文摘
客观的。本研究的目的是调查是否组织激肽释放酶(KLK1)可以防止前列腺炎性损伤和参与机制。方法。共有50个雄性Wistar鼠被用于这项研究。最初,20个老鼠牺牲获得前列腺抗原诱导实验性自身免疫性前列腺炎(EAP),剩下的30老鼠被随机分成5个实验小组(正常对照组(NC组),数控+ KLK1集团(NCK组),EAP集团EAP + KLK1集团(EAPK组),和EAP + KLK1 + HOE140集团(EAPKH组); )。应该说KLK1主要发挥其生物效应通过缓激肽,HOE140是强有力的和选择性血管舒缓激肽B2受体(BDKRB2)拮抗剂。EAP被皮内注射诱导前列腺癌抗原15毫克/毫升0和完全弗氏佐剂天,14日和28日。KLK1通过尾静脉注射的剂量 U盘/公斤一天一次,HOE140是由腹腔内注射20μ克/公斤每隔两天。老鼠在42天牺牲了。大鼠前列腺的RNA和蛋白质提取分析KLK1的表达差异,以及炎症、纤维化和氧化应激相关基因。前列腺的炎症细胞浸润和微脉管密度也分析了病理检查。此外,前列腺患者样本进行病理分析良性前列腺增生(BPH)手术。结果。KLK1的表达在前列腺癌减少EAP集团以及BPH患者明显的炎症。KLK1管理显著抑制炎症细胞浸润和减少EAPK组中炎性细胞因子的生产。前列腺EAP组样本显示,增加T细胞和巨噬细胞的浸润,以及腺萎缩,缺氧,纤维化,血管生成。KLK1政府调节内皮一氧化氮合酶(以挪士)表达和抑制氧化应激,以及转化生长因子β1 (TGF -β)信号通路和proangiogenic血管内皮生长因子(VEGF) EAPK组。然而,HOE140封锁BDKRB2 EAPKH组,的有利影响KLK1都取消了。此外,KLK1干预正常的老鼠没有明显的副作用。结论。KLK1表达式是抑制前列腺发炎的人类和老鼠。通过BDKRB2-dependent外生KLK1恢复内皮功能方式,然后扮演了一个角色在改善微循环和抗炎,antifibrotic,老鼠chronic-inflamed前列腺抗氧化应激的影响。
1。介绍
良性前列腺增生是一种常见的和麻烦的良性增生性疾病和有重大影响的中年和老年男性的生活质量。良性前列腺增生的患病率随着年龄的上升。大约有40%的50岁的男性和90%的90岁男性遭受BPH (1]。随着年龄的增长,各种致病因素共同导致了进步的前列腺腺上皮和间质细胞增生等病变,这进一步导致前列腺肥大,膀胱出口梗阻,最终导致附近地区,如尿犹豫、频尿失禁,疼痛,夜尿症。我们之前报道的保护作用KLK1啮齿动物衰老的前列腺癌(2]。炎症是良性前列腺增生的重要机制之一发展近年来发现。研究表明,炎症不只是偶尔相伴,而是在其病因中扮演着重要角色3- - - - - -7]。在本文中,我们将报告的影响KLK1炎症机制在BPH /附近地区通过使用一个EAP鼠模型。
临床研究证据显示,在男性前列腺炎症更常见良性前列腺增生/附近地区和与症状严重程度和进展的风险(8,9]。与病理研究前列腺癌患者的手术样本的分析结果表明,慢性前列腺炎组织有更大的基质体积比正常前列腺组织(10]。在实验室的研究中,多种炎症介质,促进局部血管生成和前列腺上皮细胞的增殖或基质细胞被发现(3,11),BPH-related病理表现也被观察到具有一个EAP鼠模型(12]。政府引起的慢性前列腺炎大鼠的抗炎药雌二醇防止炎症浸润,减少stroma-to-epithelium比率(7,13]。此外,许多动物实验也表明,炎症诱发慢性骨盆疼痛,氧化应激,血管生成、基质重塑,胶原蛋白沉积在前列腺12,14- - - - - -18]。总之,炎症可能驱动疼痛的信号,缺氧,增生性的增长和良性前列腺增生纤维化/附近地区。
kallikrein-kinin系统由激肽原、激肽释放酶激肽肽,kinin-degrading酶和激肽受体,其生理功能主要是由细胞分裂素肽和随后的细胞分裂素受体激活(19]。系统是一种内源性multiprotein代谢级联,涉及大量的生物过程和内稳态20.]。KLK1系统的重要组成部分,参与调节微循环,血压和血流通过处理LMWK释放BK (21]。BK缓激肽受体结合B1和B2激活下游几个目标,如不,cGMP,环前列腺素,营20.]。B2受体是一种既定的G protein-coupled受体表达,表现出广泛的有利影响,而B1受体表达在正常情况下处于非常低的水平(19]。许多研究证明了KLK1补充疗法有利于许多疾病包括可怜的微循环,具有抗炎,antifibrotic,终末器官的功能障碍和抗氧化效果改善19,21]。以前,我们建议KLK1可以减弱老年性前列腺癌和转基因老鼠窝藏岁阴茎损伤人类KLK1基因通过减少纤维化和通过调节氧化应激相关的信号通路2,22,23]。我们还发现KLK1的保护作用在大鼠阴茎海绵体内皮细胞模型的半胱氨酸24]。然而,KLK1是否能防止前列腺炎症损伤,从而帮助抑制前列腺肥大的进展/附近地区尚不清楚。
