文摘

卵巢衰老是指卵巢功能逐渐下降的生理年龄增加,表现为卵巢储备功能下降,体内标记的升高,降低卵母细胞质量。女性生育能力下降和人口老龄化增长,迫在眉睫的是延缓卵巢衰老保持生育能力,提高妇女的生活质量。茶黄素3 3 - - - - - -digallate (TF3)是一种天然生物活性多酚化合物从红茶中提取及其抗氧化性能起着重要的作用在维护人类健康和延缓衰老;然而,TF3对女性生殖和卵巢功能的影响还不清楚。在这里,我们表明,TF3可以保留原始卵泡池,部分恢复发情周期,提高老年小鼠的后代数量。同时,TF3填喂法增加了检索的卵母细胞数量,减少活性氧的水平,增加谷胱甘肽的水平,减少异常率在排卵后的卵母细胞纺锤体的感应。此外,TF3抑制人类颗粒细胞凋亡,提高他们的抗氧化应激能力。高通量测序和small-molecule-targeted药理预测表明,TF3影响多个通路和基因表达水平,主要参与生殖和发育过程。它也会影响细胞功能针对mTOR调节自噬通路,从而延缓卵巢衰老的过程。这项研究表明,TF3可以作为一个潜在的膳食补充剂来保护卵巢功能老化,从而提高老年妇女的生活质量。

1。介绍

卵巢衰老的定义是随着年龄的增长,卵巢功能逐渐下降。女性生育能力通常在30岁以后开始下降,更重要的是35岁后下降。现在女性的生育年龄的一般推迟使生殖衰老共同生育问题[1]。生育率下降的临床表现包括卵巢储备功能下降,女性内分泌激素失调,和不规则的月经周期2),主要是相关的一系列指标差别卵巢功能对这些如增加分泌卵巢衰老炎症物质的微环境,颗粒细胞数量和功能异常,卵母细胞质量下降(3- - - - - -5]。

积累的活性氧(ROS)与器官衰老密切相关(6]。早前的研究表明氧化应激损伤引起的卵巢中过多的活性氧积累导致颗粒细胞功能受损和卵母细胞质量下降,导致卵泡数量和质量以及降低内分泌异常,最终导致卵巢衰老(7]。女性的经历在体外受精胚胎移植(IVF-ET),卵母细胞和颗粒细胞中的活性氧含量明显高于老年患者比年轻患者,与抗氧化剂水平降低(8]。卵泡液中高浓度的活性氧可能与胚胎质量差(9]。这表明,过量的活性氧在老年妇女的卵巢是一个重要因素导致卵巢功能下降和不良妊娠结局。降低ROS水平在卵巢可以发挥关键作用在提高女性卵巢功能和延长女性生育能力。

茶多酚是重要的天然抗氧化化合物来自食物。从红茶发酵提取的茶黄素是一种抗氧化剂类与自然生物活性,主要包括茶黄素(TF1) theaflavin-3-gallate (TF2A) theaflavin-3 - - - - - -没食子酸盐(TF2B),和茶黄素- 3,3 - - - - - -digallate (TF3) [10]。其中四个单体,TF3组件的比例是最高的,最伟大的抗氧化作用[11]。先前的茶多酚的研究集中在绿茶提取物儿茶素(EGCG),这是一种强大的抗氧化剂。EGCG的补充可以抑制过渡从原始卵泡卵泡增长,这对延长卵泡增长是至关重要的阶段,卵母细胞凋亡减少,保护女性生育能力(12]。然而,近年来,它被发现在发酵的红茶茶多酚TF3甚至比EGCG具有更强的抗氧化活性(13]。TF3显示了调节生物体的生物抗氧化功能酶活性系统,消除自由基(11)和防止羟基radical-induced DNA损伤,清除ROS (14]。非酒精性脂肪肝病的小鼠模型和主肝细胞,茶黄素家庭减少炎症反应和肝细胞凋亡减少通过抗氧化途径15]。

在一个双盲、随机对照研究在人类中,口服补充与TF3显著降低炎性因子和氧化应激损伤由于高强度锻炼(16]。其他人建议TF3是一个非竞争性的三磷酸腺苷(ATP)合成酶抑制剂,减少能量代谢通过直接绑定到ATP酶无诱导甚至减少过氧化物生产(17]。当前研究TF3女性生殖系统都集中在一个可能的抗肿瘤能力,和多个研究表明,TF3能保护女性生育能力,选择性地抑制卵巢癌细胞增殖(18,19]。然而,TF3的功能作用在卵巢衰老的规定尚不清楚。

