Gasotransmitter公司变弱Bleomycin-Induced通过感应压力颗粒形成的纤维母细胞衰老

文摘

细胞衰老被认为是一种现象在增殖细胞发生了永久性的增长被逮捕。衰老细胞的积累随着时间的推移会变得有害和导致疾病和生理下降。纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)被认为是细胞衰老的重要标志和中介。压力颗粒的形成(SGs)可以通过PAI-1封存,防止衰老,我们之前建议外源性一氧化碳(CO)可以诱导SG大会通过集成的压力反应(ISR)。虽然公司是具有抗炎、抗氧化和抗凋亡特性,无论是对antisenescent效果仍不明确。这里,解决CO-induced SGs是否能防止细胞衰老,我们第一次治疗肺成纤维细胞和博来霉素(BLM)建立DNA损害细胞衰老,并观察到显著增加几个通过SA -衰老的标志β加染色法、免疫荧光、存在和免疫印迹分析。然而,预处理和后处理的公司可以明显减弱这些衰老表型。根据我们的免疫荧光结果,CO-induced SGs可以抑制PAI-1 BLM-induced细胞衰老通过封存,当它被废除cotreatment后ISR抑制剂(ISRIB)由于抑制SG组装。总体而言,我们的研究结果提出了一个新颖的CO的作用抑制bleomycin-induced肺纤维母细胞衰老通过SGs的组装。

1。介绍

细胞衰老是一个永久的过程细胞周期阻滞,以应对各种生理和环境压力,包括辐射(电离和紫外线),多个抗癌药物(博来霉素和依托泊苷),氧化应激(1]。几项研究已经报道,衰老细胞的积累组织具有积极和消极的后果。衰老细胞的积极作用包括抑制肿瘤、肌肉再生,伤口愈合和皮肤在年轻的生物。相反,衰老细胞的不利影响被观察到的与年龄相关的条件,包括癌症、心血管疾病、神经退化,糖尿病,sarcopenia,老年人和免疫功能下降2- - - - - -4]。衰老细胞通常出现夷为平地,放大并显示增加细胞质粒度(1]。此外,衰老细胞还显示其他几个区别增殖细胞。这些差异包括senescence-associated的增加β牛乳糖(SA -β加)活动,磷酸化H2A X(组蛋白家族成员γ-H2AX)焦点,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKIs),如p21^CIP1和p16^INK4a,senescence-associated分泌表型(SASP)由生长激素,促炎细胞因子,趋化因子,血管生成因子,细胞外基质重塑蛋白酶(5,6]。最近的观察支持丝氨酸蛋白酶抑制剂的分泌增加纤溶酶原激活物抑制剂1 (PAI-1) SASP的组件,可以加速衰老的老鼠,也不仅是一种标记,但细胞衰老的关键中介(7]。此外,senescence-inducing信号如DNA损伤反应(DDR)和氧化应激通常提高肿瘤抑制基因p53的激活,并触发PAI-1干预细胞周期蛋白的表达D1-dependent Rb导致不可逆的磷酸化细胞周期阻滞(8]。

由于细胞衰老的作用在神经退化等疾病,癌症,和老龄化带来的纤维化,据报道是一个有吸引力的治疗目标。主要有两种策略,根据当前发展(9]。第一种方法侧重于确定化合物能具体地诱导衰老细胞死亡,并称为senolytics。鉴于衰老细胞抗凋亡的机制参与这种阻力是senolytics的优先目标。第二种方法是旨在减少SASP的负面影响。雷帕霉素、白藜芦醇和二甲双胍已被证明有效降低SASP的表达通过抑制NF -κB和mTOR信号通路(9,10]。除了这些策略,更多的最近的研究表明,硫化氢(H₂年代)和一氧化氮(NO),两种gasotransmitters,可以分别延迟nicotinamide-induced过早衰老和氧化应激通过减少活性氧的生产和上皮细胞衰老增强SIRT1的活动(11,12]。然而,目前尚不清楚是否一氧化碳(CO),另一个gasotransmitter,可以保护细胞免受压力诱导过早衰老。

公司从内部合成的血红素加氧酶(HO),可引起各种情况下(HO-1)或者持续表达的几个器官(HO-2) [13]。应用外源性CO的低浓度或诱导的内源性CO HO-1激活可以展览表示细胞和tissue-protective效应在不同细胞和组织损伤的模型包括抗炎、抗氧化、抗凋亡作用[14]。我们的许多研究已经证明,长期低剂量治疗公司可以保护各种病理条件,包括肝缺血/再灌注损伤(15),急性肺损伤(16),脓毒症(17),阿尔茨海默病(18],acetaminophen-induced肝损伤(19]。累积的研究报道,公司可以生成低水平的线粒体活性氧(mtROS)通过抑制细胞色素c氧化酶,进而调节综合应激反应(ISR) (20.,21]。最近,我们也证明了低水平的mtROS由公司可以专门诱导蛋白激酶类似内质网激酶(活跃)/真核翻译起始因子2 (eIF2α)信号通路和调节sestrin 2 (SESN2) [22),成纤维细胞生长因子21 (FGF21) [23),和帕金19]表达促进氧化还原内稳态,提高细胞存活率。

