文摘

宫内不良环境损害胰岛细胞在胎儿的发展和不足β细胞质量和β细胞功能障碍。我们之前报道,Pex14 peroxin蛋白参与过氧化物酶体的生物起源和退化,明显减少胰腺的胎儿宫内生长受限和持续到成年。过氧化物酶体的功能在一个广泛的代谢过程包括脂肪酸氧化,活性氧解毒,抗炎反应。阐明Pex14基因的差别的影响对这些β细胞,Pex14 siRNA INS-1细胞撞倒了。Pex14击倒打扰过氧化物酶病生物起源和脂肪酸代谢和脂质特异表达存储能力,从而增加活性氧水平,削弱了胰岛素的分泌。此外,Pex14击倒调节炎症因子和监管者的内质网压力。脂肪酸的lipotoxicity(包括棕榈酸和亚油酸)βPex14细胞被击倒的加剧,由H表示₂O₂积累和增加程序性细胞死亡。目前的结果证明Pex14的至关重要的作用在维护正常的过氧物酶体功能β细胞生存能力和突出的重要性的解毒功能的酶代谢FAs过剩β细胞。

1。介绍

过氧物酶体是一种细胞器具有多种生理功能,广泛存在于哺乳动物细胞。人类的过氧化物酶体包含超过80种蛋白质,可分为两类。首先是组成型蛋白质,称为peroxins (PEX)相互作用,参与过氧物酶体生物起源、分裂和增殖。第二类包括代谢、氧化和抗氧化酶在哺乳动物(约50),这是维持细胞内稳态的关键和活动(1,2]。过氧化物酶体参与各种代谢途径等β氧化very-long-chain脂肪酸(VLCFAs),α氧化和β氧化的支链脂肪酸(FAs),磷脂合成,活性氧(ROS)新陈代谢,和抗炎功能(3- - - - - -5]。PEX基因突变导致过氧物酶体缺陷生产成熟的过氧化物酶体和损失,导致一群疾病相关的酶称为生物起源疾病(2]。VLCFAs的基本病理机制涉及氧化受损,在细胞质中积累,影响细胞的功能和胚胎发展(6,7]。此外,过氧物酶体可以产生活性氧和活性氮物种(RNS),以及清除ROS / RNS。两个进程之间的不平衡导致氧化应激(OS) (8]。

2型糖尿病(T2D)是一种多因素疾病由遗传和环境因素引起的。功能障碍的β细胞的主要过程是T2D的发病机制(9]。一个重要机制β细胞功能障碍是葡萄糖和FFA有毒action-induced操作系统。操作系统导致葡萄糖耐受不良,抑制胰岛素分泌和活动,促进T2D的发作(10,11]。流行病学研究表明,宫内生长受限(IUGR)增加了成人T2D易感性,由于小岛和畸形β细胞功能障碍(12,13]。在一项研究中,我们使用一只老鼠模型来展示胰腺过氧物酶体因素的异常表达在子宫内(IUGR胎儿营养不良引起的14]。Pex14、过氧物酶体标记蛋白参与了生物起源和退化的过氧化物酶体15),显著降低胎儿胰腺中持续到成年。另一个表达下调的蛋白质是Pex3,积分参与过氧物酶体膜蛋白生物起源直接与Pex16交互和19个,导致过氧物酶体膜蛋白质(PMP)进口(16]。酰coa氧化酶的酶(Acox) 1和17β-hydroxysteroid脱氢酶类型4 (Hsd17b4),病原反应酶在足总β氧化(FAO),表达下调,这是伴随着IUGR胎儿的激活操作系统。因此,我们假设的差别,对这些Pex14损害过氧物酶体生物起源和功能,导致β细胞功能障碍。

在这项研究中,利用核击倒Pex14的表达,我们发现Pex14的差别,对这些基因的诱导β细胞死亡和受损的胰岛素分泌功能通过影响多个蛋白质参与过氧物酶体生物起源,粮农组织,随后ROS清除,导致细胞自噬和细胞凋亡。这些结果的差别表明,对这些Pex14,至少部分,导致IUGR胰腺发育不良的后代。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染

