文摘

缺失多态性的谷胱甘肽S-transferase M1 (GSTM1基因),第二阶段解毒和抗氧化酶,增加对终末期肾病(ESRD)的发展以及ESRD患者心血管疾病(CVD)和导致他们短心血管生存。贡献差别GSTM1基因的机制对这些基因在内皮细胞氧化应激和炎症尿毒症条件到目前为止还没有被调查。因此,本研究的目的是阐明GSTM1基因的影响击倒在氧化应激和炎症标记物的表达一组人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)暴露于尿毒症血清。此外,我们旨在辨别是否GSTM1-null基因型与ESRD患者的血清水平的粘附分子。HUVECs治疗尿毒症血清展出受损的氧化还原平衡的特征增强的脂质过氧化和抗氧化剂酶活性下降,独立于GSTM1基因击倒。尿毒症的损伤,HUVECs展出变更在一系列炎性细胞因子的表达包括retinol-binding蛋白4 (RBP4),激活规范,正常T细胞表达和分泌(咆哮)、c反应蛋白(CRP),血管生成素,dickkopf-1 (shh)和血小板因子4 (PF4)。GSTM1基因击倒在HUVECs显示upregulation单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1),一个细胞因子参与调节单核细胞迁移和附着力。这些细胞也有显示调节细胞内和血管细胞粘附分子(ICAM-1和VCAM-1)。依照这些发现,血清ICAM-1和VCAM-1的水平(sICAM-1和sVCAM-1)增加ESRD患者缺乏GSTM1基因,与患者相比GSTM1-active基因型。基于这些结果,它可能会得出结论,孵化尿毒症血清诱导的内皮细胞氧化还原平衡伴随着改变表达式的一系列细胞因子参与了动脉硬化和动脉粥样硬化。协会与差别GSTM1基因对这些粘附分子的表达改变可能至少部分负责ESRD患者心血管疾病的易感性增加。

1。介绍

内皮功能障碍是心血管疾病(CVD)的基本机制是导致患者死亡的主要原因终末期肾病(ESRD) [1- - - - - -4]。血管内皮细胞可能ESRD尿毒症毒素产生的主要目标。在这种情况下,内皮不断暴露于尿毒症毒素积累因此诱导氧化应激和炎症,从而导致内皮损伤(2,5- - - - - -7]。

纯合子缺失的谷胱甘肽S-transferase M1 (GSTM1基因),这是一个第二阶段解毒酶,导致氧化应激产物积累表明其在抗氧化保护作用[8]。在30 - 50%之间不同的人口GSTM1基因缺失(通常为纯合子的表示GSTM1-null基因型),从而完全缺乏GSTM1基因酶(9]。GSTM1基因缺陷与更高的心血管疾病作为个体的易感性GSTM1-null表明基因型显著增加发展中抗高血压的风险(10),冠状动脉疾病/动脉粥样硬化(11,12),和中风13,14]。此外,GSTM1-nullESRD基因易感性增加并导致更短的整体生存和心血管患者血液透析(8,15- - - - - -17]。GSTM1基因缺失和氧化应激之间的关系在ESRD患者得到了我们之前的结果表明高浓度的一些副产品(ESRD患者的蛋白质和脂质氧化损伤GSTM1-null基因型相比GSTM1-active基因型(8]。有人建议,在炎症和prooxidant环境观察ESRD患者的内皮响应表达细胞和血管细胞粘附分子(ICAM-1和VCAM-1),促进白细胞与内皮细胞的迁移和粘附[18]。我们最近表明,可溶性ICAM-1和VCAM-1 (sICAM-1和sVCAM-1)有很强的预测作用的整体水平和心血管生存在ESRD患者血液透析(17]。然而,GSTM1基因缺失的潜在影响上述炎症标记物并没有阐明在透析患者或内皮细胞暴露于尿毒症毒素通常出现在迹象。

尽管人类军团令人信服的结果显示的重要性GSTM1基因缺失在透析患者心血管疾病的易感性和发展15,16,19,20.),它的作用在血管病理生理学尚未建立。GSTM1基因的功能性作用研究血管平滑肌细胞(VSMC),表明减少GSTM1基因表达在这些细胞引起细胞增殖增加,氧化应激,和迁移21]。然而,在内皮细胞的差别与GSTM1基因相关的机制对这些尿毒症条件到目前为止还没有被调查。

因此,本研究的目的是阐明GSTM1基因的影响击倒在氧化应激和炎症标记物的表达一组人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)暴露于尿毒症血清。此外,我们旨在辨别是否GSTM1-null基因型与ESRD患者的血清水平的粘附分子。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