为了应对不同的环境压力,包括热、hyperosmolarity,真核细胞和氧化压力,暂时关闭控制能量消耗的蛋白质合成应激损伤的修复24]。的主要机制之一是压力的形成颗粒(SG)在细胞质中,逮捕和nonmembrane-bounded SGs mrna和一些有害蛋白质保护细胞免受细胞凋亡(24,25]。SG生源论被认为是守恒的应激反应,可以由寡聚化的Ras GTPase-activating此种蛋白1 (G3BP1)和聚合的rna结合蛋白,包括T细胞胞浆内抗原(TIA-1)和TIA1-related蛋白质(裂缝)26]。累积的证据中,SGs的组装可以通过最小化能量消耗,保护细胞免受细胞凋亡控制proteostasis ribostasis,改善细胞生存破坏条件下(27]。此外,SG的形成可以抑制细胞衰老通过封存PAI-1 SGs和随后提高了细胞周期蛋白D1的途径将细胞周期阻滞和延迟衰老状态28]。有趣的是,我们最近的研究已经清楚地表明,外生公司可以诱导SGs通过感应ISR的形成,特别是通过PERK-eIF2α信号通路(29日]。然而,CO-induced SGs能否防止应激过早衰老仍不明确。

在这项研究中,构建DNA损害衰老,我们对待人类和小鼠成纤维细胞和博来霉素(BLM)会导致染色体不稳定,我们发现管理CO-releasing分子(CORM-A1)和外源性CO气体可以有效地抑制细胞衰老,和SGs的感应可能没收PAI-1恢复改善细胞周期阻滞细胞周期蛋白D1信号通路。此外,我们表明,ISR抑制剂(ISRIB)可以废除有限的保护作用BLM-induced过早衰老通过抑制SGs的形成和增强PAI-1的分泌。我们的数据显示一个新颖的机制公司可以防止DNA damage-mediated通过诱导细胞衰老SG PAI-1组装和封存,在细胞质中,延迟细胞衰老的过程。

2。材料和方法

2.1。试剂和化学物质

CO-releasing molecular-A1 (CORM-A1) thapsigargin (Tg), PAI-1抑制剂(TM5441)和ISR抑制剂(ISRIB)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。博来霉素(BLM)购买从MedChemExpress LLC(多国评价,蒙茅斯结,新泽西)。

2.2。细胞培养

人类高加索胎儿肺纤维母细胞(WI-38细胞)的最低基本培养基培养(MEM、热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国有10%的胎牛血清(美国的边后卫,BI)和1% penicillin-streptomycin(美国Gibco)解决方案在37°C湿润孵化器有限公司为5%₂。我们主要分离小鼠胚胎成纤维细胞(mef)从女性怀孕8周C57BL / 6小鼠,在DMEM培养(Gibco,宏伟的岛,纽约)中有10%胎牛血清,1% penicillin-streptomycin溶液,1% MEM不必要的氨基酸溶液(N1250, Solarbio,北京)。

2.3。转染的siRNAs

张小核RNA)对人类PA (siPAI-1, sc - 36179)和消极控制核(scRNA, sc - 37007)从圣克鲁斯生物技术、购买Inc .(圣克鲁斯、钙、美国)。WI-38细胞被播种在6-well板的浓度 每口井的细胞,细胞转染siPAI-1和scRNA,分别利用Lipofectamine 2000(美国卡尔斯巴德英杰公司)按照制造商的协议。总之,稀释100 pmol siRNA低聚物在250毫升Opti-MEM(美国Gibco)没有轻轻地血清和混合。稀释5毫升Lipofectamine 2000 250毫升Opti-MEM没有血清和混合轻轻在室温下为5分钟。5分钟后孵化,结合稀释低聚物和稀释Lipofectamine 2000。混合轻轻在室温下和孵化20分钟。把500毫升oligomer-Lipofectamine 2000复合物对每个包含细胞和介质。混合轻轻地来回摇摆的板。36小时转染后细胞另外对待BLM 96 h。然后,对SA -收集细胞β加染色、存在和免疫印迹分析。

2.4。RNA分离和定量实时聚合酶链反应(存在)