河鼠INS-1细胞系购买类型文化集合中心的中国科学院(中国上海)。1640年细胞培养中含10%胎牛血清和100 U /毫升penicillin-streptomycin和维持在37°C下5%的股份有限公司₂。siRNAs针对老鼠的序列Pex14和消极的控制(NC)如表所示S1。siRNAs转染到INS-1细胞小干扰rna转染试剂使用INTERFERin (Polyplus 409 - 10),根据制造商的手册。在转染后24小时,细胞被孵化与饱和FA棕榈酸(PA)或不饱和FA亚油酸(LA)浓度的30μ米和10μM,分别为24小时。细胞媒体被更改为基底,并为后续实验收集细胞。

2.2。RNA隔离和q-PCR

总RNA提取使用试剂盒试剂(英杰公司)根据制造商的协议。互补脱氧核糖核酸与反转录系统得到(豆类,大连,中国)。q-PCR执行使用SYBR绿色PCR试剂盒(Vazyme Q711-02,南京,中国)7500快速系统(应用生物系统公司)。数据分析使用相对量化(2^{- - - - - -ΔΔCt})方法与β肌动蛋白作为内生控制。引物序列表中列出S1。

2.3。免疫印迹分析

INS-1细胞细胞溶解在SDT缓冲区(4%十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇1毫米,150毫米Tris-HCl,和pH值8.0),和蛋白质含量与BCA量化方法。等量的蛋白质分离12% ( )sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜。膜切成几条,封锁在TBS-Tween-20含有5% ( )脱脂牛奶在室温下2 h,孵化的表示主要抗体(表S2)在一夜之间在4°C。膜然后孵化与二次使用商业增强化学发光检测抗体和可视化工具包(美国微孔)。Gel-Pro分析仪软件用于量化的免疫印迹。

2.4。细胞凋亡分析

小干扰rna转染后,收集细胞的细胞凋亡检测的膜联蛋白V-FITC凋亡工具包(Vazyme,南京,中国)。细胞被洗PBS和resuspended在500年μL具有约束力的缓冲区。随后,5μL的膜联蛋白V-FITC和5μL (propidium碘(PI)被添加到细胞悬液和孵化在黑暗中在室温下15分钟。每组细胞凋亡率的测定采用BD FACSCalibur流式细胞分析仪。

2.5。细胞计数Kit-8化验

细胞生存能力是衡量使用细胞计数kit-8 (CCK8)测定。简单地说,INS-1细胞( 细胞/)被播种到96孔板。在转染后24小时,细胞被孵化CCK8 10%解决方案(Vazyme)在37°C 2 h,直到发生视觉颜色转换。450纳米的吸光度测量使用微型板块分光光度计(美国BioTek乐器,Winooski VT)。

2.6。自噬检测

分析了自噬流量使用Cyto-ID®自噬检测设备(恩佐生命科学,劳动部- 51031 k200)在INS-1细胞。简单地说,治疗后与洛杉矶或PA 2 h,细胞( 细胞/毫升)孵化Cyto-ID绿色检测试剂(1μL /毫升)加入培养基为30分钟37°C和5%的公司₂在黑暗中。图像是用一个尼康倒置显微镜放大200倍。

2.7。细胞活性氧的检测

细胞内活性氧与荧光探针检测到5 - (6)-chloromethyl-2 7-dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA,指标的H₂O₂)。INS-1细胞收获和孵化DCFH-DA (10μ米,30分钟)37°C在黑暗中,根据制造商的协议。荧光定量分析,收集细胞,流式细胞术分析。至少10000事件进行了分析。

