文摘
动脉粥样硬化(AS)是一种慢性代谢性疾病的动脉壁,以脂质沉积和持续的无菌性炎症。的基础,被认为是各种心血管和脑血管疾病。人们普遍认为巨噬细胞内化后就会变成泡沫细胞脂蛋白粒子,这是一个动脉粥样化形成的初始因素。在这里,我们显示的影响布鲁顿的酪氨酸激酶(对)杀人案macrophage-mediated以及如何对调节巨噬细胞的炎症反应杀人案。我们的科学结果,建议对潜在杀人案中心基因,与氧化应激密切相关,在macrophage-induced ER应激和炎症。此外,我们发现对击倒杀人案可以抑制ox-LDL-induced NK -κB信号激活巨噬细胞和压抑的M1极化。机械的研究表明,氧化应激、线粒体损伤,在巨噬细胞ER应激也抑制了对可拆卸的杀人案。此外,我们发现sh-BTK腺病毒注射液可以缓解在ApoE的严重程度- / -高脂饮食引起的小鼠体内。我们的研究表明,对提升ox-LDL-induced ER应激杀人案,氧化应激,和巨噬细胞的炎症反应,这可能是一个潜在的治疗目标。
1。介绍
一样,这是心肌梗死血管闭塞性疾病和中风,动脉壁是一种慢性代谢性疾病,表现为脂质沉积和持久的无菌性炎症1]。是许多心血管疾病的病理学的一个重要组成部分,涉及血管内皮激活单核细胞招聘、积累和胆固醇在巨噬细胞2]。人们普遍认识到,巨噬细胞,这将成为泡沫细胞内化后脂蛋白粒子,在动脉粥样化形成起着重要的作用3- - - - - -5]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是导致血管硬化,形成泡沫细胞,进展(6]。M1巨噬细胞,清除胆固醇和低能力高磁化率成为泡沫细胞,参与最初的进展是由生产多种促炎的因素,以及与内质网应激有关(ER应激)和线粒体的压力7- - - - - -9]。产生的过多的活性氧(ROS),呃,线粒体等细胞器,不仅参与动脉粥样化形成的最初发展也在许多心血管疾病(10]。Mitochondria-associated膜(播出)是一个分子动态平台,与ER和紧密相关的线粒体和播出监管多个信号通路,特别是炎症通路,这可能影响巨噬细胞的反应11]。同时,M2巨噬细胞,抗炎因子分泌和吞噬能力高,随后将转向M1型的高级阶段(12,13]。
对Tec家族的成员在杀人案nonreceptor酪氨酸激酶调节无数的过程,如细胞发育、增殖,分化,先天免疫和适应免疫力14]。鉴于其在免疫建立角色B细胞炎症,一些研究报道,对药物目标杀人案B细胞恶性肿瘤和自身免疫性疾病15,16]。功能,对被认为是激活NF -杀人案κ我被磷酸化信号通路κBα蛋白质的主要抑制因子NF -κB,以及促进p65核易位,和一些研究人员发现,抑制对将阻止杀人案B细胞receptor-dependent NF -κB信号通路(17,18]。NF -κB信号被认为是一个重要的途径与炎症在动脉粥样硬化斑块的形成,和NF -基因这一目标κB信号通路可能提供一个antiatherogenic配置文件(19]。越来越多的证据显示,对抑制杀人案意义在肿瘤转移和感染通过调节巨噬细胞极化,吞噬作用,促炎因子的分泌,这提出了一个可行的治疗炎性疾病的机会,比如[20.- - - - - -23]。重要的是,据报道,对抑制剂,杀人案acalabrutinib和小野/ gs - 4059等,改变了如抗血小板药物治疗抑制血小板聚集在动脉粥样硬化斑块24]。然而,对巨噬细胞在杀人案的作用尚未阐明的发展,并进一步说明对巨噬细胞在动脉粥样化形成杀人案之间的相关性。