2。材料和方法
2.1。实验动物
本研究的动物实验伦理委员会和学术管理委员会批准同济医院、同济医科大学、华中科技大学(武汉,中国),与道德号码tjh - 202101005。实验程序都是严格按照指导实验室动物保健和使用的由美国国家卫生研究院出版。共有50个男性8-week-old Wistar鼠从至关重要的河购买实验动物技术有限公司(中国,北京)。所有老鼠都分别安置在层流的SPF设施,维护 和 相对湿度与12 h光/ 12 h黑暗的光周期,和培育专业的饲养者。
2.2。良性前列腺增生患者的样本分析
回顾性分析临床资料和前列腺标本收集后进行从所有患者获得知情同意和批准的同济医院的伦理委员会和学术管理委员会(伦理号:TJ-IRB20211113)。H&E-stained部分、Masson-stained部分和KLK1包含IHC部分参与当前的研究被妥善保存部分,用于我们的先前的研究[2]。具体实验过程已经在前一篇文章中描述的。Formalin-fixed前列腺组织石蜡包埋块得到来自47个患者被诊断为良性前列腺增生病理和接受经尿道前列腺切除术在同济医院从2018年到2019年,年龄在48至92年。患者疑似恶性病理特性被排除在外。
通过检查)的章节中,我们发现6个样品有明显的炎症浸润。应该注意,样品只有一个轻度炎症焦点或渗透少量炎症细胞被排除在外。我们比较了不同Masson-positive面积比和KLK1蛋白质的表达水平之间的6个样品有明显的炎症和其余41个样本没有明显的炎症。
2.3。动物分组和药物管理局
所有的老鼠都在12周的治疗,直到性成熟。然后,他们被随机分为6组,包括5组,每组6大鼠实验,另一组老鼠20牺牲获得前列腺抗原。根据不同的干预措施,5实验组命名为正常对照组(NC组),数控+ KLK1集团(NCK组)、实验性自身免疫性前列腺炎组(EAP组),EAP + KLK1组(EAPK组)和EAP + KLK1 + HOE140集团(EAPKH组)。
诱导EAP的方法是基于以前的研究(12,16]。在我们目前的研究中,20个老鼠牺牲颈椎脱位,和前列腺组织获得和均质0.5% Triton x - 100(目录没有。20107 es76, Yeasen生物技术,中国);匀浆被保存在冰水浴。他们在10000年被离心机在4°C为30分钟,上层清液分离。上层清液中的蛋白质浓度由BCA蛋白质化验(目录没有量化分析工具包。AR1189A博士德生物技术、中国)和稀释至15毫克/毫升的浓度为0.1 mol / l PBS缓冲。相同体积的大鼠前列腺癌蛋白提取和完全弗氏佐剂(目录没有。美国Sigma-Aldrich F5881)乳化免疫。老鼠EAP组EAPK组和EAPKH组麻醉的腹腔内注射戊巴比妥(40毫克/公斤)。然后,每个老鼠皮内接种后拦路贼和尾巴底部的共有1.0毫升的乳液。老鼠在NC组和NCK组和NS乳化完全弗氏佐剂免疫。所有大鼠接受免疫天0,14日和28的实验安排和牺牲了42天。腹侧前列腺叶很快被移除,1/3的双边腹侧叶与4%多聚甲醛固定24小时,然后嵌入在组织学研究石蜡和剩余的组织被冻结在-80°C。 The specific experimental process is shown in Figure1。
KLK1用于本研究的药物已经批准的中国药物监管机构称为Kailikang®(天普生药,中国),这是由人类尿KLK1和佐剂。Kailikang®是溶解在NS U盘/毫升。EAPK集团NCK组的老鼠和EAPKH集团通过尾静脉注射KLK1剂量的 U盘/公斤每天一次。HOE140(目录号3014年,美国研发系统)是一个强大的和特定的肽血管舒缓激肽B2受体的拮抗剂(25]。HOE140首次在无菌蒸馏水溶解并存储在整除在-80°C,然后用生理盐水稀释前政府EAPKH组的老鼠在一个剂量的20倍μ克/公斤每隔两天。所有的老鼠被给予药物或同等体积的车辆以同样的方式。
2.4。RNA隔离和存在