2.8。免疫荧光(如果)和尼罗红染色

INS-1细胞与冰冷的4.0%多聚甲醛固定15分钟,然后用0.2% permeabilized Triton x - 100 30分钟。如果染色细胞是由孵化主要抗体(表表示S2在4°C)一夜之间,然后用荧光共轭anti-rabbit标记或anti-mouse免疫球蛋白(分别表达载体,A11029和A11036) 37°C 60分钟,其次是核与DAPI染色。捕获图像与激光扫描共焦显微镜在同一放大,×400。细胞内脂滴与尼罗红染色观察(0.1μ摩尔/毫升)。图像获得的共焦显微镜放大200倍。

2.9。分子生物学胰岛素分泌(GSIS)实验

INS-1细胞孵化Krebs-Ringer缓冲区(KRB 4.7毫米氯化钾、氯化钠115毫米,1.2毫米MgSO₄0.5毫米,不₂阿宝₄,1.5毫米CaCl₂,2.5毫米NaHCO₃,0.1% BSA, pH值7.4)包含2.5更易与葡萄糖/ L(基底分泌)或KRB缓冲区包含20更易与1 h / L葡萄糖(刺激)。中收集的整除与酶联免疫试剂盒测定胰岛素(CUSABIO,中国)根据制造商的协议。

2.10。统计分析

给出的结果 (SD)从至少三个独立的实验。两组之间的差异进行了分析与双尾未配对的学生 - - - - - -测试和单向方差分析被用于比较两个以上的组。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Pex14击倒改变Peroxin INS-1缺乏相关的酶表达和诱导细胞

INS-1细胞转染核Pex14表达的反对Pex14出现减少55%相比,炒siRNA-transfected细胞(数字1(一)和1 (b))。观察si-NC没有减少Pex14表达证实,沉默是特定的。如果染色也证实Pex14下调si-Pex14 INS-1细胞(图1 (c))。Pex14 KD的蛋白表达显著下调Pex3, Pex5 Pex19, Pex11b(图1 (d))。q-PCR化验显示Pex11b的mRNA水平的降低和19日与蛋白质数据一致。的mRNA水平Pex1、Pex7 Pex16没有影响。相比之下,Pex3的mRNA水平和Pex5被Pex14 KD调节与蛋白质数据(图不一致1 (e))。我们推测,mRNA表达增加可能是一个反馈反应蛋白质数量的减少。感兴趣的是发现转录因子调节过氧物酶体增殖,Ppar -γ和它共激活剂Pgc-1αPex14 KD(图后,都减少1 (d))。

3.2。在Pex14 KD细胞脂肪酸代谢

q-PCR试验表明,Pex14 KD导致的mRNA水平不同的变异倾向过氧物酶体粮农组织酶。关于Acox同功酶,Acox1表达下调,Acox3调节,而异质二聚体Acox2是未受影响。的mRNA水平Mfe1也不变,而3-ketoacyl-CoA硫解酶(Acaa1a)降低(图2(一个))。免疫印迹分析表明,Hsd17b4和Abcd3的蛋白表达是调节,而碱palmitoyltransferase-1A (Cpt1a)减少Pex14 KD细胞(图2 (b))。如果染色显示了增强表达Fasn(图2 (c))。尼罗红染色显示Pex14 KD造成轻微增加INS-1细胞中脂滴与si-NC组。在暴露于PA, Pex14 KD导致更高的倾向脂肪堆积而si-NC组(图2 (d))。

3.3。在Pex14 KD细胞活性氧解毒和促炎的因素

免疫印迹分析显示减少氧化剂过氧化氢酶(CAT)的蛋白表达和Sod2 Sod3蛋白质水平的增加。q-PCR试验也表明了Sod2的mRNA水平下降和猫。Prdx5,抗氧化剂本地化在过氧化物酶体和线粒体,在mRNA水平持平(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。我们进一步研究了ROS水平与DCFH-DA Pex14 KD细胞。如图3 (d),Pex14沉默导致边际增加H₂O₂在INS-1细胞。此外,H₂O₂显著增加在暴露在LA Pex14 KD细胞,而洛杉矶暴露显示无显著影响H₂O₂在空白和si-NC细胞。暴露在PA导致空白细胞ROS增加温和与LA暴露组相比,而在Pex14 KD细胞,PA暴露引起不如LA ROS水平增加曝光。