在这项研究中,我们第一次调查的角色TF3补充改善生育和受体在卵巢功能,并进一步研究了TF3卵母细胞质量的影响,胚胎发育潜力,和颗粒细胞功能。此外,TF3潜在的分子机制在调节颗粒细胞功能研究了序列分析和小分子复合蛋白模拟对接。这些结果表明,TF3治疗有前途的多酚化合物,起着重要的作用在保护卵巢功能从老化。

2。材料和方法

2.1。伦理批准

本研究通过科学研究和临床试验伦理委员会的郑州大学第一附属医院。

2.2。动物和实验设计

本研究中使用的所有cd -老鼠从至关重要的购买河(至关重要的河流,北京)和位于河南动物实验中心12 h黑暗/光周期和在室温22 - 25°C。岁9个月大的雌性老鼠被随机分为两组:老TF3填喂法实验(O-TF3)和旧控制(O-Ctrl)。O-TF3组老鼠喂食了TF3 (Biopurify,成都,中国)30毫克/公斤每隔一天,和O-Ctrl组老鼠与同等体积的生理盐水每隔一天;两组人分别治疗90天。

八周大成人cd -雌性老鼠作为年轻的控制(Y-Ctrl)。对于交配测试,8-week-old成年雄性老鼠同居的比例与三组1:2和1周后分别安置。后代的数量统计分析。

2.3。发情周期监测

最后填喂法时期,老鼠的发情周期使用涂片法检查。阴道口被曝光,阴道分泌物收集用小棉签涂在载玻片。样本与95%乙醇固定为5分钟,晒干,与苏木精染色了15分钟,然后用水冲洗5分钟,与95%乙醇脱水3分钟,然后反复冲洗和染色。光学显微镜下观察细胞形态。发情周期监测是基于一项研究[20.]。间情期,有几个萎缩,偶尔有核上皮细胞和角化细胞。在发情前期,上皮细胞明显减少,与更多的嗜碱细胞或细胞失去了能力蒙上了污点。在发情期,几乎所有的无核的角化细胞被染成红色没有白细胞;metestrus期间,有核上皮细胞和白细胞增多。

2.4。在体外卵母细胞的受精和免疫荧光染色

在治疗结束时,小鼠腹腔注射10 IU孕马血清促性腺激素(PMSG;Solarbio,北京);48小时后,小鼠腹腔注射10 IU人体绒毛膜促性腺激素(hCG);Livzon,珠海,中国)。14小时后,老鼠牺牲颈椎脱位,积云卵母细胞复合体(COCs)在输卵管得到扩大和清洗处理介质G-MOPS™+ (Vitrolife Goteborg,瑞典)预热在37°C,然后转移到G-IVF™+中受精前(Vitrolife)文化。成年男性的精子获能精子提前了1 h G-IVF™+滴,和生产精子被添加到液滴包含COCs受精。受精的卵母细胞受精后被移除4 h,并一直在努力培养并观察™+ (Vitrolife)。培养基是改变g2™+ (Vitrolife)滴在受精后第三天继续培养到囊胚发育。使用下面的公式:

COCs用于免疫荧光染色和透明质酸酶消化(Vitrolife)去除颗粒细胞在卵母细胞和颗粒细胞后的后续实验净化。ROS (Beyotime、上海、中国),JC1 (Beyotime)及谷胱甘肽(GSH)检测试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)包被用于染色根据制造商的协议。卵母细胞被染色的30分钟37°C,筛选了三次使用磷酸盐(PBS)和0.1% Triton x - 100 (PBST),然后使用共焦激光扫描显微镜成像(从蔡司LSM 700年,德国)。

对主轴染色实验中,卵母细胞后去除颗粒细胞固定在4%多聚甲醛在室温下(PFA) 1 h,之后他们转移到0.5% Triton x - 100透化作用解决方案制定使用4%的PFA在室温下30分钟。透化作用的末尾,三洗进行使用PBST,阻止使用5%牛血清白蛋白(BSA)在室温下1 h,然后孵化α热费希尔科学-tubulin-FITC(1: 200年,沃尔瑟姆,妈,美国)和稀释5% BSA在一夜之间在4°C。孵化后,卵母细胞被转移到一个antifluorescent冷却器与4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)染料(细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)安装和摄影在PBST清洗三次。胚泡在胚泡细胞计数用DAPI染色实验,共焦激光扫描显微镜下成像,根据核的数量计算。