在这里,我们阐明,对可拆卸的杀人案克制ox-LDL-induced NK -κB信号在巨噬细胞和压抑的M1极化但促进了M2巨噬细胞的极化。此外,我们发现氧化应激、线粒体损伤,和ER在ox-LDL-stimulated巨噬细胞也监管压力抑制对。杀人案的食源性小鼠模型,模拟人类动脉粥样化形成被认为是一个关键的方法来了解潜在目标的功能和机制在人类(25]。因此,我们阐明,如ApoE的严重程度- / -小鼠高脂饮食诱导缓解的sh-BTK腺病毒注入,表明对可能代表一个潜在的治疗目标打击杀人案。
2。材料和方法
2.1。临床样本
我们收集临床标本8女性和7个男性,平均年龄 年,从2018年到2020年接受冠状动脉搭桥手术。的冠状动脉斑块和内乳动脉聚集。这项研究是由中山大学伦理委员会批准,孙逸仙纪念医院(sysec - ky - ks2020 - 090)。
2.2。细胞系
Procell RAW264.7巨噬细胞(cl - 0190),这是维持在37°C湿润有限公司5%2孵化器,成长在high-glucose DMEM, 10%胎牛血清和青霉素(100 U /毫升)链霉素(0.1毫克/毫升)。24小时前进一步的实验,细胞会播种在培养皿或6-well盘子26,27]。
2.3。小核RNA)和治疗
核是由RiboBio设计和合成,中国。巨噬细胞被播种的浓度 细胞每在6-well盘子。24小时后,添加了巨噬细胞与BTK-siRNA RNAiMAX试剂(13778075,热费希尔科学)。巨噬细胞的转染48小时后收集。ox-LDL(猫。不。yb - 002, Yiyuan生物技术)使用50浓度μ克/毫升(如前所述)(28,29日]。
2.4。PPI网络的建立和基因鉴定中心
GSE70126数据集的原始移动电话数据从NCBI的GEO数据库下载。和生物信息学分析基本上被邱et al。30.]。短暂、字符串和Cytoscape软件被用来构建蛋白质相互作用(PPI)网络和屏幕差异表达基因。MCODE cytoHubba Cytoscape的应用,以及Metascape在线工具,应用(https://metascape.org)[31日,32]。
2.5。中存在
巨噬细胞总RNA隔绝RAW264.7使用RNAiso +(豆类)33,34]。RNA是转化为互补使用PrimeScript RT(豆类)混合。之后,存在实验LightCycler PCR系统(罗氏)UNICONTM SYBR绿色(11198 es08, Yeasen)。所有使用的引物的序列如表所示1。
2.6。免疫印迹和ELISA
免疫印迹试验和ELISA进行本质上所述李et al。35]。不久,RAW264.7巨噬细胞细胞溶解里帕缓冲区获取总蛋白,此外核和胞质提取工具包(CWbiotech)根据制造商的协议。蛋白质与bicinchoninic酸(BCA)量化分析工具(热费希尔科学),通过sds - page分析10%聚丙烯酰胺凝胶。的主要抗体NRF2、组蛋白H3 p-PERK, p-IRE1,对,杀人案p-p65, p-IRF3, DRP1 FIS1,β肌动蛋白(细胞信号技术)。一个增强化学发光(ECL)试剂检测设备(热费希尔科学),和一个成像机器(2200 Pro,柯达)是用来检测蛋白质的乐队。ELISA,上层清液的RAW264.7收集巨噬细胞检测TNF -的浓度α和il - 6 (Neobioscience,中国)36,37]。
2.7。流式细胞术和活性氧检测
M1和M2巨噬细胞极化探测到他们的制造商,分别伊诺和cox - 2。总之,巨噬细胞与不同处理伊诺抗体或cox - 2抗体孵育20分钟。然后,这些细胞被使胰蛋白酶化,用PBS洗净,resuspended PBS。DHE-DA染色工具包(KGAF019凯基生物生物技术)是用于分析ROS的产生所述前(38,39]。流式细胞术(BD FACSVerse)是用于检测M1极化,M2极化,ROS生产(40,41]。