ROS信号级联扮演关键角色的炎性因子和内质网应激(人)。因此,我们调查了OS /在Pex14 KD细胞炎症反应。如图4(一)、肿瘤坏死因子-α和il - 6 mRNA水平显著增强Pex14 KD的文化。Atf6和spliced-Xbp1 mRNA水平也增加(图4(b))。这些观察表明,造成操作系统删除Pex14 upregulation导致的促炎因子和激活人队。

3.4。Pex14 KD对INS-1接触FA后细胞生存能力

CCK8试验表明,Pex14 KD显著降低INS-1细胞生存能力。这种趋势进一步加强了洛杉矶或PA暴露(数字5(一个)和5 (b))。观察一个戏剧性的减少细胞生存能力在空白细胞治疗PA, 48 h后而在空白细胞暴露于洛杉矶,显著减少细胞生存能力直到72年才观察到h。这表明PA的lipotoxicity比洛杉矶,这是符合一个以前的报告10]。

3.5。Pex14 KD对INS-1细胞凋亡和自噬的影响

我们检查了Pex14 KD的影响细胞程序性死亡(包括细胞凋亡和自噬细胞中FAs对待。Pex14 KD引起早期凋亡细胞的数量略有增加(Q2)和晚期凋亡或坏死细胞(第四季度)(图5 (c))。细胞凋亡和坏死的发生率显著增加Pex14 KD细胞暴露于洛杉矶或PA;特别是在PA曝光,凋亡和坏死细胞的数量增加到90%。Pex14 KD调节蛋白表达的proapoptotic因素cleaved-caspase 3(图5 (d))。细胞凋亡测定的结果与细胞生存能力分析的数据是一致的,都表明Pex14 KD加剧了FA-induced lipotoxicityβ细胞,特别是在应对PA曝光。一直,我们表明,PA接触可能会进一步降低Pex14, Abcd3, Acaa1a表达INS-1细胞(图5 (e))。此外,PA诱导凋亡细胞死亡在Pex14 KD细胞比洛杉矶可以解释可检测活性氧含量的减少PA-exposed细胞。

接下来,我们检查了Pex14 KD对自噬的影响。增加LC3b和减少p62表达式表明自噬的激活Pex14 KD细胞(图6(一))。Pex14 KD的自噬空泡检测使用CYTO-ID自噬检测设备。此外,自噬空泡明显增加在与洛杉矶Pex14 KD细胞的治疗。PA暴露也导致了适度增长与空白组相比,自噬空泡。然而,在Pex14 KD细胞,检测自噬空泡的数量减少PA曝光后(数字6 (b)- - - - - -6 (e))。这些结果表明,Pex14 KD可导致同时激活凋亡和自噬细胞死亡。

3.6。Pex14 KD损害胰岛素分泌

我们检查了分子生物学在Pex14 KD INS-1胰岛素分泌细胞。ELISA试验表明Pex14 KD导致INS-1钝化分子胰岛素分泌细胞。如果染色显示减少胰岛素Pex14 KD细胞(数字7(一)和7 (b))。探索机制基础胰岛素分泌受损,我们检查PDX1基因的表达,调节胰岛素分泌。然而,Pex14 KD Pdx1的mRNA水平没有影响(图7 (c))。

4所示。讨论

IUGR T2D易感性和损害葡萄糖耐量增加成人(12,13]。我们以前报道,孕产妇蛋白质营养不良导致的异常表达Pex14胎儿胰腺和FA代谢酶使用IUGR大鼠模型(14]。我们击倒化验使用Pex14 siRNA支持Pex14导致差别的假设对这些程序lipotoxicity在细胞死亡和减少阻力β细胞。