总RNA从WI-38分离细胞和mef利用试剂盒试剂(豆类,大津,日本),根据制造商的指示。总之,2μ克总RNA用于生成cDNA使用'脚本™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类,大津,日本)。合成互补dna进行pcr扩增。执行定量实时PCR(存在),合成cDNA放大了结核病绿色预混料交货Taq™II(豆类,大津,日本)Bio-Rad只连接™实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室)。以下引物是人类GAPDH (5 - - - - - -CAA TGA CCC CTT猫TGA有条件现金援助颈- 3 ,反向5 - - - - - -AGC ATC GCC CCA CTT手枪条t - 3 ),人类p21 (5 - - - - - -注册会计师TGG AAC TTC广汽TTT GTC a - 3 ,反向5 - - - - - -GCA CAA GGG TAC亚美大陆煤层气有限公司ACA GTG-3 ),人类白介素(5 - - - - - -行动CAC CTC TTC AGA ACG AAT TG-3 ,反向5 - - - - - -CCA TCT TTG棉酚GGT柠檬酸GGT TG-3 ),人类肿瘤坏死因子-α(前5 - - - - - -甘氨胆酸GCT CTT TGG AGT手枪CG-3 ,反向5 - - - - - -GTT TGC TAC AAC ATG GGC TAC AG-3 ),人类il - 1β(前5 - - - - - -TTA CAG TGG CAA TGA GGA TGA颈- 3 ,反向5 - - - - - -GTC GGA手枪CTG GAT-3 TCG标签 ),人类PAI-1 (5 - - - - - -TGA TGG CTC AGA CCA ACA AAG-3 ,反向5 - - - - - -CAG CAA TGA ACA TGC TGA GG-3 ),鼠标GAPDH (5 - - - - - -GGG亚美大陆煤层气有限公司CCC ATC ACC ATC条t - 3 ,反向5 - - - - - -CGG有条件现金援助CAC CCC攻击力TG-3 ),鼠标p21 (5 - - - - - -GTG GCC TTG TCG CTG TCT条t - 3 ,反向5 - - - - - -GCG GGA GTG ATA棉酚ATC TG-3总部 ),小鼠il - 6(前5 - - - - - -CCA GAG ATA CAA AGA AAT手枪GG-4 ,反向5 - - - - - -行动CCA棉酚广汽CAG gg AAA条t - 3 ),小鼠肿瘤坏死因子-α(前5 - - - - - -AGA CCC柠檬酸CAC柠檬酸手枪猫颈总部 ,反向5 - - - - - -TTG CTA注册会计师(CGT GGG CTA CA-3 ),和鼠标il - 1β(前5 - - - - - -TCG CTC gg GTC ACA AGA AA-3 ,反向5 - - - - - -ATC AGA GGC亚美大陆煤层气有限公司GAG棉酚ACA颈- 3 )。

2.5。免疫印迹

细胞溶解产物是准备使用蛋白质提取工具包(Solarbio,北京)含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。溶菌产物的总蛋白浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(Solarbio,北京)。蛋白质被解决通过sds - page,转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(微孔,达姆施塔特,德国),并探讨了适当的稀释的抗体:细胞周期蛋白D1(1: 1000年,2922年代,细胞信号),核纤层蛋白A / C (sc - 6215 1: 1000年,Santa Cruz),叔(1:500年,abs136649 Absin)β肌动蛋白(1:1000,4967年代,细胞信号)。然后,房间里的膜与二次抗体孵化温度为40分钟。抗体绑定与ECL化学发光系统可视化(通用电气医疗集团生物科技,小都,英国),和化学发光信号读取Bio-Rad ChemiDoc XRS + (Bio-Rad实验室、大力神、CA)。乐队的相对密度进行了分析通过使用ImageJ2x软件(美国国立卫生研究院的贝塞斯达,美国)。

2.6。核和胞质分数

检查周期蛋白D1的核易位,WI-38培养细胞的核和胞质蛋白分离核/胞质分数工具包(美国BioVision)根据制造商的协议。总之,收获细胞增加了100μl细胞溶质的萃取缓冲区(CEB)联系德勤,蛋白酶抑制剂。冰旋涡和10分钟后孵化,提取离心机在16000年5分钟在4°C和上层清液立即被删除从核分离细胞质分数。细胞核托盘然后添加50μl细胞核提取缓冲(内),涡流,并设置在冰上每10分钟,总共40分钟。在16000年使离心后10分钟在4°C,上层清液核提取存储在-80°C,以供将来使用。

2.7。SA -β加染色

观察衰老细胞,WI-38 MEF细胞治疗和博来霉素构建DNA损害细胞过早衰老。然后,senescence-associated——(SA)β牛乳糖(加)染色进行了利用细胞衰老细胞组织化学染色工具包(σ,CS0030)根据制造商的协议。肺组织染色,左肺组织的一部分固定在室温下2 h,解决方案包含2%甲醛和0.2%戊二醛在PBS,并与PBS洗了三次。然后,一夜之间,肺组织被孵化在37°C(没有有限公司₂在N)染色溶液含有半乳糖苷,N-dimethylformamide (pH值6.0)。