2.5。血清激素测定

小鼠血清促卵泡激素(FSH)、雌二醇(E₂)和孕酮(P4)水平测定使用化学发光免疫测定工具包(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)罗氏诊断Cobas 6000分析仪。

2.6。卵泡评分和计数

老鼠被颈椎脱位牺牲后,卵巢被PFA和转移到4%,嵌入在石蜡,然后分段连续的厚度5μm;第五张幻灯片都与苏木精和伊红染色(他)。卵泡等级和计算方法是基于以前的出版物(21]。

2.7。免疫组织化学染色

PFA小鼠卵巢被固定在4%,然后嵌入石蜡,切割到5μ米厚的部分。最大横截面的部分被用于染色。幻灯片在65°C 1 h,烤deparaffinized在二甲苯中,浸泡在蒸馏水后分级乙醇添加到水以及抗原检索和孵化3%过氧化氢溶液在室温下10分钟。洗了三次之后,幻灯片PBS和孵化5% BSA 10分钟。注入液体后,一夜之间孵化与抗体在4°C哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR) (Abcam 1: 1000年,剑桥,英国)或P16(1: 1000年,Abcam)。消极的控制,使用血清代替主要抗体。隔夜孵化后,主要的抗体被丢弃,幻灯片和PBS洗了三次,辣根过氧化物酶二次抗体(山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白g h和l, 1: 5000年,Abcam)添加1 h在37°C。孵化后,幻灯片在PBS清洗三次,轻拍色原是一滴一滴地补充道。颜色开发完成后,幻灯片被洗了三次在PBS和苏木精复染色20年代。幻灯片是3分钟,然后用自来水冲洗安装使用中性树胶,成像光学显微镜。

2.8。马森的三色的染色

石蜡包埋组织如上所述处理和染色使用马森污点工具包(Servicebio,武汉,中国)。小鼠卵巢部分依次在二甲苯脱蜡和浸泡在蒸馏水和乙醇梯度增加;然后,部分是用蒸馏水清洗和浸泡在马森染料溶液在一夜之间。一夜之间文化后,部分是用自来水冲洗,然后,他们沉浸在染料溶液混合着马森马森B和C在同等比例为1分钟。之后,部分与蒸馏水冲洗1分钟,浸泡在1%的盐酸酒精1分钟,然后用自来水冲洗,然后沉浸在马森D染料溶液6分钟紧随其后的是最后一个用自来水冲洗干净。之后,部分在马森E浸泡1分钟,放置在马森F染色后30年代的解决方案将略干,与1%冰醋酸为1分钟,冲洗与绝对乙醇脱水的两倍,在新鲜绝对乙醇浸泡5分钟。最后,他们沉浸在二甲苯透明化5分钟,安装在中性树胶和成像。

2.9。细胞培养

人类主要颗粒细胞(包括)收集患者卵泡液的IVF-assisted怀孕在郑州大学第一附属医院生殖中心,和具体方法是基于以前的出版物(22]。

2.10。RNA提取和实时聚合酶链反应(PCR)

治疗后,细胞先用预冷PBS洗一次,通过添加相应的体积和细胞细胞溶解的试剂盒(表达载体);200年μl氯仿每1毫升的试剂盒,添加和管当时大力动摇了15秒,在室温下放置10分钟,然后在12000转离心样品低温15分钟。上层水相是收获,紧随其后的是200μ15 s l异丙醇,剧烈的摇晃,让站在室温下10分钟,然后在12000转离心样品低温15分钟;浮在表面的丢弃,其次是75%乙醇洗两次,添加适量的RNase-free重蒸馏的H₂O为解散决定RNA浓度和质量。合格的RNA是相对地转录使用iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad、大力神、钙、美国),和相对地转录cDNA被使用SYBR荧光定量PCR检测®绿色主人混合工具(Bio-Rad) QuantStudio 12 k Flex仪器(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。所有的引物序列补充表所示S1。