2.8。MitoTracker染色
巨噬细胞是沾MitoTracker红(Beyotime)分析线粒体损伤的变化。巨噬细胞培养在96孔板和孵化30分钟MitoTracker红色。然后,巨噬细胞与DAPI复染色用荧光显微镜观察了10分钟,(LSM 710年,卡尔蔡司)42,43]。
2.9。Immunofluorescent染色和共焦显微镜
immunofluorescent染色的实验和共焦显微镜进行本质上所述方et al。44]。不久,巨噬细胞被播种在共焦菜肴与4%多聚甲醛固定后不同治疗方法。后被山羊血清,RAW264.7巨噬细胞与不同的初级抗体(孵化p65 ATF6, TNF -α和il - 6;细胞信号技术)在一夜之间在4°C。二次抗体(山羊anti-rabbit, Abcam)和DAPI-containing Anti-Fade荧光安装介质(HelixGen有限公司)被用于可视化和共焦显微镜(卡尔蔡司)45]。
2.10。免疫组织化学分析
老鼠心脏的部分与主动脉根部加热2 h,然后用二甲苯脱蜡,用乙醇脱水。)染色工具包(AR1180博士德生物技术有限公司)是使用,所描述的邱et al。30.]。观察的部分鼠标主动脉根部,莱卡生物显微镜采用(46]。
2.11。小鼠动脉粥样硬化模型的建立
鼠标作为模型建立了描述在我们之前的研究28]。简单地说,载脂蛋白e- / -老鼠(男性,8周大,体重20克)与C57BL / 6 j背景从GemPharmatech购买有限公司有限公司所有小鼠饲养在一个特定的无菌环境12 h光/ 12 h黑暗周期的温度 和40 - 55%的相对湿度。ApoE- / -老鼠的饮食含有21% wt / wt饱和脂肪和胆固醇0.2% wt / wt(西方饮食)为12周的建立模型。重组腺病毒的老鼠Btk干扰(sh-BTK腺病毒),单独与sh-NC腺病毒的控制,被GeneChem合成有限公司。西方饮食小鼠尾静脉注射腺病毒的应用。所有动物程序批准的实验室动物福利和中山大学的伦理委员会。
2.12。动脉粥样硬化损伤分析
小鼠麻醉,和老鼠心脏主动脉根部以及整个主动脉是收获。内表面血小板分析,整个主动脉无脂肪组织,固定在4%多聚甲醛一夜之间,是沾油红O 15分钟,用70%乙醇洗净的解决方案。主动脉根横截面分析,老鼠心脏和主动脉根部嵌入式和切成几个部分,其次是与油红O染色溶液如我们之前所述研究[28]。图片是被一个生物显微镜(DM200徕卡)47,48]。油红的百分比的好心人领域,认为动脉粥样硬化病变,这个被ImageJ量化软件。
2.13。统计分析
三个独立的实验。数据进行分析来验证数据正常使用Kolmogorov-Smirnov测试和表达 。一个双边学生的 - - - - - -测试两组之间进行。和单向方差分析(方差分析)和费舍尔最显著差异(LSD)测试中使用三个或以上三组。统计学意义是一个阈值值< 0.05。
3所示。结果
3.1。氧化应激、线粒体损伤和ER应激ox-LDL引发的巨噬细胞
调查的潜在机制ox-LDL加速,我们为不同时期与ox-LDL刺激巨噬细胞。然后我们发现ROS-positive巨噬细胞的数量显著增加ox-LDL治疗后24 h(数字1(一)和1 (b))。此外,细胞核蛋白水平NRF2 4 h和8 h后巨噬细胞增加的刺激ox-LDL(图1 (c))。同时,mitochondria-specific荧光探针(MitoTracker红色),结果表明,ox-LDL诱导巨噬细胞线粒体的结构紊乱,建议一个明显的线粒体损伤(图1 (d))。至于ER应激,我们发现ox-LDL可以诱导活跃和IRE1(图的磷酸化1 (e))。此外,我们的荧光染色结果表明,ATF6蛋白质(绿色)易位到细胞核ox-LDL治疗后在巨噬细胞(图1 (f))。这些3展开蛋白质的活化反应(UPR)激活蛋白质表明ox-LDL引发巨噬细胞ER应激。