2.8。免疫荧光

观察SGs的形成和PAI-1和封存γ-H2AX疫源地,镀WI-38细胞4 Lab-Tek有房间的盖玻片(Nunc,热科学,沃尔瑟姆,MA)和使用CORM-A1 (40μ米)6 h政府25紧随其后μg / ml博来霉素96 h构建DNA损害细胞过早衰老。然后,细胞被洗1×PBS,固定为4% ( )在PBS多聚甲醛在室温下15分钟,和permeabilized 0.1% ( )在PBS Triton x - 100 5分钟。然后,细胞被洗了三次在孵化前能与PBS 2 h与初级抗体室温(ab140595 anti-TIA1, 1: 500年,Abcam;anti-G3BP1 1: 200年,sc - 365338,圣克鲁斯;anti-PAI-1 1: 200年,sc - 5297,圣克鲁斯;和反γab81299 -H2AX, 1: 200年,Abcam)稀释1% ( )BSA在PBS。细胞被洗进一步三次1×PBS孵化前1 h和二级fluorophore-coupled抗体(Alexa萤石594山羊anti-rabbit免疫球蛋白g, 1: 500年,表达载体和Alexa萤石488兔子anti-mouse免疫球蛋白g, 1: 400年,表达载体),分别。二次抗体稀释在1% ( )BSA在1×PBS。孵化后,细胞被洗了三次1×PBS和奥林巴斯FV1000共焦显微镜成像(奥林巴斯、东京、日本)。从免疫荧光图像进行量化计算细胞与TIA1 G3BP1与SGs /细胞总数在随机选择的字段中。每个字段包含至少30细胞,三张图片/条件进行了分析。

2.9。测量PAI-1和几个SASP分泌物

WI-38细胞使用40μM CORM-A1 6 h政府25紧随其后μ96 h g / ml。细胞衰老过程中,WI-38细胞posttreated 40μM CORM-A1 6 h每两天。为期四天的潜伏期后,培养上清液收集,PAI-1和几个SASPs的浓度,包括il - 6、TNF -α,il - 1β是衡量人类PAI-1 (DuoSet ELISA DY9387-05, BD生物科学),人类il - 6 (Cusabio生物技术,武汉,中国),人类肿瘤坏死因子-α(Cusabio生物技术,武汉,中国),人类il - 1β(Cusabio生物技术、武汉、中国)酶联免疫试剂盒根据制造商的指示。

2.10。统计数据

进行统计比较,所有的值被表示为 。统计所有实验群体之间的差异是由单向方差分析应用图基的事后考验,和所有由GraphPad棱镜统计分析评估软件5.03版本(CA)圣地亚哥。团体之间的显著变化被认为是概率的值 。

3所示。结果

3.1。公司在人类和小鼠成纤维细胞抑制Bleomycin-Induced细胞衰老

博来霉素,一种广泛使用的抗肿瘤药,是众所周知的副作用在感应严重的间质性肺纤维化(IPF)。由于其结合铁减少过氧化物分子氧和羟基自由基,博来霉素诱导的DNA损伤,进一步会导致单-和双链断裂(30.]。越来越多的研究表明bleomycin-mediated肺纤维化主要是通过激活肺上皮细胞和纤维母细胞衰老引起的DNA损伤反应(DDR) [30.,31日]。确定外生公司施加的抑制作用在bleomycin-induced纤维母细胞衰老,我们首先检查CO-releasing的细胞毒性分子A1 (CORM-A1)在人类胎儿肺纤维母细胞,WI-38细胞与不同浓度(0,10、20、40、80μ米)6 h。正如我们所料,低剂量CORM-A1显示WI-38细胞(图上没有毒性1(一))。然后,细胞使用CORM-A1剂量依赖性的方式(0、20、40、80μ米)6 h博来霉素管理(25紧随其后μ96 h g / ml)。在博来霉素的挑战,细胞与CORM-A1 posttreated 6小时每两天。为期四天的潜伏期后,我们发现,博来霉素单独的数量显著增加细胞阳性p21的表达(图1 (b))和几个SASPs,包括il - 6、TNF -α,il - 1β(数据1 (c)- - - - - -1 (e))。然而,预处理和后处理CORM-A1可以显著降低的水平p21和博来霉素SASPs刺激,表明CORM-A1可能拥有antisenescent影响bleomycin-induced过早衰老。作为一个消极的控制,在此,我们对细胞不活跃CORM-A1 (iCORM-A1)无法释放CO和发现iCORM-A1没有干涉p21和博来霉素(SASP水平数据1 (b)- - - - - -1 (e))。考虑到40μM CORM-A1显示优化减少p21和SASP的水平,在接下来的研究中,我们选择了40μ适当的剂量治疗细胞。