2.11。西方墨点法

颗粒细胞治疗是使用prechilled PBS洗,和100年μl radioimmunoprecipitation分析缓冲区(Solarbio)溶菌产物被添加到每个好,细胞溶解在冰上,持续15分钟。细胞溶解细胞转移到离心管,离心12000 rpm的15分钟在4°C,然后,浮在表面的蛋白质为量化收集和处理钠十二烷基加载缓冲区在100°C 5分钟之前储存在-80°C,直到将来使用。使用预制凝胶电泳进行(Genscript,南京,中国)和转移到0.45μ马在25 m PVDF膜在半干的转移了14分钟。细胞膜被封锁在室温下使用5%的脱脂牛奶1 h,然后,一夜之间,细胞膜被孵化在4°C主要抗体。结束时的主要抗体孵育,相应的二次抗体洗脱后在室温下添加1 h和TBST三次。二次抗体孵育,年底膜在TBST清洗三次,乐队是使用一个增强化学发光检测系统(Bio-Rad)。主要的抗体使用如下:bcl - 2(1: 1000年,Abcam),伯灵顿(1:1000年,Abcam) Caspase-3(1: 1000年,Abcam),γH2AX(1: 1000年,Abcam),核因子- (NF)κB(1: 1000年,细胞信号技术);mTOR(1: 1000年,Abcam);β肌动蛋白(Bioworld 1: 5000年,布卢明顿,锰、美国);和GAPDH(1: 5000年,Abcam)。老鼠和兔子辅助免疫球蛋白抗体(1:5000)都从Abcam。Beta-actin GAPDH和作为内部控制。

2.12。细胞凋亡和ROS通过流式细胞术分析

颗粒细胞常规培养在6-well板24 h。饥饿的24 h后,细胞培养与不同浓度的TF3或控制另一个48 h,然后用PBS洗了三次。细胞凋亡检测执行使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡工具包(南京凯基生物生物技术,中国)。活性氧测定工具包(Beyotime)是用来评估在颗粒细胞ROS水平。BD C6的样本分析流式细胞分析仪(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)。

2.13。β牛乳糖染色

使用衰老衰老染色分析β牛乳糖染色设备根据设备指令(Beyotime)。短暂、热解色谱和KGN细胞系被播种在6-well板的密度 细胞/好,经常培养24小时。无血清培养基是饥饿24 h,紧随其后的是不同浓度的TF3或控制文化48 h。在治疗结束时,这些细胞被用PBS三次,固定在一个固定剂在室温下15分钟,沾染了染色的解决方案在37°C一夜之间,然后拍照进行分析。periovarian脂肪组织,样品在PBS冲洗三次,固定在固定剂在室温下15分钟,然后沾着染色的解决方案工具包在成像之前一夜之间37°C。

2.14。细胞免疫荧光染色

颗粒细胞治疗是固定使用4% PFA在室温下30分钟,然后在室温下与PBST permeabilized 30分钟。的尽头透化作用,5% BSA是用来阻止1 h在室温和γH2AX抗体(1:1000年,Abcam)添加了一夜之间在4°C孵化。兔免疫球蛋白二次抗体(1:5000年,Abcam)添加三PBST洗一个60分钟后在室温下孵化。二次抗体孵育,年底样本清洗三次PBST和安装antifluorescence包含DAPI冷却器。激光扫描共焦显微镜图像进行了分析。

2.15。细胞生存能力分析

细胞增殖能力的检测和分析利用细胞计数kit-8 (CCK-8;Dojindo,日本东京)。短暂,包括常规培养在24-well板块 种子每24 h,渴望另一个24小时,然后用不同剂量治疗TF3 96 h。治疗后,培养基是更改为300年μl CCK-8 DMEM包含10%的解决方案,和文化持续了2 h。光度值在450海里发现Varioskan Flash标(热费希尔科学)。

2.16。核糖核酸测序和分析

人类包括常规培养24小时,然后饥饿24 h。培养基是变成一个包含10μM TF3、或控制介质用于总共6 h孵化。在治疗结束时,细胞RNA收集,互补脱氧核糖核酸数据库构建,转录组PE150测序进行使用Illumina公司NovaSeq平台(Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。454年目标预测和功能分析进行选择使用微分基因Metascape在线(23]。GSEA使用OmicStudio工具完成https://www.omicstudio.cn/tool。

2.17。统计分析

所有的实验进行了一式三份,并作为结果 。统计分析使用 - - - - - -测试。的值 被认为是显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。TF3改善卵巢功能,提高老年小鼠窝大小

探索TF3对卵巢功能的影响,老老鼠给填喂法TF3管理局(30毫克/公斤)为90天,每两天就和年龄给予对照组小鼠相同体积的生理盐水。在治疗结束时,发情周期连续14天监测,结果显示,旧的发情周期TF3组增加与旧的对照组相比,尽管它仍然是长期与年轻人相比对照组(图1(一))。旧的对照组血清FSH水平明显高于年轻组( )和减少TF3治疗后( );雌二醇和孕酮水平组之间没有显著差异( )(图1 (b))。