调节细胞过氧化物酶体的数量通过生物起源和退化之间的动态相互作用。Pex14,组件上的对接复杂的酶膜,功能双酶生物转化和降解过程中应对环境变化(17]。在这里,我们表明,Pex14 KD Pex3的表达,使之抑制Pex5, Pex19,膜蛋白插入的所有功能,诱导新创生物起源的过氧化物酶体。先前的报道表明,Pex3枯竭或过氧化物酶病Pex9导致完全丧失功能(16,18,19]。Pex11b细胞蛋白质,引发过氧物酶体部(20.在Pex14 KD)也被下调。Pex11b基因突变可能导致过氧物酶体生物合成障碍(21,22),其过度导致的过氧化物酶体数量增加(23]。Pex14 KD也调节Pex5,胞质受体为基质蛋白对接Pex14 [24]。的差别,对这些基因的转录因子Ppar -γ和Pgc-1α,调节过氧物酶体增殖,可能导致减少peroxins的表达式。peroxins表示,有缺陷的生物起源和差别的对这些部门负责的过氧化物酶体数量减少,虽然精确的分子机制还有待定义。

功能自噬通路发挥核心作用在过氧化物酶体的回收。Pexophagy,过氧化物酶体的选择性降解通过自噬机械、定量监管有关的过氧化物酶体和内稳态的新陈代谢许多基质包括脂质(25,26]。Pex14直接绑定到Pex5在正常情况下,参与过氧物酶体生物转化。它与LC3-II交互,形成自噬体的一个重要因素,营养饥饿条件下,参与过氧化物酶体的退化19]。在海拉细胞减少pexophagy Pex14含量下降27]。相比之下,Pex14 KD INS-1细胞自噬激活。我们推测,活性氧的积累和随后的操作系统导致自噬的激活,这可能是细胞的保护性反应。

饱和和不饱和FAs PA和洛杉矶等引发自噬β细胞,尽管潜在的分子机制有所不同(28- - - - - -30.]。我们的研究结果表明,拉接触INS-1细胞自噬空泡的数量增加。Pex14 KD进一步明显自噬诱导增加了曝光。相比之下,Pex14 KD可检测自噬空泡的数量减少PA接触细胞。先前的研究表明,自噬系统在PA-treated细胞被激活,诱导自噬可能发挥自适应和保护作用在PA-induced细胞死亡31日]。PA的治疗增加Pex14 KD细胞凋亡可能解释的减少无形的自噬空泡的治疗组。

长期接触FAs和积累诱发细胞凋亡β细胞和促进T2D的发病机制(32]。的分子机制可能参与FA-inducedβ细胞凋亡包括ROS生产、内质网应激、触发apoptogenic因素,和脂质积累中间分子(2,3,33]。目前的研究还证实,暴露在饱和或不饱和FA (PA / LA)诱导β细胞凋亡。此外,Pex14 KD减少INS-1细胞抵抗lipotoxicity并造成细胞凋亡。

Pex14 KD特异表达的关键酶的酶参与粮农组织。Acox1/3病原反应酶的粮农组织的第一步。Hsd17b4催化第二步的粮农组织和导致的形成chain-shortened酰coa和乙酰辅酶a [34]。Acaa1a催化过氧化物酶病的最后一步β氧化的直链acyl-CoAs [35]。Abcd3所需的酶是一个膜蛋白脂肪酰coa运输到过氧化物酶体。Fasn中起关键作用的从头合成脂肪酸。Pex14 KD下调Acox1, Hsd17b4 Acaa1a,同时调节Acox3, Abcd3, Fasn。类似的变化观察IUGR胰腺。此外,Pex14 KD Cpt1a的表达减少,病原反应酶长链粮农组织的线粒体,及其不足导致的下降率粮农组织(36]。这些变化可能会导致增加在INS-1细胞脂质积累。鉴于FA代谢的复杂性,通过气相色谱-光谱确定血脂将有助于阐明真正的过氧物酶体功能障碍引起的变化。最近,Baboota等人报道,删除Pex5导致过氧化物酶病粮农组织和线粒体的损伤破坏,从而增加β在胰岛细胞凋亡,减少胰岛素分泌(37]。的差别我们推测,对这些Pex14导致胰岛IUGR胎儿发育不良,仍需要确认体内研究。