进一步评估antisenescent CORM-A1效果,我们对待WI-38细胞(图1)和初级鼠胚胎成纤维细胞(mef)(图2)CORM-A1博来霉素和发现的刺激增强细胞衰老的标志,包括senescence-associated的百分比(SA)β-gal-positive细胞(数据1 (f)和2 (b)),γ-H2AX焦点(图1 (g)和2 (c)),p21 mRNA的表达(图2 (d)),il - 6(图2 (e))、肿瘤坏死因子-α(图2 (f)),il - 1β(图2 (g)),都大大降低了。由于基因p53、p21是一个著名的目标,哪些细胞衰老过程中起着至关重要的作用[1,5,6),我们接下来检查WI-38细胞p53、p21蛋白水平。符合规定的结果衰老成绩单,CORM-A1的预处理可以明显降低蛋白质p53、p21水平博来霉素(数据的挑战S2A-S2C)。进一步研究外生CO气体是否也可以防止细胞衰老,我们下一个治疗WI-38细胞250 ppm CO气体6 h每两天博来霉素(25的存在与否μg /毫升96 h。我们的研究结果表明,外生CO气体可以显著抑制相应的博来霉素引起的衰老标记(图S1)。根据这些结果,我们证实了低剂量管理CORM-A1和CO气体可以有效防止bleomycin-induced过早衰老。

3.2。PAI-1参与Bleomycin-Induced WI-38细胞过早衰老

纤溶酶原激活物抑制剂1 (PAI-1)是一种组织类型的主要抑制剂和urokinase-type纤溶酶原激活物物,可以抑制纤溶酶原转化为胞浆素物的转换,和在纤维发生中起着重要的作用32]。积累的证据表明,PAI-1衰老细胞表达显著增加,这可能是不仅一个标记,而且细胞衰老的一个重要中介和生物的衰老7]。确定PAI-1 bleomycin-incubated细胞衰老至关重要,我们首先检查PAI-1的mRNA表达WI-38细胞。我们的研究结果表明,博来霉素可以诱导显著增强PAI-1(数字3(一个)和S2D)。接下来,评估是否增加PAI-1表达参与了bleomycin-induced过早衰老,我们反对PAI-1转染细胞与核(数字3 (b)和S2D博来霉素),然后细胞被刺激。我们发现,在博来霉素的政府,沉默PAI-1可以大大减少衰老的标志,包括SA -的百分比β加染色细胞(图3 (c))和p21的表达(数字3 (d)和S2D),p53(图S2D),il - 6(图3 (e))、肿瘤坏死因子-α(图3 (f)),il - 1β(图3 (g))与细胞转染与争夺RNA (scRNA)。此外,PAI-1抑制剂,小分子TM5441 [33),也表现出显著的抑制影响bleomycin-induced细胞衰老。我们的数据表明,治疗TM5441 (10μ博来霉素(25米)μg /毫升)可以显著减少SA -β-gal-positive细胞(图3 (h)几个SASPs(的)和mRNA表达数据3(我)- - - - - -3(左))。这些数据有力地证明了PAI-1 bleomycin-induced过早衰老中发挥了关键作用,以及抑制PAI-1能有效地改善衰老的过程。

3.3。CO-Induced SGs参与减少Bleomycin-Induced衰老PAI-1封存

此前的一项研究表明,连续轻度氧化应激引起的SGs的装配的数量可以减少衰老细胞通过封存PAI-1随后激活细胞周期蛋白D1-dependent信号通路来维持增殖状态(28]。我们最近的研究报告说,低剂量的外源性公司可以刺激SG PERK-eIF2选择性感应的形成α信号通路,综合应激反应的一个分支(ISR) (29日]。根据这些报告,我们假设的antisenescent效果有限公司可能由SG的形成。这里,我们首次确认的有益作用对SG公司大会通过治疗WI-38细胞与不同浓度的CORM-A1 (0、20、40、80μ米)6 h。应用免疫荧光检查通过应用anti-TIA-1 SGs和anti-G3BP1抗体。根据我们的结果,40岁μ米和80μM CORM-A1(图4(一))可以显著提高装配TIA-1 G3BP-1-positive SGs在细胞质中,和iCORM-A1透露SG大会(图上没有好处4(一)),再次表明CORM-A1施加一个对SG形成诱导的影响。在进一步的研究中,我们试图检查公司是否可以刺激PAI-1的封存到SGs在博来霉素的刺激。正如我们所料,增加数量的SGs CORM-A1能有效地引起没收PAI-1通过检测coaggregation TIA-1和PAI-1(图4 (b))。同时,我们用ELISA测定评价PAI-1的分泌。细胞仅博来霉素治疗显著增加PAI-1的分泌,而CORM-A1管理可以大大减毒的PAI-1水平培养中等(图4 (c))。定义是否减少分泌PAI-1 PAI-1与转录相关,我们下一个评估PAI-1的mRNA水平,我们的数据表明,CORM-A1能够稍微减少记录(图4 (d)),这表明PAI-1的分泌受CORM-A1主要是产生感应的SGs PAI-1的差别,而不是对这些基因的转录。据报道,PAI-1分泌与衰老的发生通过抑制细胞周期蛋白D1核易位和hypophosphorylation Rb (34]。检查在细胞核中细胞周期蛋白D1的水平,我们孤立从WI-38细胞胞质及核分数,发现水平的细胞周期蛋白D1在bleomycin-treated细胞显著减少,而在细胞质的分数显著增加(图4 (e))。此外,CORM-A1可以积极调节细胞周期蛋白D1的核转位(图4 (e)),这是与Rb的增加磷酸化(图有关4 (f))。此外,我们还注意到,SASP的分泌物,包括白介素(图4 (g))、肿瘤坏死因子-α(图4 (h)),il - 1β(图4(我)博来霉素引起的),在CORM-A1管理极大地降低了。PAI-1分泌的差别我们的研究结果表明,CO-mediated对这些相关的SG的形成,从而提高细胞周期蛋白D1的激活和hyperphosphorylation Rb推迟衰老的过程和SASP的分泌。