从冷冻组织总RNA提取试剂盒试剂(目录没有。美国15596018,英杰公司)和估计的数量在260/280 nm使用NanoDrop nd - 1000分光光度计(美国NanoDrop技术)。1μg的总RNA样本反向转录成cDNA使用PrimeScript™RT大师(目录没有混合。RR036A、豆类、中国)。执行中存在确定感兴趣的基因的mRNA水平基于结核病绿色®预混料交货Taq™II(目录没有。RR82LR、豆类、中国)使用QuantStudio™6 Flex实时PCR系统(美国热费希尔)。引物是Tsingke生物科技(中国)提供的。研究基因的信使rna表达水平规范化的β肌动蛋白;相对mRNA表达水平计算使用2−ΔΔCt方法。所有样品都是独立重复三次进行分析。
2.5。免疫印迹分析
大鼠前列腺组织细胞溶解了里帕蛋白质提取缓冲(目录没有。AR0105博士德生物技术,包含磷酸酶和蛋白酶抑制剂(中国)目录。AR1182-1博士德生物技术,中国)。相等数量的蛋白质是解决在SOD SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到PVDF膜电位梯度(美国微孔)。与5% BSA被屏蔽后1小时在室温下,一夜之间,膜被孵化在4°C与主要抗体,然后孵化HRP-conjugated二级抗体1 h。洗涤三次后,乐队进行了分析使用一个增强化学发光检测系统(皮尔斯,热费希尔科学)。主要的抗体KLK1(目录号32443)和β肌动蛋白(目录号21800)从Signalway购买抗体(美国)。主要的抗体胶原蛋白I型(目录没有。14695 - 1 - ap),胶原蛋白类型III(目录没有。22734 - 1 - ap), TGF -β(目录号21898 - 1 - ap), RhoA(目录号10749 - 1 - ap), ROCK1(目录号21850 - 1 - ap), HIF-1α(目录号20960 - 1 - ap), VEGF(目录号19003 - 1 - ap)和以挪士(目录没有。27120 - 1 - ap)从Proteintech购买(中国)。分析了乐队的光学密度ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。对数据进行归一化β肌动蛋白作为内部控制。所有独立样本进行了分析通过三个重复,平均测定值。
2.6。组织学检查
2.6.1。他走时,马森的三色的染色
4% paraformaldehyde-fixed前列腺组织样本进行石蜡包埋和切片厚度5μm。组织部分染色)染色设备(目录没有。中国Solarbio G1120)和马森的三色的染色工具(目录号G1340 Solarbio,中国)使用标准程序,分别成像在光学显微镜(日本奥林巴斯)。鼠前列腺炎症的严重程度评估通过确定组织学评分根据圆)的照片。如前所述(26),病理等级评估5个随机领域在100 x采用双盲法,每个部分的放大。炎症的程度是评估使用0 ~ 3分:0,没有炎症;1,温和但明确的血管周的成套单核细胞;2、中度血管周的成套单核细胞;和3,血管周的成套、出血和众多的薄壁组织中单核细胞。在马森照片中区域主要是由胶原蛋白成分,这被认为是积极的马森染色在我们目前的研究领域。Masson-positive面积比是定量分析使用ImagePro + 6.0软件(媒体控制论)5个随机领域的每个部分的100 x放大。
2.6.2。包含IHC
一夜之间,部分被孵化与KLK1抗体在4°C, CD3(目录号17617 - 1 - ap, Proteintech)、CD68(目录没有。28058 - 1 - ap, Proteintech)和CD34(目录号14486 - 1 - ap, Proteintech)。部分被洗了三次,孵化与生物素化的二次抗体。最后,抗原抗体反应是被染色diaminobenzidine (Beyotime,中国)。定量分析了评估KLK1-positive区域的大气气溶胶使用ImagePro + 6.0软件。CD3-positive T细胞、CD68-positive巨噬细胞和微血管cd34多采用双盲法,被研究者视觉计算。五个随机领域的200 x放大每个部分进行评估。
2.6.3。如果
与抗体特定部分被清洗和孵化αsma(目录号14395 - 1 - ap, Proteintech)一夜之间在4°C,然后与二次抗体1 h在室温下在黑暗中。南部的部分是通过添加DAPI(生物技术),用荧光显微镜检查(奥林巴斯、日本)。5个随机领域的荧光强度在200 x放大使用ImageJ软件分析了每个部分。
2.7。分析大鼠前列腺细胞因子蛋白概要文件
鼠前列腺样本是随机选择从每个数控集团的EAP集团EAPK组,分别和EAPKH集团。等量的冷冻前列腺组织在液氮和均质粉与蛋白酶抑制剂PBS。组织匀浆的蛋白质浓度检测由BCA蛋白质定量分析工具。前列腺细胞因子蛋白水平分析了使用大鼠细胞因子数组面板(目录没有。ARY008、研发系统、美国)根据制造商的指示。像素密度的13细胞因子与可见的差异4 x射线分析了电影使用ImageJ软件开发。