老老鼠的卵巢体积后显著增加TF3填喂法治疗(数字1 (c)和1 (e)),卵巢重量和卵巢/体重比明显高于旧的控制( )(图1 (d))。苏木精和伊红染色法治疗卵巢部分进行分析TF3对卵泡发育的影响,结果显示,更多的毛囊仍然在卵巢TF3-treated组比旧的对照组(图1 (e))。原始卵泡的数量也显著增加( )(图1 (f))。更有趣的是,卵巢间质纤维化的程度减少TF3-treated年龄小鼠相比老控制(图1 (g))。此外,卵巢储备标记的信使rna表达水平分析表明,抗苗勒氏管激素的表达水平,BMP15, GDF9老控制老鼠明显较小的比年轻的控件( );尽管如此,TF3治疗恢复抗苗勒氏管激素的表达水平和GDF9 ( )(图1 (h))。

探讨TF3对老鼠的影响生育能力,我们在不同组的小鼠表现自然生育化验。年轻的垃圾大小控制老鼠的最高自然交配后,旧的控制老鼠明显下降( ),和垃圾大小的老鼠接受TF3填喂法高于旧的对照组( )(数据1(我)和1 (j))。

3.2。TF3会使卵巢体内基因的表达水平

上述结果表明,TF3可以改善卵巢功能,提高垃圾大小在老年小鼠,这似乎表明,TF3有助于延缓卵巢衰老。脂肪组织在卵巢的衰老是卵巢功能和衰老密切相关。染色的首次演出是在这项研究中,β-半乳糖卵巢附近脂肪组织,结果表明脂肪组织在老年对照组是深色,TF3治疗后成为轻,这表明TF3治疗减少卵巢的衰老程度的脂肪组织(图2(一个))。苏木精和伊红染色分析periovarian脂肪组织部分显示,脂滴在卵巢的大小年龄对照组的脂肪组织是与年轻组相比显著增加,TF3治疗显著降低脂滴大小( )(数据2 (b)和2 (c))。免疫组织化学结果显示减少mTOR的表达和卵巢组织中p16 TF3处理(图的年长老鼠2 (d))。RNA提取治疗卵巢的老鼠来分析炎症标记基因的信使RNA表达水平白介素- 2 (IL),il - 6和肿瘤坏死因子-α(TNFα)。TF3治疗显著降低- 2 mRNA水平( ),il - 6和TNFα倾向于减少TF3治疗后但不显著( )(图2(e))。

3.3。TF3改善衰老小鼠卵母细胞质量

卵母细胞质量直接反映卵巢功能。针对这一点,每组小鼠排卵受到感应,和收获COCs用于后续实验。与年轻的控制老鼠相比,颗粒细胞在COCs年龄控制老鼠相对松散排列和稀缺,而周围颗粒细胞层COCs TF3治疗后紧密排列(图3(一个))。进一步评估TF3治疗对小鼠卵母细胞质量的影响,颗粒细胞被COCs获得的免疫荧光染色。结果表明,卵母细胞的活性氧水平的年龄对照组高于年轻组,和抗氧化剂谷胱甘肽水平低于青年对照组。TF3治疗后,在老年小鼠卵母细胞的活性氧水平下降,以及谷胱甘肽表达增加(图3 (b))。线粒体膜电位的分析卵母细胞染色标记JC1透露,年轻控制小鼠卵母细胞的线粒体膜电位升高了,主要是在JC1聚合物(红色荧光)的形式。年龄控制老鼠贫穷卵母细胞线粒体功能和膜电位较低,主要的形式JC1单体(绿色荧光),和TF3-treated年龄小鼠部分恢复线粒体功能,和更多JC1聚合物存在于细胞质(图3 (c))。此外,α-tubulin-stained小鼠卵母细胞的纺锤波显示,大多数的主轴安排年轻的对照组是正常的,和梭形纤维被严格监管,连续的,和核安排紧。此外,卵母细胞纺锤体异常的比例在年龄对照组显著增加( ),这表现为松散的主轴断裂与分散核形态。异常纺锤波的比例显著降低老年人老鼠TF3治疗后( )(数据3 (d)和3 (e))。