3.4。ISRIB废除CO-Induced SG组装和恢复Bleomycin-Mediated细胞衰老

根据我们最近的研究中,CO-induced SG组装依赖ISR信号通路,和ISR抑制剂,ISRIB,可以减少形成CORM2和SGs的CO气体(29日]。报告来证实这些结果,我们首先cotreated WI-38细胞与CORM-A1 ISRIB 6 h和观察到ISRIB可以显著抑制SGs的形成通过可视化coaggregation TIA-1和G3BP1细胞质(图5(一个))。接下来,分析是否抑制ISRIB SGs的负调控CORM-A1 antisenescent效应,我们接下来进行预处理和后处理的CORM-A1 WI-38细胞有或没有ISRIB 6 h其次是管理博来霉素96 h。为期四天的潜伏期后,我们检查SA -的百分比β-gal-positive细胞(图5 (b))的数量γ每个细胞(图-H2AX疫源地5 (c))。在bleomycin-induced衰老细胞,增强活动的SA -β加和γCORM-A1 -H2AX病灶显著下降,这是逆转的cotreatment ISRIB(数字5 (b)和5 (c))。此外,我们还注意到,ISRIB强烈抑制封存PAI-1 CO-induced SGs(图5 (d)),因此,在PAI-1 CORM-A1分泌的抑制作用是彻底废除(图5(我))。接下来,我们还检查了p21 mRNA的表达(图5 (e)),几个SASPs(数字5 (f)- - - - - -5 (h)),和p53蛋白水平(图S2Ep21)和(图S2E)。ISRIB我们预期,政府可能强劲耗尽的差别CORM-A1的抑制作用对这些基因p53、p21,和SASP表达式。此外,ISRIB也废除了分泌的抑制作用SASP(数字5(我)- - - - - -5(左))。

端粒缩短是细胞衰老的一个重要标志1,博来霉素诱导报道端粒缩短和细胞衰老引起肺纤维化的发展(35]。此外,一些研究已经证明端粒酶是一种核糖核蛋白,包括端粒酶逆转录酶(叔)和端粒酶RNA (TERC) [36,37]。针对叔的端粒酶抑制诱导细胞衰老,端粒的缩短,DNA损伤(38]。基于这些研究,来验证是否外生SGs公司可以通过感应调节端粒缩短,我们下一个叔的蛋白质水平(图检查S2E)。我们的研究结果表明,bleomycin-mediated细胞衰老可以干扰蛋白质水平的叔,和叔CORM-A1可以显著逆转的变化。然而,ISRIB cotreatment非常妥协CORM-A1引起的叔的增强。这些结果表明,外生公司可能上调叔表情控制端粒缩短,并可能与SGs的形成有关,而在进一步的研究中应当明确详细的分子机制。

综上所述,我们的数据清楚地表明,ISRIB可能干扰antisenescent CO对bleomycin-induced细胞衰老的影响通过减少SG PAI-1和影响端粒缩短的组装和封存。

4所示。讨论

细胞衰老可以诱发有益和有害的结果在一个上下文相关的方式(4,39),这些对立的影响由衰老细胞SASP upregulation强烈相关,包括生长因子、细胞因子和细胞外基质金属蛋白酶(40]。积累证据支持,PAI-1 SASP的一员,是一个关键的标志与衰老和体内病理相关细胞衰老,如代谢综合征,慢性肾脏疾病,multiorgan纤维化(7,41]。此前的一项研究表明,SGs的形成引起的持续温和压力可以防止复制衰老促进PAI-1本地化到SGs,可增加细胞周期蛋白D1的核易位推迟复制衰老的过程(28]。最近,我们已经证明,公司拥有对SG形成有益的影响通过感应ISR (29日]。根据这些报告和我们的研究结果,在此,我们首次展示了SGs的大会由公司可以没收PAI-1,保护细胞对抗bleomycin-induced过早衰老。