2.8。评估MDA、SOD和活性氧
MDA检测设备(目录没有。A003-1-2)和SOD检测设备(目录没有。A001-3-2)购自南京建成生物工程研究所(中国)。化验进行根据制造商的指示。通过三个重复,所有样本分析独立和总蛋白浓度检测规范化数据。原位生成的活性氧在前列腺组织评估使用dihydroethidium(目录没有。Sigma-Aldrich D7008,中国),根据制造商的指示。DAPI用于染色细胞核促进细胞计数。使用荧光显微镜染色组织的可视化。 。五个随机领域在200 x放大使用ImageJ软件分析了每个部分的。
2.9。统计分析
结果分析了使用GraphPad Prism 9.0软件(GraphPad软件,美国),表示为 。两组之间的差异被双尾学生的分析 - - - - - -测试。单向方差分析之后,图基的多重比较测试被用来识别多个组之间的差异。特别是,当比较2的数据类型的前列腺肥大和样品不同程度的炎症,该预估中值显示,Mann-Whitney测试是用来识别的差异是否显著。统计的差异被认为是重要的时候 (ns, ; ; ; ;和 )。
3所示。结果
3.1。Downregulation KLK1在慢性前列腺炎的发展
通过圆)的结果部分,我们证实了EAP组成功地诱导慢性前列腺炎,表现为腺萎缩,增厚的平滑肌,弥漫性浸润的炎症细胞(图2 (f))。此外,与NC组相比,KLK1 mRNA和蛋白表达水平的EAP的前列腺组显著降低(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。也可以看到IHC照片的表达在前列腺上皮细胞KLK1 EAP组低于NC组(数字2 (d)和2 (e))。这些结果表明KLK1的表达在前列腺是抑制慢性前列腺炎的发展。然而,注入KLK1可以减少炎症损伤,表现为正常的腺上皮和腺腔,并显著降低前列腺的炎症细胞浸润EAPK组(图2 (f))。值得注意的是,KLK1政府正常大鼠(NCK组)并不影响前列腺的病理表现,HOE140阻塞KLK1 / BK信号通路(EAPKH集团)的抗炎效果KLK1前列腺炎被取消(图2 (f))。
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(d)
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3.2。KLK1管理显著抑制前列腺的炎症
通过我的照片和细胞计数,我们发现CD3-positive EAP组T细胞和巨噬细胞CD68-positive NC组相比均有显著增加,但CD3-positive EAPK组T细胞和巨噬细胞CD68-positive EAP组相比均有显著降低(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。评估炎症程度还显示,KLK1管理局(EAPK集团)显著降低前列腺炎的严重程度(图3 (e))。同时,数控组与NCK组比较,KLK1政府正常老鼠并未导致前列腺炎症细胞浸润。大鼠细胞因子的结果数组面板显示CINC-1,据,CX3CL1, ICAM1, il - 1β,CXCL10 IL-1ra LIX、LECAM-1 CCL5, CXCL7, TIMP-1, VEGF是调节EAP集团(数字3 (f)和3 (g))。尤其是IL-1ra的增加,LECAM-1, CXCL7 EAP的组超过10倍于NC组。然而,KLK1政府可以减少所有13个细胞因子的upregulation TIMP-1除外。另一方面,bcl - 2、BAX EAP组的结果显示细胞凋亡的减少,但EAPK组细胞凋亡水平与NC组(图3 (h))。从EAPKH组和EAPK组之间的比较,可以看出KLK1的影响在减少炎性细胞浸润、抑制细胞因子的产生,并恢复正常的细胞凋亡水平都是由HOE140取消(数字3(一个)- - - - - -3 (h))。
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3.3。在慢性前列腺炎KLK1政府抑制前列腺间质纤维化