探讨不同治疗方法对小鼠胚胎发展的影响,得到了小鼠卵母细胞后诱导排卵在体外施肥实验(图3 (f))。TF3-treated检索的卵母细胞数量明显高于老年人的年长老鼠控制老鼠( )(图3 (g))。此外,尽管受精后率和囊胚形成率在体外受精岁TF3-treated老鼠略有增加,他们没有显著差异( )。此外,囊胚细胞的数量这两组之间没有显著差异( )(图3 (g))。

3.4。TF3培养包括抑制细胞凋亡

卵泡颗粒细胞是卵巢功能密切相关。探索潜在的调控机制TF3卵巢功能,我们调查了TF3对颗粒细胞凋亡的影响。在一个在体外文化人类热解色谱模型,结果显示,TF3有利于保持健康包括形态、和贴壁细胞的数量在96 h的文化与对照组相比显著更大(图4(一))。CCK-8细胞生存能力分析分析还表明,TF3可以显著抵抗包括细胞凋亡水平(图4 (b))。染色的衰老标记牛乳糖后48 h(包括文化和KGN颗粒细胞行显示,TF3治疗可以显著降低苷酶的表达水平和延缓细胞老化( )(数据4 (c)- - - - - -4 (e))。流式细胞术结果显示,包括细胞凋亡的比例后48 h TF3治疗显著降低( )(数据4 (f)和4 (g))。TF3抑制细胞凋亡的培养包括可能与bcl - 2 /伯灵顿比率的upregulation TF3的差别,对这些基因的蛋白表达水平的伯灵顿,caspase-3,γH2AX(图4 (h))。定量结果补充材料(补充图所示S1)。荧光染色的结果γH2AX, DNA损伤的一个标志,也表明TF3-treated热解色谱有显著降低γH2AX荧光(图4(我))。

3.5。TF3改善颗粒细胞的抗氧化能力培养在体外

进一步调查TF3在颗粒细胞的作用,我们构建了一个H₂O₂治疗包括氧化应激模型,用流式细胞术分析TF3抵消细胞氧化应激的能力。结果表明,H₂O₂显著增加细胞凋亡的比例( ),由TF3减毒治疗( )(数据5(一个)和5 (b))。分析细胞内ROS水平显示,TF3也可以显著降低H₂O₂增加全身的细胞ROS水平( )(数据5 (c)和5 (d))。细胞内JC1线粒体膜电位测定分析证实,TF3可以显著上调线粒体膜电位的下降引起的H₂O₂(图5 (e))。

3.6。TF3可能通过影响自噬通路调节卵巢功能

进一步探索TF3的潜在行动通路在调节颗粒细胞功能,全转录组测序分析进行热解色谱TF3治疗后。总共454个基因显著改变了表达式TF3治疗后( )(补充表S2)。基因本体论(去)差异表达基因分析表明,TF3在颗粒细胞主要影响生殖和发育过程的调节(图6(一))。相关信号通路的分析表明,TF3可能参与生殖和发育过程的调节通过A / 1 (Rhodopsin-like受体),GPCR配体结合,Wnt信号通路,PI3K-AKT-mTOR集群(图6 (b))。基于关键信号通路和显著差异基因的进一步分析,我们假设mTOR通路及其相关下游分子可能受TF3监管网络。我们进行浓缩的分析差异表达基因,利用基因集富集分析(GSEA)算法,结果表明,TF3治疗可以显著影响自噬功能( )(图6 (c))。这是验证在颗粒细胞和小鼠卵巢;结果显示,颗粒细胞的表达autophagy-related蛋白质mTOR和NF -κB TF3治疗后下降,这表明TF3可能清除ROS-damaged蛋白质和受损的线粒体通过激活自噬通路(图6 (d))。定量结果补充材料(补充图所示S2)。NF -κB和mTOR蛋白表达水平增加年龄控制老鼠的卵巢组织控制与年轻老鼠相比,当他们减少年老老鼠的卵巢TF3治疗后(图6 (e))。定量结果补充材料(补充图所示S3)。此外,我们使用了AutoDock维纳方法执行半柔性的对接TF3 mTOR美联储域,选择最优构象的亲和力(图6 (f))。美联储的亲和力结合能TF3 mTOR域(5可喜可贺)蛋白质-7.7千卡/摩尔;六个氢键可以与氨基酸残基形成Asp2102, Glu2032, Ser2015,和Tyr2105 mTOR的蛋白质,和两个π- - - - - -π与Phe2039相互作用可以形成。疏水相互作用形成的分子也与氨基酸残基Phe2039 Tyr2105。TF3预测影响mTOR形成更稳定的复杂通过氢键和疏水相互作用。