在这项研究中,我们对待人类二倍体成纤维细胞WI-38主要细胞和小鼠胚胎成纤维细胞和博来霉素建立DNA损害过早衰老。博来霉素,一个混合糖肽抗肿瘤药物,被广泛用于治疗鳞状细胞癌、睾丸癌、淋巴肉芽肿和非霍奇金淋巴瘤(42]。博来霉素也最有毒的抗肿瘤的药物诱导肺纤维化,由于反应性增生,上皮细胞损伤epithelial-mesenchymal过渡,分化成纤维细胞myofibroblasts,基底膜和肺泡上皮细胞损伤(43]。除此之外,越来越多的证据表明,博来霉素也可以诱导细胞凋亡,在肺nonepithelial细胞衰老,如肺成纤维细胞,通过氧化应激单一,在DNA双链断裂(30.]。改善这些副作用在正常细胞,在这里,我们发现外生管理有限公司透露一个强大的antisenescent影响bleomycin-mediated过早衰老。我们的研究结果表明,低剂量管理CORM-A1和CO气体可以显著减少衰老的多个特征,包括SA -的百分比β-gal-positive细胞,DNA有关γ-H2AX疫源地,细胞周期arrest-associated蛋白质p53、p21和CDK抑制剂,以及几个SASPs(数字1和2和S1和S2)。验证最优浓度CORM-A1,我们首先进行预处理WI-38细胞CORM-A1剂量依赖性的方式,发现40μM CORM-A1显示最有效地抑制bleomycin-induced p21和SASP(数字1 (b)- - - - - -1 (e))。此外,细胞治疗CORM-A1 6 h WI-38没有细胞毒性,MEF细胞。

鉴于PAI-1被定义为一种新型生物标志物和细胞衰老的关键中介(7,33,41),我们下一个评估PAI-1是否与bleomycin-induced肺纤维母细胞衰老。与之前的研究一致,化学治疗剂可以诱导的mRNA表达PAI-1在胶质母细胞瘤细胞株(44),我们也观察到bleomycin-stimulated细胞施加显著增强PAI-1 WI-38细胞(数字3(一个)和S2D)。接下来,我们沉默的表达PAI-1或使用PAI-1抑制剂来解释在bleomycin-induced PAI-1过早衰老的至关重要的作用。我们的数据清楚地表明,细胞转染核与小分子抑制剂对PAI-1或cotreated, TM5441, senescence-associated标记都显著下降。符合之前的研究报告的数据(45),PAI-1可以调节p53下游信号通路,PAI-1基因沉默可能大大下调p53、p21蛋白水平的降低衰老的过程(图S2D)。这些数据再次坚定地表示,PAI-1不仅是中介还bleomycin-induced肺纤维母细胞衰老的治疗目标。

为了应对不同的环境压力,真核细胞将激活防御机制来控制能量消耗为应激损伤的修复,其中一个重要的机制来促进细胞存活是感应的SG组装在细胞质中27]。最近,据报道,细胞衰老可以通过抑制干扰的形成细胞质SGs SG-nucleating蛋白(46]。然而,连续暴露于温带氧化应激可以诱导SG形成、干扰复制衰老的过程通过封存PAI-1然后激活细胞周期蛋白D1的核易位减弱细胞周期阻滞(28]。公司已被证明为小说通过感应的PERK-eIF2 SG形成的诱导物α信号通路,三个ISR分支之一29日]。根据这些报告,在此,我们试图评估公司的antisenescent效应之间的关系及其对SG(图形成有益的影响4)。根据我们的研究结果,在博来霉素的挑战,CORM-A1可能诱发PAI-1的本地化SGs通过聚合TIA-1 PAI-1,也极大地降低了PAI-1的分泌。此外,我们的研究结果显示,CORM-A1 PAI-1转录显示轻微的抑制作用,这不是主要原因,但部分干扰PAI-1的分泌。其次,指出PAI-1的活动,我们评估其下游信号通路,发现CORM-A1可以显著诱导细胞周期蛋白D1的核转位(图4 (d))和hyperphosphorylation Rb(图4 (e)在博来霉素的刺激。这些结果与之前的研究相一致28],SGs的增加形成连续的轻微压力可以没收PAI-1随后激活细胞周期蛋白D1核易位和延迟复制衰老的过程。

综合应激反应(ISR)据报道触发SGs eIF2的磷酸化的形成α和减少43年代翻译始发前复合物的形成。然而,ISR抑制剂(ISRIB)可以阻止eIF2的磷酸化α和SGs的形成47]。进一步评估ISRIB能否废除antisenescent效应影响SG公司的大会,我们cotreated WI-38细胞与CORM-A1 ISRIB其次是博来霉素的挑战和发现ISRIB可以显著废除antisenescent CORM-A1和bleomycin-induced过早衰老(图中恢复过来5)。此外,与先前的研究[28],ISRIB可以显著抑制PAI-1 CO-induced SGs,封存的分泌PAI-1相对地增加。以上数据再次证明了SGs的形成增强了CORM-A1发挥了关键作用的预防bleomycin-induced细胞衰老的控制而不是PAI-1成绩单和建议ISR对CO-mediated很重要antisenescent函数。在此,我们也观察到,博来霉素的管理可以降低叔的蛋白质含量,端粒酶的一个关键组成部分(36,37),这可能与端粒缩短细胞衰老过程中。有趣的是,细胞使用CORM-A1,叔的水平显示重要的高度,虽然ISRIB彻底废除的组合治疗的有益作用CORM-A1叔的表情,表明公司可以调节通过upregulation bleomycin-induced端粒缩短叔,这可能与ISR激活和SG的形成。在进一步的研究中,我们计划确定公司如何提高叔,什么角色CO-induced SGs在叔表达,端粒缩短。