马森的三色的染色,面积比EAP的胶原蛋白组和EAPKH组高于数控组和EAPK组(数字4(一)和4 (b))。存在和免疫印迹,胶原蛋白的表达水平I型和III型胶原的EAP组和EAPKH组高于在NC组和EAPK组(数字4 (c)- - - - - -4 (e))。这些结果表明,炎症诱导显著前列腺细胞外基质沉积,但KLK1政府抑制这一过程。此外,通过检测TGF -β/ RhoA / ROCK1 /αsma信号通路,我们发现有一个调节过程,从成纤维细胞分化转移到myofibroblasts EAP组(数字4 (c)- - - - - -4 (g)),但KLK1政府抑制这一信号通路。标记的αsma、myofibroblasts和EAP组平滑肌细胞和EAPKH显著增加(数据4 (f)和4 (g))。此外,从所有的结果(数据4(一)- - - - - -4 (g)),数控组和NCK组比较,我们可以发现管理KLK1正常老鼠并没有导致前列腺纤维化。和比较EAPK组和EAPKH集团HOE140取消antifibrosis和antitransdifferentiation KLK1的影响。
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3.4。KLK1改善前列腺组织缺氧,血管生成和氧化应激引起的炎症
微血管的被CD34标记。排除假阳性面积在腺体染色,计数结果显示,EAP的MVD组显著高于EAPK的NC组和MVD组显著低于EAP集团(数字5(一个)和5 (b))。存在和免疫印迹,调节HIF-1α表明有缺氧大鼠前列腺EAP组和HIF-1使之抑制αKLK1 EAPK集团表示,政府的显著改善缺氧引起的炎症(数字5 (c)- - - - - -5 (e))。不同于大鼠细胞因子组小组实验每组只检测一个样品,我们进一步检测VEGF的表达在所有大鼠存在和免疫印迹。显著调节VEGF表达水平解释了EAP组MVD增加;然而,KLK1政府明显抑制VEGF的表达,从而也抑制血管生成(数据5 (c)- - - - - -5 (e))。此外,炎症诱导大鼠前列腺EAP组微血管功能障碍;然而,在EAPK集团KLK1政府调节以挪士发挥保护作用的微脉管(数据5 (c)- - - - - -5 (e))。ROS原位荧光照片显示,炎症引起的活性氧的增加大鼠前列腺EAP集团和KLK1管理局可以抑制ROS的产生引起的炎症(数字5 (f)和5 (g))。此外,EAP组明显下降SOD活性和MDA含量显著增加,这意味着炎症已经摧毁了oxidation-antioxidant平衡前列腺癌和前列腺造成氧化损伤(数字5 (h)和5(我))。KLK1管理显著改善inflammation-induced EAPK组织氧化应激,但EAPKH组的结果表明,HOE140废除这种效应(数字5 (h)和5(我))。
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3.5。良性前列腺增生患者的炎症抑制KLK1表达式
通过检查HE-stained部分,我们发现6个样品有明显的炎性浸润,有多严重的炎症病灶(密集,大面积积累的炎性细胞,如图所示。样品只有一个轻度炎症焦点或渗透少量炎症细胞分散被分配到样品没有明显炎症组。KLK1表达水平的样品有明显炎症显著低于样品没有明显炎症(数字6(一)和6 (c))。样品有明显的纤维化水平炎症似乎高于样品没有明显炎症,但检验结果未达到统计上的显著水平。
(一)
(b)
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4所示。讨论
在先前的研究中发现的潜在的保护作用KLK1老年前列腺癌(2),我们进一步探讨KLK1前列腺炎症损伤的作用研究。我们发现KLK1的表达减少大鼠的前列腺发炎,KLK1管理局显著抑制炎症细胞浸润和降低炎性细胞因子的生产。慢性前列腺炎大鼠前列腺样本模型显示增加T细胞和巨噬细胞的浸润,以及炎症损伤的病理表现,如腺萎缩,间质重构,胶原沉积,血管生成。KLK1政府抑制TGF -β相关纤维化信号通路,增加以挪士的表达以及改善缺氧、氧化应激,抑制前列腺炎大鼠的proangiogenic VEGF。然而,BDKRB2 HOE140阻塞后,有益的影响KLK1都取消了。此外,KLK1干预正常的老鼠没有明显的副作用。实验结果对人类前列腺肥大手术样本显示,KLK1的表达在前列腺癌减少在BPH伴有明显严重的炎症。这些结果表明KLK1或kallikrein-kinin系统的失调可能发挥重要作用的前列腺炎症持续存在,甚至发展到前列腺肥大。