4所示。讨论

天然茶多酚TF3是一种小分子化合物,已成为越来越受欢迎的作为膳食补充剂在临床实践中;这些化合物的特点是多个目标自然低毒性,甚至没有毒性24]。在这项研究中,胃内的管理TF3老年小鼠显著延迟卵巢衰老,维持卵巢储备,缩短发情周期,扩大垃圾大小。进一步的研究发现,TF3治疗显著下调卵母细胞ROS水平和纺锤体异常率,进而提高卵母细胞质量。卵巢颗粒细胞的分析表明,TF3改善颗粒细胞的抗氧化能力,减少细胞凋亡,这可能是有关美联储TF3绑定到mTOR的目标域和调节自噬通路。

女性生殖性能随着年龄降低,表现为滤泡池的连续消耗和不规则的月经周期;这些变化都伴随着增加FSH和减少抗苗勒氏管激素,和过度FSH水平将导致滤泡增生,从而加剧了卵泡池枯竭(25]。原始卵泡的数量在正常月经的女性的卵巢是10倍的原始卵泡的月经不调,和卵泡损耗急剧增加的速度在女性生殖生命的最后阶段(准更年期时期)26]。此外,能够分泌荷尔蒙和垂体激素的响应是卵巢功能的重要表现,和FSH水平也显示可怜的滤泡过度增长27]。在这项研究中,我们发现在老鼠补充TF3 FSH水平明显低于老年人对照组,表明TF3可以改善老年小鼠卵泡发展,这是符合我们卵泡数量。女性内分泌失调降低生活质量,因为潮热、盗汗,睡眠紊乱,骨质疏松症,甚至抑郁(28,29日]。我们的实验表明,TF3填喂法治疗9个月大的老鼠相当于准更年期早期干预的人类,结果显示,TF3有利于维持卵泡池,提高卵巢功能。这种治疗部分恢复了老鼠的发情周期,表明TF3也有潜在作用在改善妇女的生活质量。

periovarian脂肪组织的条件是卵巢功能密切相关;中度脂肪组织具有保护作用,但过度的脂肪组织分泌促炎引起细胞衰老的因素,进而导致卵母细胞和颗粒细胞质量下降以及加速卵巢衰老(30.]。TF3会使由脂肪组织分泌的炎症因子的表达(31日),和人类的随机对照试验表明,口服茶黄素政府10周显著减少皮下脂肪含量和增加骨骼肌(百分比32]。我们的结果显示显著更大的脂滴periovarian脂肪组织面积的比年轻的年长老鼠控制,并补充TF3显著降低脂滴区域,这是与以往文献报道一致。苷酶染色显示,TF3衰老小鼠脂肪组织可以显著延缓卵巢衰老。

Overactivation原始卵泡池造成持续的损失的原始卵泡,导致卵巢功能早衰的发展(POF) [33]。清晰度高的发病率约1%的女性,是女性生殖系统的加速老化前的40岁(34]。使用化疗药物顺铂等也可以导致POF,从而降低卵巢功能(35]。重要的是要防止过度激活的滤泡池,从而维持卵巢储备,延长女性生殖。管理TF3老老鼠保存原始卵泡池和增加垃圾的大小。这些发现表明,TF3减缓过度激活的滤泡池,这对改善和延长女性生育能力是很重要的。

autophagy-lysosomal系统是一个重要的方法来移除受损的细胞器和扮演关键的角色都有针对性的退化治疗各种疾病(36和卵巢衰老的规定37]。生理上,氧化应激系统保持体内平衡,当ROS水平略有增加,激活自噬系统来清除它们。当与年龄相关的活性氧积累变得过度和自噬活性随着年龄降低38),清除活性氧的能力也下降,在这段时间里,过多的活性氧造成的损害将导致加重衰老和慢性损伤。因此,增加了自噬活动有利于延缓衰老过程(39][40]。