总之,我们的工作强烈表明,gasotransmitter公司可以通过诱导保护肺成纤维细胞免受bleomycin-induced过早衰老SG的形成,促进PAI-1封存到SGs,以及控制端粒缩短。这些影响可以激活细胞周期蛋白D1和Rb hyperphosphorylation推迟细胞衰老的过程(图6)。我们建议利用气态发射机,有限公司,可以是一个新颖的治疗策略,防止bleomycin-mediated细胞衰老及其与发病机制相关的副作用。

缩写

BLM:	博来霉素
CDK1:	细胞周期蛋白依赖性激酶1
有限公司:	一氧化碳
CORM-A1:	CO-releasing molecular-A1
DDR:	DNA损伤反应
eIF2α:	真核翻译起始因子2 a
FGF21:	成纤维细胞生长因子21
G3BP1:	GTPase-activating此种蛋白1
γ-H2AX:	磷酸化H2A组蛋白家族成员X
何:	血红素加氧酶
H2史:	硫化氢
il - 6:	白细胞介素- 6
il - 1β:	Interleukin-1β
ISR:	综合应激反应
ISRIB:	ISR抑制剂
mTOR:	雷帕霉素靶
mtROS:	线粒体活性氧
NF -κB:	核factor-kappa B
没有:	一氧化氮
PAI-1:	纤溶酶原激活物抑制剂
好处:	蛋白激酶激酶类似内质网
SA -β加:	Senescence-associatedβ牛乳糖
SASP:	Senescence-associated分泌表型
SESN2:	调节sestrin 2
SG:	压力颗粒
叔:	端粒酶逆转录酶
Tg:	Thapsigargin
TIA-1:	T细胞胞浆内的抗原
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子α。

数据可用性

所有数据需要评估的结论存在于纸和/或补充材料。可能会被要求提供额外的数据与本文相关的作者。

的利益冲突

所有作者透露,他们没有任何的利益冲突。

作者的贡献

Y.C. L.L.设计实验。Y.C.,F.J., and G.K. have performed most of the experiments with help from Y.C., S.Y., L.L., Q.W., and Q.Z. Data were analyzed by Y.C., L.L., Q.W., and Q.Z. The manuscript was written by Y.C., L.L., and Q.Z.

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(82000074和82000074),教育部门的科研资助项目辽宁省(jyt-dldxjc202005),自然科学基金的辽宁省科学技术部门(20180550388号),大连科技创新基金项目(2020 jj27sn071),和大连青年科技明星研究项目(2020 jj27sn029)。

补充材料

图S1:低剂量CO气体在WI-38细胞改善BLM-induced细胞衰老。(A) WI-38细胞CO气体(250 ppm)处理时间的方式(0、6、12和24 h),执行和MTT试验检测细胞的可行性。WI-38细胞使用CO气体(250 ppm) 6 h BLM的挑战(25紧随其后μg / ml) 48 h。然后,SA -β加染色(B)γ-H2AX焦点(C)被检测到,p21 mRNA的表达(D), il - 6 (E)、肿瘤坏死因子-α(F)和il - 1β(G)被发现存在。定量数据表示为 ( 确定在三个独立的实验)。 , ,和 。图S2:蛋白质含量的p53、p21 PAI-1,叔在不同的组。(a - c)与CORM-A1 WI-38细胞进行预处理(40μ米)6 h BLM的刺激(25紧随其后μ96 h g / ml)。在衰老的过程中,细胞与CORM-A1 posttreated (40μ米)6 h每隔一天。为期四天的潜伏期后,蛋白质p53、p21水平被免疫印迹试验测量。(D) WI-38细胞转染和小干扰rna (scRNA)和核对抗争夺PAI-1 (siPAI-1) 36 h,然后处理BLM (25μ96 h g / ml)。蛋白质水平的p53、p21, PAI-1被免疫印迹试验检测。(情况)WI-38细胞使用CORM-A1 (40μ米)有或没有ISRIB(200海里)6 h随后博来霉素(25的挑战μ96 h g / ml)。然后,蛋白质水平的p53、p21,叔被免疫印迹评估。酒吧图表汇总数据的归一化光密度比率。定量数据表示为 ( 确定在三个独立的实验)。 和 。(补充材料)

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