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3.2。对氧化应激相关基因是中心,杀人案在Macrophage-Induced ER应激和炎症
评估的潜在基因中心动脉粥样硬化引起巨噬细胞差异表达基因(度)GSE70126数据集。我们发现1125年泡沫细胞巨噬细胞差异表达基因,与nonfoamy巨噬细胞:592是调节,533人表达下调。火山地块(图2(一个)地图(图)和热量2 (b)分别)所示。字符串和Cytoscape软件被用来构建PPI网络,我们获得了19个中心基因通过MCODE应用程序,对有高分(图杀人案2 (c))。此外,通过使用cytoHubba应用程序中,我们建立了中心基因网络核心后分数(图2 (d))。此外,从Metascape数据库功能集群网络表示,对与氧化应激密切相关,杀人案ER应激和炎症(图2 (e))。
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3.3。对可拆卸的杀人案抑制ox-LDL-Induced巨噬细胞的炎症反应
对基因和杀人案探索之间的关系,免疫组织化学染色。高细胞质蛋白质水平对被发现杀人案的主动脉病变区域的患者(数字3(一个)和3 (b))。此外,我们与ox-LDL刺激巨噬细胞不同时期(6、12和24小时对存在杀人案;24和48 h对免疫印迹杀人案;促炎因子ELISA 48小时;荧光染色法和24小时)。的表达水平对调节在杀人案ox-LDL-induced巨噬细胞,包括mRNA和蛋白表达(数字3 (c)和3 (d))。此外,siRNA-mediated抑制巨噬细胞对了杀人案,和ELISA结果表明,对可拆卸的杀人案可以减弱肿瘤坏死因子的细胞因子水平α和il - 6(图3 (e))。的荧光强度与ELISA结果一致,TNF -α和巨噬细胞il - 6在ox-LDL-induced也受制于对(图杀人案的击倒3 (f))。
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3.4。对可拆卸的杀人案镇压ox-LDL-Induced NK -κB信号在巨噬细胞,抑制M1巨噬细胞分化,促进M2极化
如图4(一)p65蛋白的磷酸化水平,一个重要的NK -κB信号中介,明显减少了对。杀人案的击倒此外,我们执行p65蛋白的荧光染色法,结果表明,对可拆卸的杀人案抑制p65核易位的巨噬细胞(图4 (b))。巨噬细胞极化,NF -密切相关κB通路,也决定了流式细胞术。如图4 (c),对可拆卸的杀人案M1巨噬细胞的数量减少,这被认为是一种促炎的类型。相比之下,M2抗炎巨噬细胞显著增加降价造成的对。杀人案此外,伊诺的表达下调,而cox - 2的表达在mRNA水平调节造成的对可拆卸的杀人案(图4 (d))。一致,击倒对显著降低蛋白表达水平的磷酸化IRF3杀人案,这是一个重要的转录因子在M1极化的过程(图4 (e))。
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3.5。对可拆卸的杀人案缓解氧化应激、线粒体损伤和ox-LDL-Induced巨噬细胞ER应激