卵泡的微环境,颗粒细胞和卵母细胞相互作用来调节卵泡发育的过程。颗粒细胞可以通过缝隙连接直接影响卵母细胞质量,这可能导致卵母细胞质量下降加剧了氧化应激时的颗粒细胞(41]。因此正常颗粒细胞功能所必需的卵母细胞发展(42]。的在体外文化模式的热解色谱纯化从人类的卵泡是广泛应用于生殖研究[43,44),但包括的生存能力和地位也逐渐减少文化较长的时间;因此,它是一个潜在的老化细胞模型。我们发现,TF3可以延缓颗粒细胞凋亡在体外显著降低ROS-induced凋亡和氧化应激损伤的H₂O₂全身的氧化应激模型。苷酶染色进行热解色谱,KGN细胞,和鼠标periovarian脂肪组织培养在体外;结果表明,TF3治疗可以延缓颗粒细胞的衰老和periovarian脂肪组织。这表明TF3能促进溶酶体降解在细胞和生物体水平促进衰老细胞的清除和有害物质,有效延缓衰老。

研究卵母细胞来源于TF3-treated岁老鼠透露,TF3可以减少ROS水平,增加谷胱甘肽水平,减弱在卵母细胞线粒体膜电位的降低,并提高卵母细胞质量。据推测,TF3可以减少损伤造成的卵巢ROS overaccumulation通过清除ROS和增加抗氧化酶的活动。茶多酚已发现部分恢复减数分裂异常,DNA损伤和细胞凋亡在猪卵母细胞接触顺铂(45),这是与我们的研究结果一致,TF3可以显著降低的比例异常纺锤波从老年小鼠卵母细胞。此外,据报道,在体外牛卵母细胞成熟和添加一定浓度的茶多酚在体外培养基可以提高受胎率(46]。茶多酚如TF3似乎对卵母细胞成熟和胚胎发展积极的影响在体外。

一些研究者发现TF3可以在磷酸腺苷酶直接作用,从而影响他们的结构活性和抑制ATP营业额和生产(17]。多酚类化合物也可以通过针对mTOR[调节衰老过程47]。这些研究似乎表明,TF3可能通过调节能量代谢通路保护卵巢功能。澄清TF3在卵泡发育的作用,我们进行了颗粒细胞的RNA序列TF3治疗后,进行深GSEA测序的结果,这表明,TF3主要影响生殖和发育过程通过调节自噬和PI3K-AKT-mTOR等途径。

自噬可以减少健康细胞的死亡和维持体内平衡有重要作用。除了它能够消除潜在prototoxins,自噬可以改善线粒体功能和帮助恢复受损的线粒体与急性细胞损伤;此外,它可以帮助避免细胞凋亡或坏死(48]。老化过程中,氧化应激和炎症可引起DNA损伤,我积累κB激酶,导致增加mTOR的表达式和NF -κB,从而抑制自噬,进一步加剧老化(49,50]。多酚类化合物可以模仿热量限制诱导自噬(51),主要是通过增加活化蛋白激酶减少mTOR和诱导自噬38]。我们的测序结果证实,TF3主要调节颗粒细胞功能影响自噬途径,并进一步分析表明,天然小分子化合物TF3美联储可能采取行动mTOR领域发挥其监管效果。

5。结论

在体外和在活的有机体内小鼠模型实验表明,TF3能有效延缓卵巢衰老的过程,改善老年小鼠的卵巢功能通过提高卵母细胞和颗粒细胞功能(图质量7)。作为一种天然多酚化合物,TF3可以调节mTOR减少卵巢新陈代谢维持卵巢储备,减少活性氧的积累由于ATP生产过剩,改善卵巢自噬清除老化的物质,减少ROS损伤卵母细胞和颗粒细胞,延缓女性卵巢衰老,延长女性生育能力。

数据可用性

中的数据将提供补充材料。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Jiahuan他负责执行大部分的实验,数据解释,数据分析,和准备手稿。Guidong姚明是负责设计研究中,执行实验,分析数据。Qina他和通渭县张他们负责执行这个实验,数据解释、数据分析。Huiying粉丝,运城呗,张淳弥,广阳,Ziwen Xu和精益胡负责收集样本,数据解释和数据分析。樱普阳光负责设计和监督学习。所有作者参与的修订手稿。Jiahuan他Guidong姚明,Qina他和通渭县张他们的贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(U1904138 Guidong姚)和中国国家重点研发项目(2019 yfa0110900樱普阳光)。

补充材料

补充1。补充表S1:引物用于这项研究。

补充2。补充表S2:差异表达基因治疗TF3在初级颗粒细胞。

补充3。补充图S1:细胞凋亡蛋白表达在不同组的统计分析。补充图S2:统计分析的NF -κB和mTOR蛋白表达在不同的组。补充图S3:统计分析的NF -κB和mTOR蛋白表达在不同的组。