自从据报道,炎症组织学前列腺标本是常见的,许多研究良性前列腺增生的发病机理提出一个角色组织学炎症的发生发展的良性前列腺增生(27,28]。可能有一种自身免疫性组件在BPH,抗原刺激可能导致慢性炎症反应的发展导致前列腺组织重建和基质生长(29日]。我们之前报道的轻微的慢性自身免疫性前列腺炎会进化成BPH评估累计病理评分在老鼠模型中(12]。在我们目前的研究中,我们选择了一个严重的自身免疫性炎症诱导程序为了显示KLK1炎症更明显的效果。应该指出,除了这个模型外,还有其他慢性前列腺炎的诱导方法,比如intraprostatic注入3%的方法λ卡拉胶,通常,他们有相似的细胞因子资料,比如升高il - 1和il - 6 (30.,31日]。在这项研究中,我们利用一系列商业大鼠细胞因子面板。我们报道显著调节il - 1实验结果部分,但不是il - 6。il - 6的差异只是清晰可见的γ值原始照片后调整,我们关心的是偏差调整照片放大,所以没有il - 6的差异报告。然而,在我们和别人的之前的类似研究[12,32),il - 6是调节EAP模型,所以我们认为,在这项研究中,感应的EAP模型是成功的,但一些炎症因子可能需要更合适的检测方法对显示显著差异。在这只老鼠EAP模型中,皮下注射前列腺抗原持续刺激免疫系统对自己的前列腺癌,浸润炎症细胞和慢性损害了居民前列腺癌的细胞和血管。氧气供应的效率差是由于前列腺癌高度特异表达周边微脉管系统。此外,这是随着氧需求的增加激活浸润炎症细胞和前列腺细胞,促进缺氧微环境和线粒体功能障碍。局部缺氧进一步刺激炎症介质的产生和生长因子,形成一个恶性循环。通过检测增加HIF-1αROS,我们证明有明显的缺氧和氧化应激大鼠前列腺炎症。此外,表达下调SOD和MDA的增加表明oxidation-antioxidant平衡在这个严重的前列腺炎模型已经完全失去平衡。就像缺氧,血管生成是常见的发现在人类良性前列腺增生组织33,34),我们的EAP模型成功地模拟BPH-related慢性炎性细胞浸润等病理条件下,缺氧,血管生成。另一方面,据报道,减少细胞凋亡通常发生在发炎萎缩性病变(35,36),这可能涉及潜在的致癌性的慢性或复发性炎症18]。虽然没有证据表明人类良性前列腺增生前列腺癌进展,减少细胞凋亡的EAP鼠前列腺本研究观察,KLK1管理局恢复细胞凋亡水平。事实上,由于许多因素如解剖特点和疾病,老鼠EAP模型不可能完全模拟人类前列腺肥大的进展,但在这项研究中,KLK1改善EAP的各种炎症性损害赔偿包括减少细胞凋亡模型确实是可喜的。然而,只有使用EAP模型也是本研究的局限性。EAP模型只能模拟慢性无菌前列腺炎。仍然是未知的,不管是其他常见类型的前列腺炎,急性前列腺炎或细菌性前列腺炎等,将开发像上述过程或被KLK1改善。基于EAP模型中令人满意的实验结果,KLK1其他前列腺的影响模型似乎是预期。然而,不同炎症发展不同,KLK1的抗炎效果并不直接影响炎症细胞;因此,这个问题需要回答另一个系统的研究。
内皮功能障碍,这是一种常见的病理生理过程,老龄化,高血压、糖尿病、高脂血症,和其他良性前列腺增生的临床危险因素/附近地区,导致一个恶性循环的缺氧,血管收缩,血管平滑肌收缩性改变,和自主神经细胞和神经节变性37]。内皮功能障碍主要源于没有生物利用度和受损的特点是降低常内皮刺激(37]。受损生物利用度不可以从减少结果以挪士活动或故障的增加了活性氧(37]。内皮功能障碍是关键和良性前列腺增生的发病机理中常见的初始步骤/附近地区可能是一个优秀的治疗目标。PDE5I研究显示,调节NO / cGMP信号通路通过抑制PDE5有效改善内皮功能,导致内皮细胞抗炎效应和改善前列腺局部缺血和纤维化38- - - - - -40]。考虑到通过BDKRB2-dependent KLK1调节以挪士表达机制,我们相信PDE5I以类似的方式,与长期KLK1管理,以挪士/不/ cGMP信号通路的前列腺微循环可能恢复,然后,内皮功能障碍、炎症过程的控制。
已经证明,通过BDKRB2 KLK1信号通路展览广泛的有利影响19]。特别是KLK1表达在不同的器官,如胰脏、唾腺,肾脏,心脏,和前列腺,KLK1作为前体合成和转化为活性形式的乳沟伴肽(41]。BK,容易降解作用于血管的细胞分裂素由KLK1处理LMWK,可以绑定到BDKRB2血管内皮细胞,激活以挪士/不通路。BDKRB2是一个具有高度选择性,G protein-coupled受体结构上用各种各样的组织和表达介导的大部分生物行为BK (42]。详细,激活BDKRB2刺激细胞膜磷脂代谢通过激活PLC和促进的释放没有通过eNOS-dependent机制(41]。没有迅速穿过细胞膜扩散到邻近的血管平滑肌细胞的细胞质中,在那里它绑定并激活国网公司作用于生产三磷酸鸟苷环鸟苷酸(43]。