针对ox-LDL-triggered氧化应激中发挥了重要作用,我们下一个确定的影响对击倒杀人案在氧化应激和线粒体损伤。流式细胞术结果显示,对可拆卸的杀人案显著降低活性氧的产量水平(数字5(一个)和5 (b))。的upregulation NRF2 ox-LDL-stimulated巨噬细胞核酸蛋白质水平对被撞倒了杀人案如图5 (c)。此外,对可拆卸的减毒杀人案巨噬细胞的线粒体损伤,如我们的荧光染色结果(图所示5 (d))。此外,对明显抑制蛋白表达杀人案的击倒DRP1 FIS1,线粒体分裂的两个重要因素(图5 (e))。进一步确定对击倒和ER应激杀人案之间的相关性,我们管理ox-LDL巨噬细胞对不同时期。荧光染色法测定进行了澄清ATF6蛋白的激活,一个ER与压力相关的转录因子。共焦显微镜结果表明ox-LDL-stimulated核易位ATF6减弱了对可拆卸的杀人案(图5 (f))。此外,结果表明,磷酸化水平的活跃和IRE1 si-BTK组显著减少(图5 (g))。
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3.6。sh-BTK腺病毒注射液降低在ApoE病变的进展- / -老鼠
的治疗角色对载脂蛋白e测定血管硬化的杀人案- / -老鼠,这与西方饮食喂养12周。然后,尾静脉注射adenovirus-mediated sh-BTK sh-NC执行。我们发现主动脉内的油红O区域树sh-BTK组明显减弱,这表明sh-BTK腺病毒注入有效减毒的恶化(数据6(一)和6 (b))。始终,他走时染色结果表明,ApoE的坏死核心区域- / -老鼠sh-BTK组下降(数字6 (c)和6 (d))。此外,泡沫细胞的载脂蛋白e的横截面- / -小鼠主动脉沾油红O,结果表明,损伤面积显著减少sh-BTK集团(数字6 (e)和6 (f))。因此,我们的研究结果表明,对减少杀人案的击倒在ApoE的发展- / -老鼠。
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4所示。讨论
是一种进步的慢性炎性疾病共享的一些心血管疾病,带来巨大的健康负担和经济全球49,50]。使用转基因老鼠,我们的研究结果表明,对抑制杀人案的击倒在ApoE的发展- / -老鼠的机制之一是通过释放ox-LDL-induced炎症反应,氧化应激和ER应激M2型巨噬细胞和促进巨噬细胞极化。它是公认的动脉粥样化形成的生化级联是离不开泡沫细胞形成和巨噬细胞的炎症反应51]。ox-LDL,硬化的因素,有助于发展的促进巨噬细胞的炎症反应(52]。一致,我们发现NF -κB信号通路和IRF3 ox-LDL被激活的巨噬细胞。NF -κB被认为是免疫应答调节中央细胞炎症反应(19]。和激活的干扰素调节因子3 (IRF3),下游因素诱导的I型干扰素生产和启动炎症,建议增加ox-LDL-induced M1表型巨噬细胞(53]。炎症和两极分化的巨噬细胞中扮演重要角色。在以前的报告中,我们还发现,动脉粥样硬化病变时可以减轻炎症反应ox-LDL-induced巨噬细胞释放的28]。
然而,如何ox-LDL刺激巨噬细胞的确切机制尚未阐明。单细胞RNA-seq主动脉在小鼠巨噬细胞的炎症巨噬细胞(M1促炎基因丰富)占很大一部分的整体巨噬细胞亚群(54]。在我们目前的研究中,RNA-seq分析已经应用于泡沫细胞巨噬细胞。度和PPIN分析后,我们进行了基因表达的详细比较。对被认为是杀人案中心氧化应激相关基因,在macrophage-induced ER应激和炎症。一致,我们表明,对在杀人案的蛋白质水平组比对照组显著增加,和击倒对显著抑制促炎因子分泌和杀人案p65蛋白的磷酸化水平,表明对积极监管杀人案ox-LDL-stimulated巨噬细胞的炎症反应。因此,这些结果与对作为候选致病基因杀人案,并指出未来的发展方向,治疗,使用药物或基因抑制对。杀人案