过氧化物酶体发挥重要作用在维持细胞氧化还原内稳态(38,39]。Pex14 KD的差别导致对这些过氧化氢酶,这可能导致减少退化H₂O₂。Downregulation Sod2的一个关键线粒体超氧化物自由基的抗氧化剂催化转换H₂O₂,也会导致增加超氧化物自由基(40]。目前的结果表明,活性氧积累Pex14 KDβ细胞是由缺乏功能过氧化物酶体和随后的线粒体的改变。

ROS是关键信号分子,促炎细胞因子的调控有重要作用,和两个相互影响的一个正反馈循环(41- - - - - -43]。肿瘤坏死因子-α在Pex14 KD细胞il - 6和调节。此外,Pex14 KD激活INS-1细胞ER压力和proapoptotic因素。长时间的ER应激引起胰腺β细胞凋亡。因此,诱导促炎因子、ER应激Pex14的差别和随后的细胞凋亡对这些似是而非的解释我们之前发现IUGR的人是在胰腺中特异表达模型(43]。

总的来说,本研究的一个重要发现是INS-1 Pex14起根本作用的差别,对这些细胞的生存能力和抵抗lipotoxicity影响多个基因的表达在过氧物酶体生物起源,粮农组织和活性氧解毒(图8)。然而,限制在这项研究中,大鼠胰岛瘤细胞系,INS-1细胞不能完全模仿主要的表型β细胞体内。和INS-1细胞获得的数据不完全符合的调查获得的数据在IUGR大鼠胰腺,所以其他基因变化的影响胰腺癌发展值得进一步的研究。本研究的另一个限制是,胰岛素分泌减少的机制Pex14 KD细胞仍有待探索。的差别不过,目前的结果表明,对这些Pex14背后,至少在某种程度上,在IUGR胎儿胰腺发育不良。过氧化物酶体的作用的进一步说明β细胞功能可能有助于改善我们的理解T2D,防止这种疾病在成年后。

缩写

Acox:	酰coa氧化酶
辅酶a:	辅酶A
Acaa1:	3-Ketoacyl-CoA硫解酶
Abcd:	ABC转运维
猫:	过氧化氢酶
Cpt1:	肉碱palmitoyltransferase-1
DCFH-DA:	Dichlorodihydrofluorescein二醋酸盐试验
粮农组织:	脂肪酸机会
的边后卫:	胎牛血清
Fasn:	脂肪酸合酶
Hsd17b4:	过氧化物酶病17β-hydroxysteroid脱氢酶类型4
H2O2:	过氧化氢
如果:	免疫荧光
IUGR:	宫内生长受限
Pex:	Peroxin
ROS:	活性氧
Sod:	超氧化物歧化酶
核:	小干扰RNA
T2D:	2型糖尿病
VLCFA:	Very-long-chain脂肪酸。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

没有报告的作者潜在的利益冲突。

作者的贡献

小梅刘和逸生焦是担保人的工作,导致了实验设计,获得资金,和领导写的手稿。张洪波关、郭Yanyan执行大多数的实验包括细胞培养,如果和免疫印迹。朱Liangliang促成了q-PCR实验。所有作者阅读和批准提交的版本。

确认

我们要感谢国际科学编辑(http://www.internationalscienceediting.com)编辑这个手稿。这项工作得到了国家自然科学基金的资助中国(81971400)、杰出的科学基金盛京医院(201707号),辽宁省的自然基金指导计划项目(2019 - zd - 0754),辽宁省高等教育创新人才支持计划(LR2019074)。

补充材料

本文的补充材料可以在网上找到。表S1:引物序列q-PCR和序列的核。表S2:抗体免疫印迹和如果。(补充材料)