HUVECs (写明ATCC马纳萨斯,维吉尼亚州,美国gelatine-coated文化板块)被播种0.2%,生长在一个MV2生长培养基(内皮细胞生长中MV2,PromoCell,德国)标准的细胞培养条件下(湿润气氛,5%的股份有限公司₂,37°C)。细胞被播种在板材gelatine-coated可行性分析,免疫印迹分析,氧化压力测量,评估细胞因子的表达。HUVECs孵化池的人类血清获得健康志愿者(控制血清, )或ESRD患者血液透析(尿毒症血清, )。所有患者接受血液透析每周3次在研究开始前至少3个月使用聚砜透析膜和传统bicarbonate-buffered透析液。参与者与任何形式的恶性肿瘤、自身免疫性疾病、或传染性并发症(艾滋病毒、乙肝病毒或丙肝病毒感染)被排除在外。血液从病人血液透析前会议中心的肾脏疾病,Zvezdara大学医学中心,贝尔格莱德。所有患者签署知情同意同意参与这项研究。本研究由医学院伦理委员会批准,贝尔格莱德大学(作品1550号/ V-30),并进行了符合赫尔辛基宣言》从2013年。

2.2。细胞生存能力分析

细胞生存能力评估是基于测量线粒体脱氢酶活性,比色方法使用MTS细胞增殖试验设备(英国Abcam),根据制造商的协议。5000细胞/在96孔培养板。24小时后,增长媒体被丢弃和细胞处理媒体,10%,20%,30%的控制或尿毒症血清4 h和6 h。可行的细胞产生的甲瓒盐量化通过测量吸光度在490海里FLUOstar®ω板读者(BMG Labtech,德国)。细胞的生存能力在人类血清池孵化6 h相比没有明显变化的细胞正常生长介质(图中孵化1方式,补充)。因此,所有进一步的HUVEC治疗方法进行使用30%控制或尿毒症血清媒体6 h,在细胞因子表达和氧化压力进行了测量。

2.3。GSTM1基因击倒在HUVECs使用核

沉默GSTM1基因蛋白表达,HUVECs播种密度 细胞每在6-well盘子和在MV2增长中长大的。第二天,细胞转染100海里GSTM1基因小干扰RNA (siRNA) (热费希尔科学,英国)使用DharmaFECT转染试剂(通用电气医疗集团,美国)或接受DharmaFECT作为控制。九十六小时posttransfection,消声效果证实了免疫印迹。

2.4。免疫印迹分析

HUVECs细胞溶解在缓冲区里帕(50毫米Tris-HCL pH值8.0,150毫米氯化钠,IGEPAL 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,和10% SDS)补充与蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏公司,英国)。提取后,蛋白质浓度测定Bicinchoninic酸蛋白质化验设备(BCA,热费希尔科学,英国)。等量的蛋白质被加载到10%聚丙烯酰胺凝胶电泳是在10分钟80 V, 100 V 90分钟。湿法转移后,硝化纤维膜被封锁在5%脱脂牛奶(Bio-Rad,英国)在室温下1 h,然后孵化一夜之间在4°C主要抗体:单克隆鼠标anti-GSTM1(1: 1000年,研发系统,美国),单克隆鼠标anti-ICAM1 (1: 200,圣克鲁斯,美国),多克隆山羊anti-VCAM1 (1: 200,圣克鲁斯,美国),单克隆鼠标反β肌动蛋白(1:000,热费希尔科学,英国)。第二天,膜与适当的孵化HRP-conjugated二级抗体:anti-mouse 1: 5000 (Abcam,英国)和抗体1:1000 (RayBiotech,美国在室温下)1 h。Chemiluminescent乐队检测使用西方毫微微最大灵敏度衬底(热费希尔科学,英国)礼盒(柯达,英国)或ChemiDoc(BioRad,美国)。微分析使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院的,贝塞斯达,美国)。

2.5。测量在HUVECs抗氧化酶的活性

抗氧化酶的活性、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX),在细胞溶解产物是由光谱光度测量的方法。SOD活性被Misra评估如前所述,Fridovich [22]。这种方法是基于能力的SOD在pH值10.2抑制肾上腺素的自动氧化。生产的彩色肾上腺素红在反应混合物中与细胞蛋白提取(样本)或没有他们在480 nm(控制)之后。SOD的活性被表示为抑制肾上腺素自氧化的百分比。GPX活性评估据Gunzler et al。23]。GPX活性化验的后续氧化NADPH在340 nm t-butyl-hydroperoxide衬底。一个单位的酶活性被表示为每分钟nmol NADPH氧化,假设 / l / mol / cm的摩尔吸光度NADPH在340海里。