最终,包裹磷酸化的cGMP执行各种生理功能(43]。据报道,以挪士的表达式和cGMP水平阴茎海绵体的EAP老鼠显著下调(44),和一个病例对照研究表明,慢性前列腺炎的男性增加动脉硬化和血管内皮功能障碍的证据(45]。通过增加生产的炎性细胞因子和细胞粘附分子,不正常的内皮促进炎症在血管壁内,形成一个恶性循环46]。然而,在我们的研究中,KLK1政府阻止这种恶性循环。放大NO / cGMP通路可能导致的松弛血管平滑肌细胞内钙的差别,通过对这些基因2 +包裹和水平,最后,增加前列腺的血液供应。在这项研究中,我们发现KLK1政府可能上调以挪士和表达下调HIF-1αEAP老鼠和VEGF表达,这意味着前列腺内皮功能恢复和缺氧,血管生成抑制。在前列腺组织缺氧和内皮功能障碍被KLK1改善,inflammation-hypoxia恶性循环被打断。
前列腺纤维化是一种明显的损害前列腺慢性炎症引起的。stereological分析,患者症状性BPH stroma-to-epithelium比率高于无症状患者(47]。从慢性前列腺炎和慢性前列腺组织盆腔缺血性老鼠显示表达的增加αsma和胶原沉积增加12,38]。浸润炎症细胞和炎症前列腺基质细胞受到或者缺氧可以移植细胞因子的分泌,促进前列腺基质的增长和改造(18,48]。Myofibroblasts transdifferentiated从成纤维细胞可以分泌大量的细胞外基质,这是前列腺癌的一个重要原因纤维化(49]。增加所产生的ROS NOX4前列腺炎症和缺氧促进TGF -β表达式[49),移植RhoA / ROCK1通路的激活促进细胞骨架重排诱导病理过程的特点是fibroblast-to-myofibroblast分化转移(50]。我们的实验结果表明,KLK1政府下调ROS和TGF -β/ RhoA / EAP鼠前列腺ROCK1信号通路,从而抑制myofibroblasts和胶原蛋白沉积的形成。在先前的研究中,我们发现汉堡王可以抑制TGF -的表达β在前列腺基质细胞在体外(2),但在目前的研究中,我们认为主要原因antifibrosis是KLK1改善微循环,抑制缺氧和随后的激活TGF -β/ RhoA / ROCK1信号通路。然而,在人类前列腺肥大的长期发展,纤维化的进展是非常复杂的,不能唯一的诱导因素和炎症。从人类标本的实验结果,可以发现纤维化的程度高于样品的样品有明显的炎症没有明显炎症,但没有统计上的显著差异。在我们之前的研究中,我们还发现,KLK1的表达水平是负相关的人类良性前列腺增生的前列腺纤维化标本,但也没有统计上的显著差异(2]。因此,我们目前的实验结果确实表明KLK1可以减轻炎症,从而减少前列腺纤维化,但在人类良性前列腺增生发展的复杂的过程,这种帮助是有限的,和其他需要联合治疗良性前列腺增生的机制。
虽然在本研究KLK1显著抑制大鼠前列腺炎性损害,似乎仍有困惑KLK1和炎症之间的关系。以前,一般都认为BK是与病理生理过程伴随着组织损伤和炎症,因为BK及其受体参与血管渗透性增加,venoconstriction,和动脉扩张;此外,汉堡王是一个有效的内源性产生疼痛的物质(51- - - - - -53]。即使BK实验证明在孤立的犬前列腺组织引起的收缩反应,促进正常的人类的主要文化的扩散前列腺基质细胞(54,55]。在我们目前的研究中,BK,下游KLK1活性物质,起到了抗炎而不是激活BDKRB2后促炎效应。这可能是因为BDKRB2被激活主要在血管内皮细胞而非腺上皮或前列腺基质细胞。KLK1由尾静脉注射,正常情况下,血液中只有LMWK产生BK细胞溶解,这必然会在本地BDKRB2在血管内皮。重要的是,正常的老鼠注射KLK1没有出现前列腺炎症,表明KLK1不是一个潜在的促炎因子在我们的研究中。以及是否在BPH患者或EAP老鼠,前列腺炎中的表达KLK1降低,这也意味着补充KLK1可能正是需要对抗炎症。此外,它已经表明,前列腺有一个高水平的ACE活性,催化的酶促降解BK (56,57]。因此,我们认为,在这项研究中,外源性KLK1并激活BK主要扮演了一个角色在大鼠前列腺的微循环,但没有明显影响前列腺细胞直接。另一方面,我们也进行了一次preexperiment研究KLK1政府在不同时期对慢性前列腺炎的影响(实验设计和具体preexperiment补充文件所示的结果1)。preexperiment,我们比较的结果KLK1政府同时EAP模型构建和KLK1政府EAP模型完成后。KLK1政府同时模型的建立可以更好的发挥KLK1的疗效,特别体现在减少炎性细胞浸润和减少发炎萎缩性病变。这意味着KLK1的抗炎机制主要是炎症的早期阶段,如果已成为慢性炎症,KLK1将稀释后的治疗效果。在此基础上,我们进一步推测对自身免疫性KLK1前列腺炎的作用。自身免疫性炎症诱导过程中,抗原注入皮下注射第一触发免疫反应前列腺。炎症细胞的攻击和破坏前列腺细胞后,更多的前列腺抗原会加重免疫反应。如果KLK1管理和改善微循环功能障碍发生在诱导过程的开始,当地的前列腺炎症损伤可能是由一些稳态机制控制,这样就不会有更多的代前列腺抗原后加强免疫反应。相反,如果炎症细胞前列腺实质造成重大损失,即使KLK1恢复前列腺的微循环功能,身体很难完全停止通过自我调节慢性炎性损伤。
