF1AX欧共体的表达低于正常子宫内膜,医师,CEH或AEH ( )。用免疫印迹,EIF1AX EC的蛋白质水平是高于正常组织,这进一步证实了IHC结果。然而,桑格DNA序列分析(EC患者30日)没有发现任何点突变,缺失或插入的编码区EIF1AX(图S2)。
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3.2。细胞质EIF1AX超表达是与人类EC Clinical-Pathological参数和不良预后不良
确定异位EIF1AX表达的临床病理意义,全面数据集315 EC病例进行了分析使用统计工具。这些分析表明,EIF1AX蛋白主要位于EC细胞的细胞质,细胞质积极率达到82.5%,而核正率为12.9%。细胞质EIF1AX表达呈正相关,组织学类型( ),高菲戈年级( ),先进的菲戈阶段( ),深层渗透( ),和高Ki67指数( )如表所示1。所有病例随访定期总共不少于3年,之后不到1年,病例记录为失访。总共有143 EC患者参加生存分析。平均85个月的随访中,128名患者(89.51%)还活着没有复发,4名患者(2.80%)还活着但已经复发,和11个病人(7.69%)已经死了。是156个月,平均存活时间,1 - 3 -,和5年生存率分别为96.5%,91.5%,和86.9%,分别。EIF1AX的表达越高,越总体存活率在EC患者( ,图S3)。单变量分析使用Cox比例风险所有参数的回归分析表明,高EIF1AX表达式,组织学类型、组织学分级、菲戈阶段,侵入深度,Ki67指数都在EC患者预后变量。然而,多变量分析证实,只有组织学类型( ,风险比1.755 - -17.022)和Ki67指数( ,风险比1.611 - -17.117)在EC(表独立预后因素3)。
3.3。EIF1AX击倒或搬迁到核抑制EC细胞增殖,迁移和入侵的能力
鉴于EIF1AX主要是过表达在人类EC组织细胞质中,我们首先研究EIF1AX蛋白表达和定位在EC细胞系(HEC-1A, ECC-1, RL95-2)。免疫荧光染色显示EIF1AX表达式在细胞质中比在细胞核,特别是对于HEC-1A RL95-2细胞;免疫印迹结果表明EIF1AX在HEC-1A和RL95-2细胞蛋白表达明显高于ECC-1细胞(图S4A B)。然后,我们选择HEC-1A和RL95-2细胞作为模型细胞系进行进一步的实验。澄清EIF1AX在EC细胞增殖的作用,我们成功地EIF1AX-NLS质粒转染到HEC-1A细胞导致搬迁EIF1AX蛋白质的核,用免疫荧光和免疫印迹(图所示自己,D)。
然后,我们发现后细胞增殖EIF1AX在EC细胞击倒。CCK-8试验的结果表明,细胞增殖活动EIF1AX可拆卸的集团(KD)最低在96 h。然而,细胞增殖明显恢复后补充的细胞质(KD + Esm组)或核(KD + NLSsm集团)与EIF1AX(图2(一个))。进一步说明的作用EIF1AX EC细胞的迁移和入侵,我们发现EMT标记基因表达,表明,蜗牛和波形蛋白减少,而钙粘蛋白和β-连环蛋白增加EIF1AX击倒后,暗示EIF1AX可能目标蜗牛促进epithelial-mesenchymal过渡过程。与KD + Esm组相比,拯救EIF1AX在细胞核中并没有改变表达式的蜗牛,钙粘蛋白、波形蛋白和β-连环蛋白更有效(图2 (b))。此外,我们愈合进行化验,发现EC细胞的愈合能力EIF1AX击倒后减少。与KD组相比,拯救EIF1AX在细胞质中提高了愈合能力但不是KD + NLSsm集团(数字2 (c)和2 (d))。此外,细胞迁移和入侵检测进行在体外,迁移和入侵细胞的数量统计。与上面的结果一致,明显减少了迁移和入侵( )KD和KD + NLSsm组观察,EIF1AX或搬迁到差别意味着对这些核减慢EC细胞的迁移和入侵(数字2 (e)- - - - - -2 (h))。因此,和正常组织之间的不同位置的EIF1AX EC可能证明迁移EIF1AX细胞核是EC细胞迁移和入侵的一个重要因素。
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3.4。XPO1-Mediated EIF1AX运输到细胞质的EC细胞的核出口通道
在目前的研究中,我们发现EIF1AX位于细胞核在正常组织。因此,主办映射器被用来预测NLS EIF1AX序列,和序列的最高得分(3.1分)(RRRGKNENESEKRLVFKEDGQEYAQVIKML)被选中(图3(一个))[36]。有趣的是,EIF1AX蛋白质是位于细胞核而不是突变后细胞质EIF1AX NLS HEC-1A和RL95-2细胞(数字序列3 (b)- - - - - -3 (d))。一般来说,小分子,~ - 40 kDa,可以被动扩散穿过核孔复合物(npc),而其他积极分子需要运输(37]。由于体积小(kDa 17日),EIF1AX被认为是被动扩散通过npc没有NLS序列;其积极的出口可能因此需要耗尽离原子核EIF1AX和维持足够的胞质水平(38]。我们认为可能的NLS之间的重叠和NES EIF1AX导致蛋白质序列移位后细胞核NLS / NES序列的突变。迈克尔等人还发现,M9的NES和NLS活动是相同的或重叠的突变体块M9 NLS活动并废除NES活动(39]。