前调查人员表示,对积极监管TLR4-mediated杀人案的激活NF -κ在单核细胞的细胞系(B信号通路15,55]。这些数据与我们的研究结果是一致的,对可拆卸的杀人案NF -下降κB在ox-LDL-induced巨噬细胞信号通路的激活。另一项研究报道,对也是有意义的,杀人案在lipopolysaccharide-induced lipopolysaccharide-induced败血症和消极监管规范NF -κB在肥大细胞信号通路56]。这种差异可能是由于不同的细胞类型和刺激。对可能杀人案细胞特定类型的角色。NF -的激活κB信号通路和促炎因子的分泌有一个强大的协会与巨噬细胞极化M1型(57]。因为对积极调节NF -杀人案κB信号通路在我们目前的研究中,对可拆卸的杀人案抑制M1 M2极化巨噬细胞极化和促进验证的流式细胞术分析。磷酸化水平的IRF3降低伴随着M1巨噬细胞少。
之前的研究表明,ER应激和氧化压力非常重要在巨噬细胞极化和促炎因子的分泌58- - - - - -60]。ER应激、氧化应激和炎症反应传感器组合在一起形成了防御网络的细胞对外界刺激的反应8,61年]。相关风险因素,如高脂血症,高血压,肥胖,激活ER应激相关蛋白,如IRE1、活跃,ATF6,加剧了巨噬细胞的炎症反应(62年,63年]。UPR激活和ER应激已经确定在动脉粥样硬化病变。ER应激抑制剂能减轻炎症和降低巨噬细胞il - 6分泌通过抑制ER应激相关PERK-AFT4通路(7]。此外,在发展与氧化应激和线粒体损伤密切相关。抑制巨噬细胞线粒体氧化应激的减毒如老鼠。巨噬细胞的线粒体稳态不平衡和过多的活性氧产量会激活NF -κB信号通路,促进释放促炎的因素如TNF -α和il - 6 (10,64年]。ROS和促炎的因素之间的相互作用也会提高损伤和加重炎症,暗示动脉粥样硬化病变的发病机理(11]。与线粒体与相关人员透露,播出的,呃,有意义一些代谢疾病,包括糖尿病、中风和冠状动脉疾病(65年,66年]。这之间的联系ER和线粒体为许多心血管疾病被认为是一个潜在的目标。我们显示在当前的研究中,对可以减弱ER杀人案的降价压力和线粒体氧化应激。我们的发现先进的理解之间的联系mma和代谢紊乱。
最后,我们曾报道,尾静脉注射ZBTB20击倒腺病毒的载脂蛋白e- / -与西方饮食可以减轻老鼠,表明尾静脉注射腺病毒是一个潜在的方法来治疗心血管疾病(28]。在我们目前的研究中,载脂蛋白e- / -小老鼠注射对腺病毒产生击倒一个杀人案在主动脉病变区域。对可拆卸的杀人案变弱的发展作为老鼠和泡沫细胞的形成,表明对积极调节杀人案的ApoE的发展- / -与西方饮食的老鼠。尽管我们严谨的实验设计,我们的研究有一定的局限性。虽然腺病毒载体最近成为吸引心血管疾病基因治疗的载体由于其转导效率高,直接腺病毒在小鼠体内的分布不能被识别。此外,腺病毒尾静脉注射不能明确证明效应细胞类型。因此,特异性对击倒ApoE杀人案- / -老鼠在未来的研究需要解决。目前的研究表明,对导致的衰减杀人案击倒的氧化应激,线粒体的压力,压力,巨噬细胞和炎症诱导ox-LDL,符合减少活性氧产量水平,减轻线粒体损伤,抑制ATF6核易位,M1巨噬细胞减少,减少促炎细胞因子的分泌。此外,随着西方饮食的ApoE的进展- / -老鼠被静脉注射对击倒杀人案的腺病毒减毒,这表明对抑制剂可能发挥作用在治疗杀人案是一个强大的治疗目标。
总之,我们澄清,对可拆卸的减少了损伤区和减毒杀人案在老鼠的进展,并对积极监管杀人案ox-LDL-induced巨噬细胞的炎症反应通过调节氧化应激、线粒体损伤,ER应激。
数据可用性
所有的数据集都可以从相应的作者。
的利益冲突
没有利益冲突的需要声明的作者。
作者的贡献
Junxiong秋元富和陈Zhiteng co-first作者和贡献同样这项工作。
确认
本研究资金的来源是来自广东省科学技术厅(项目编号2020 b1212060018)和中国国家自然科学基金(项目编号81702618)。