最后,尽管我们分析KLK1主要起到了保护作用在发炎前列腺通过改善微循环功能障碍,我们没有进行更详细的细胞实验来证明这一点。实验证明该机制可能涉及的建设一个更复杂的系统的血管内皮细胞,炎症细胞,前列腺细胞在体外。前列腺炎应该分析的后续深入研究特定类型的炎症细胞受KLK1 / BK BDKRB2 /以挪士/没有和他们的角色在微循环功能障碍,以及不清楚自我平衡的自我调节机制。另一方面,这项研究的结果也显示我们一些前景。RhoA / ROCK1信号通路,这已经被证明是受KLK1前列腺,也是密切相关的收缩和音调调节膀胱(58]。和自主/感觉神经功能障碍引起的内皮功能障碍也参与膀胱的感觉异常和活动(37]。因此,KLK1对膀胱患有良性前列腺增生的影响/附近地区也值得探索。
5。结论
前列腺炎KLK1表达减少。静脉注射外源性KLK1管理可以降低大鼠前列腺的炎症浸润和抑制慢性炎症性损伤,包括缺氧、氧化应激,血管生成,通过改善内皮功能障碍和纤维化。BDKRB2-dependent内皮保护机制中发挥着重要作用的前列腺癌和值得进一步研究。
缩写
| 大气气溶胶: | 平均光密度 |
| αsma: | α光滑的肌肉肌动蛋白 |
| BDKRB2: | 缓激肽B2受体 |
| 汉堡王: | 缓激肽 |
| 良性前列腺增生: | 良性前列腺增生 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| cGMP: | 环鸟苷酸 |
| 学术用途英语: | 实验性自身免疫性前列腺炎 |
| 以挪士: | 内皮细胞一氧化氮合酶 |
| 三磷酸鸟苷: | 鸟嘌呤核苷三磷酸 |
| ): | Hematoxylin-eosin |
| HIF-1α: | 缺氧诱导因子- 1α |
| 合: | 辣根过氧化物酶 |
| 如果: | Immune-fluorescence |
| 包含IHC: | Immune-histochemistry |
| 克鲁舍: | 组织kallikrein-kinin系统 |
| KLK1: | 组织激肽释放酶 |
| LMWK: | 低分子量激肽原 |
| 附近地区: | 下尿路症状 |
| MDA: | 丙二醛 |
| MVD: | 微脉管密度 |
| NOX4: | NADPH氧化酶4 |
| NS: | 生理盐水 |
| 包裹: | cGMP-dependent蛋白激酶 |
| 公司: | 磷脂酶C |
| PDE5I: | 磷酸二酯酶5抑制剂 |
| PVDF: | 聚偏二氟乙烯 |
| 存在: | 定量实时聚合酶链反应 |
| RhoA: | Ras同族体家庭成员 |
| ROCK1: | 包含蛋白激酶1 Rho-associated卷曲螺旋 |
| ROS: | 活性氧 |
| SD: | 标准偏差 |
| SDS: | 十二烷基硫酸钠 |
| 国网公司: | 可溶性鸟苷酸环化酶 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| 防晒系数: | 特定的病原体免费 |
| TGF -β: | 转化生长因子β1 |
| VEGF: | 血管内皮生长因子。 |
数据可用性
材料和方法和结果的数据来支持结论都包含在这篇文章。如果需要任何其他数据,请联系相应的作者。
的利益冲突
所有作者报告没有利益冲突。
作者的贡献
佐负责项目开发和手稿编辑;KC, PW, CL和DL负责数据收集和数据分析;MZ负责项目开发,数据收集,数据分析,和手稿写作。导致和批准所有的作者都最后的手稿。所有作者已阅读并同意发表这个手稿。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号81873625)。
补充材料
的实验设计和结果preexperiment调查KLK1政府在不同时期对慢性前列腺炎的影响提出了补充文件1。(补充材料)