2.6。HUVECs丙二醛含量的测量

细胞溶解产物丙二醛(MDA)含量测定使用竞争性酶联免疫试剂盒(Elabscience,武汉,中国)按照制造商的指示。总之,50μl标准、样品和空白被添加到每个的MDA预镀ELISA板和连续的50μ生物素化的抗体。45分钟后孵化,水井洗为了消除多余的共轭和释放样品或标准,和HRP-conjugated抗体了。颜色变化是衡量spectrophotometrically波长450纳米。

2.7。测量总在HUVECs活性氧

总活性氧(ROS)生产进行流式细胞术(流式细胞仪)使用2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (H₂DCFDA;表达载体,加州,美国)染色。HUVECs被播种在6-well板( 细胞/)和GSTM1基因转染核如上所述。90 h孵化后,细胞转染的解决方案被丢弃,在接下来的6小时孵化与30%控制或尿毒症血清媒体。治疗被移除,细胞被trypsinised。细胞颗粒在5毫升resuspended流式细胞术(1%的边后卫在PBS)和孵化的缓冲区5μl H₂DCFDA染色为30分钟37°C。流式细胞仪管离心机在8分钟400克、上层清液被移除,细胞被允许恢复15分钟37°C 1毫升MV2增长的媒体。在最后一步,细胞被resuspended在500年μl流式细胞仪缓冲区,和5μl7-AAD-viability染色的解决方案(eBioscience,圣地亚哥,美国)上执行测量之前添加调NxT声学聚焦流式细胞分析仪(表达载体,加州,美国)。结果进行分析使用FlowJo,版本。10.4(斯坦福大学。大学,美国)。

2.8。分析HUVECs的细胞因子的表达

探讨尿毒症血清和GSTM1基因沉默对内皮细胞的影响炎症,同时在105年的相对表达细胞因子评估细胞蛋白提取使用人类蛋白质组分析器™XL细胞因子数组工具包(研发系统,英国根据制造商的指示)。HUVECs 6-well培养皿中被播种密度 细胞每口井。转染后,GSTM1基因^{+ / +}和GSTM1基因^{+ / -}细胞被孵化的30%控制或尿毒症血清媒体6 h。培养时间过期后,治疗被移除和细胞与PBS冲洗。细胞被刮的裂解缓冲17(研发系统,英国),补充了10μ10 g / ml抑肽酶μg / ml亮抑酶肽和10μ克/毫升抑肽素。细胞溶解产物离心后得到在14 000 g为5分钟。混合细胞溶解产物( /组)探测四硝基膜分离。每个膜包含捕获和控制抗体发现重复,使得同步测量105细胞因子的表达式。视觉效果在化学发光点礼盒(柯达,英国)。结果量化使用HLimage + +软件和标准化的参考点定位在三个每个角落的污点(西方视觉软件,我们)。

2.9。分析循环在ESRD患者的血浆粘附分子

循环在ESRD患者的血浆粘附分子测定酶免疫测定,根据制造商的协议。一群199 ESRD患者的描述参与这项研究被描述在细节之前17]。sICAM-1被商业固相夹心ELISA(化验热费希尔科学,沃尔瑟姆,麻萨诸塞州,美国)。sVCAM-1是由固相夹心酶联免疫试剂盒(Novex,生活技术)。吸光度是阅读在450海里LKB 5060 - 006微板读者(维也纳,奥地利)。描述浓度被表示为pg / ml, sVCAM水平表示为ng / ml。

3所示。统计分析

统计分析了使用SPSS 17.0版统计软件包(IBM SPSS统计)。所有分析参数测试数据的正常使用Shapiro-Wilk测试。对于正态分布数据,两组之间的差异进行评估的独立样本 - - - - - -测试或单向方差分析与费舍尔最显著差异(LSD)事后。对于非正态分布数据,使用Mann-Whitney或克鲁斯卡尔-沃利斯检验。结果被认为是具有统计学意义 。

4所示。结果

确定GSTM1基因表达的影响在氧化应激和炎症标记物的表达一个面板,我们使用特定的siRNA HUVECs GSTM1基因基因沉默。转染96 h后,证实了GSTM1基因表达减弱免疫印迹显示~ GSTM1基因蛋白质含量减少90%左右HUVECs GSTM1基因治疗可以阻止(GSTM1基因^{+ / -})与控制(GSTM1基因^{+ / +})( ;图2 s补充)。