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为了测试以上假设,我们进一步探讨了目标EIF1AX出口因素。先前的研究指出,IPO13 EIF1AX运输车的海拉细胞(40];因此,我们设计了一种可以阻止针对IPO13压制的运输过程EIF1AX蛋白质(图4(一))。然而,EIF1AX的位置没有改变IPO13击倒后(数字4 (b)和4 (c)),coimmunoprecipitation的结果还表明,EIF1AX没有与IPO13(图4 (d))。
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格等人预言eIF1A出口离原子核并不是唯一的IPO13以及其他可能涉及出口因素,如XPO1和可能发生在复杂与其他蛋白质(30.]。有趣的是,EIF1AX的表达增加XPO1击倒后的核(图S4E,数据5(一个)和5 (b))。LMB, XPO1-cargo形成抑制剂(41),也用于证明EIF1AX和XPO1之间的关系。EIF1AX显著增加( )在细胞核中有40 nM LMB治疗在RL95-2和HEC-1A细胞(图5 (c))。免疫荧光也证明EIF1AX抑制从把细胞质40 nM LMB组(图5 (d))。然而,我们还发现,EIF1AX蛋白表达降低细胞质和细胞核在HEC-1A 80 nM leptomycin B治疗后细胞而不是RL95-2细胞。结合CCK-8的结果,它可能是80海里leptomycin B HEC-1A细胞的细胞毒性(图S4F)。它建议EIF1AX被转运到细胞质的XPO1-mediated EC细胞的核出口通道。此外,coimmunoprecipitation结果表明XPO1可以与EIF1AX但不是当EIF1AX的NLS (NES)突变(数字5 (e)和5 (f))。研究结果进一步暗示NLS序列预测的主办Mapper NES序列或它们之间的重叠。
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3.5。EIF1AX蛋白质击倒或易位导致减毒肿瘤细胞外渗在活的有机体内
肿瘤细胞表达野生型和突变体的能力NLS序列溢出到肺被注入相同数量的HEC-1A细胞测量裸小鼠尾静脉。正如所料,老鼠注射细胞表达EIF1AX shRNA发达萎缩转移性结节证明通过总值和组织学分析。此外,与KD + Esm组相比,小鼠注射细胞表达EIF1AX NLS序列突变也出现了萎缩的转移性结节(图6)。结果也进一步表明EIF1AX转移到细胞质中有一个重要的角色在EC的发生和发展。
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4所示。讨论
EIF1AX被认定为癌症司机在甲状腺癌基因。EIF1AX突变出现在11%的低分化甲状腺癌和未分化甲状腺癌,几乎总是与致癌RAS突变(42]。突变的重要同现国家管制当局方面和EIF1AX还发现在低级的浆液性卵巢癌癌。突变的coexpression国家管制当局方面和EIF1AX蛋白促进增殖和clonogenicity生存LGSC细胞(24]。这些结果暗示EIF1AX和拉可能驱动肿瘤恶化表现为协同作用。在这项研究中,没有突变EIF1AX编码区被确定。原因找到可能包括小样本数量、有限的区域评估,和方法的敏感性。在协议与乳腺癌和卵巢癌的结果(24,29日),据我们所知,我们首次展示了更高的异位表达EC的EIF1AX蛋白质水平比正常组织和癌前病变。细胞质EIF1AX表达呈正相关不利的临床病理特征和EC的不良预后。
蛋白质合成的异常调节异常经常被报道与癌症有关(43,44]。EIF1AX起着关键作用的扫描和8月选择和不同影响翻译不同的mrna (20.]。EIF1AX在肿瘤发病机制也起着重要的作用。大家都知道,5UTR长度是由eIF1A平移控制所涉及的主要特征在哺乳动物细胞(28]。癌症相关的eIF1A NTT突变体主要是提高翻译的长5UTR mrna调节细胞增殖、分化、入侵、转移和血管生成24]。通过使用胚胎成纤维细胞细胞模型,女儿乌米拉等人表明,与大多数细胞细胞增殖显著下降的差别在siRNA-mediated后的G1期对这些逮捕EIF1A表达水平(28]。在这项研究中,EIF1AX是调节EC细胞的细胞质中,和EIF1AX击倒或易位到细胞核明显减少EC细胞迁移和入侵的能力与钙粘蛋白过度,和蜗牛hypoexpression在蛋白质水平在体外,EIF1AX击倒也抑制扩散在体外。我们的研究结果与先前的结果部分协议在甲状腺中,卵巢癌和乳腺癌24,26,27,29日]。虽然EIF1AX肿瘤发生和癌症发展的贡献并不清楚,EIF1AX已经发现与癌症相关的信号通路包括PI3K / AKT / mTOR和Ras / ERK信号通路,以及致癌基因原癌基因(26,45- - - - - -48]。EIF1AX更深入地理解在癌症、EIF1AX也许是个不错的分子基因治疗在未来的目标。
已知的蛋白质表现出不同的生物功能根据他们的亚细胞位置;因此,核质运输在真核细胞是一个重要的活动。EIF1AX是本地化的核仁,胞浆和核出口过程包括特定交互的运输车IPO13和EIF1AX定位序列在海拉细胞38]。格等人随后调查了3.6°的晶体结构在复杂RanGTP和eIF1A IPO13并指出,至少有一小部分通过XPO1-dependent eIF1A可能出口途径(30.]。少与上面一致,我们的实验在EC细胞显示LMB治疗有效地抑制XPO1-mediated,但不是IPO13-mediated,细胞质EIF1AX出口。这些结果之间的差异可能与细胞的类型和/或实验条件使用。XPO1抑制剂是一类独特的药物,目前正在评估一些I / II / III期临床研究(49- - - - - -51]。最近的研究指出,selinexor (XPO1-mediated核出口的批准抑制剂)+化疗是一种安全、容忍治疗晚期卵巢癌和子宫内膜癌患者(52,53]。我们的发现可能部分提供一个理论依据上述临床试验的结果。此外,我们确定了EIF1AX NLS序列。实际上,其他因素包括蛋白质折叠构象,蛋白质转录后的修改,和蛋白质-蛋白质之间的关系可能会影响识别和绑定转运蛋白和基质之间除了氨基酸序列(54,55]。
5。结论
总之,EIF1AX蛋白的调节表达和核质易位发生在EC。细胞质EIF1AX的表达呈正相关,积极的EC患者的临床病理特征和预后不良,这也可能导致异位EIF1AX表达式的能力促进EC细胞增殖,迁移和入侵。的具体位置信号序列EIF1AX被XPO1在EC细胞,然后运输到细胞质中。这些结果表明,EIF1AX可能EC的发生和发展的重要作用。因此,EIF1AX可能作为基因治疗的潜在目标。
缩写
| EIF1AX: | 真核翻译起始因子1,x染色体 |
| 电子商务: | 子宫内膜癌 |
| XPO1: | 间1 |
| IPO13: | Importin13 |
| LMB实验室: | Leptomycin B |
| 菲戈: | 国际妇产科联合会。 |
数据可用性
所有的数据是封闭的手稿。
伦理批准
福建医科大学的伦理委员会已经批准了动物研究(道德规范:llslbh - 20210930 - 002)。第一附属医院的伦理委员会福建医科大学已批准人类实验(道德规范:[2019]096号)。
同意
书面知情同意了所有的参与者。
的利益冲突
作者都没有任何利益冲突声明。
作者的贡献
s . w . S.Z.设计的研究。c . l .执行Co-IP、撕裂和RNA拉下来。j·S。,C. L., and X.L performed CCK-8 detection and western blot. Y. Y. and X. J. performed endometrial cancer cell administration. Z. L. and J. S. conducted RNA-seq. Y. L., H. L., and Y. Y. performed RT-qPCR. Y. H. and Y.C. prepared tissue samples. J. S. C.L. and Y. Y. wrote the manuscript. S. W. and S.Z. supervised the whole study. Yuhong Ye, Chengyu Lv, and Jiandong Sun contributed equally to this work.
确认
我们感谢凌林从福建医科大学的公共技术服务中心的技术援助。支持的工作是福建省科技创新基金会(2017 y9114),福建医科大学的科研启动基金(2018 qh2016),和中青年关键人员培训项目福建省卫生委员会(2019 - zqn - 61)。
补充材料
补充1。图S1:原理图显示插入序列的重组质粒。(一)EIF1AX成分的目标。(B)的同源序列EIF1AX编码EIF1AXsm质粒避免损耗EIF1AX成分。(C)添加NLS序列从SV40 EIF1AX糖基。(D)添加SV40的NLS序列同源EIF1AX糖基。(E)点突变的NLS EIF1AX序列。图S2: Sanger测序结果EIF1AX基因在子宫内膜癌组织中。与正常组织相比,30 EC患者的组织并没有发现任何点突变、删除或插入编码区域EIF1AX。图S3:子宫内膜癌患者的总生存期。EC患者的总体生存曲线EIF1AX表达式(组3)高、低EIF1AX表达式(组2)和阴性对照组(组1)。图S4: EIF1AX或EIF1AX-SV40NLS EC细胞系的表达。(一)免疫荧光观察的位置在HEC-1A EIF1AX蛋白质,RL95-2, ECC-1细胞。酒吧规模:100μm。(B)免疫印迹检测EIF1AX在EC细胞系的表达。(C, D) EIF1AX蛋白的表达与EIF1AX-SV40NLS质粒转染后。酒吧规模:100μm。酒吧规模:50μ年的放大。学生的 - - - - - -测试: , ,和 。酒吧表明SD。(E) XPO1后的表达XPO1可拆卸的。(F) CCK-8 EC细胞系的细胞活性检测到LMB治疗1 h。单向方差分析: , 。酒吧表明SD。
补充2。补充表1:针对IPO13和XPO1 siRNA序列。
补充3。补充表2:EIF1AX-CDS的引物序列扩增和测序。