4.1。尿毒症血清和GSTM1基因的影响可拆卸的氧化应激的生物标志(MDA, SOD、GPX和ROS) HUVECs

抗氧化酶活性和副产品GSTM1基因的氧化应激进行了评估^{+ / +}和GSTM1基因^{+ / -}在媒体控制或尿毒症血清HUVECs孵化。HUVECs的孵化与尿毒症血清导致显著降低SOD、GPX活性的抗氧化酶在GSTM^{+ / +}HUVECs相比控制血清条件( ;数据1(一)和1 (b))。确定GSTM1基因活动的程度损失HUVECs氧化还原状态,我们沉默GSTM1基因的基因对应的核。GSTM1基因基因的沉默并不影响抗氧化酶活性的观察设置(数字1(一)和1 (b))。对氧化应激的副产品,暴露在尿毒症血清导致MDA浓度显著升高( )在GSTM1基因^{+ / +}HUVECs孵化同行相比控制血清(数字1 (c)和1 (d))。然而,GSTM1基因击倒没有统计上显著的影响总氧化应激副产品HUVECs控制或尿毒症血清(数字1 (c)和1 (d))。只有在GSTM1基因观察MDA含量增加的趋势^{+ / -}HUVECs GSTM1基因相比,^{+ / +}HUVECs控制血清( )。

4.2。尿毒症血清的影响和GSTM1基因击倒在HUVECs细胞因子的表达

为了探讨尿毒症血清的影响和GSTM1基因击倒在内皮细胞炎症,我们评估的相对表达超过100炎症标记物与蛋白质组数组中。汇集蛋白质溶解产物( /组)从四个不同的治疗组细胞(GSTM1基因^{+ / +}控制血清,GSTM1基因^{+ / -}控制血清,GSTM1基因^{+ / +}尿毒症血清和GSTM1基因^{+ / -}尿毒症血清)探测在四个不同的硝化纤维膜测量细胞因子表达。数组的键和原始的屁股展示在表1和图2,分别。

103年的相对表达细胞因子也提出了分级的热图(图3 s补充),最低的蛋白质的表达显示绿色,和黑色的最高表达。HUVECs最高度表达蛋白,根据我们的结果,在图所示3在手稿。此外,蛋白质的表达变化2倍以应对GSTM1基因击倒或尿毒症血清治疗提出了酒吧(图4)。

根据我们的分析,蛋白质表达的最高HUVECs serpin, endoglin(数据没有显示由于对热图传说的影响),和CD31。CD31 HUVECs行之有效的标志之一,这从另一方面也证实了技术的有效性进行分析。最突出的细胞因子表达的变化被尿毒症血清治疗(数据施加2- - - - - -4)。值得注意的是,孵化retinol-binding尿毒症血清导致显著高表达的蛋白4 (RBP4),激活规范,正常T细胞表达和分泌(咆哮)、c反应蛋白(CRP),血管生成素(图4)。此外,治疗尿毒症血清抑制dickkopf-1的表达(shh)和血小板因子4 (PF4)。有趣的是,在众多细胞因子确定,只有一个蛋白质的表达高于设置阈值来响应GSTM1基因击倒。即单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)在GSTM1基因表达增加2倍^{+ / -}HUVECs孵化控制血清和GSTM1基因的3.8倍^{+ / -}HUVECs孵化在尿毒症血清相比,相应的GSTM1基因^{+ / +}HUVECs。

4.3。GSTM1基因缺失的影响ICAM-1 VCAM-1表达式ESRD患者和内皮细胞暴露于尿毒症血清

根据蛋白质组阵列分析,ICAM-1和VCAM-1表达升高在HUVECs GSTM1基因基因沉默,尽管这些没有达到2倍集阈值限制。鉴于我们之前证明ICAM-1和VCAM-1 ESRD患者心血管生存的关键生物标记(17),我们调查了这些蛋白质的变化分别用免疫印迹(数字5(一)和5(b))。HUVECs的孵化与尿毒症血清导致显著增加在GSTM ICAM-1表达式^{+ / -}HUVECs相比控制血清条件( )。GSTM1基因击倒导致HUVECs ICAM-1表达的增加孵化控制血清,更加明显在HUVECs孵化尿毒症血清( )。同样,HUVECs GSTM1基因基因高表达的沉默VCAM-1孵化时控制血清,以及尿毒症血清治疗相比HUVECs GSTM1基因的正常水平;然而,这并没有统计学意义。

使用临床ESRD患者的血浆样本,我们可溶性粘附分子的浓度相比,sICAM-1 sVCAM-1,患者之间GTSM1-null和GSTM1-active基因型(图6(一)和6 (b)分别)。这些结果的细化分析最新发现氧化应激、内皮功能障碍的生物标记物可以预测ESRD患者的生存(17]。据猜测,sICAM-1水平的患者增加了24%GSTM1-null基因型相比GSTM1-active基因型(93.28 pg / ml(78.34 - -108.16)和75.34 (68.32 - -95.4)pg / ml,分别 )。同样,患者GSTM1-null基因水平的sVCAM-1水平要高出24% (662.38 (637.98 - -704.38)ng / ml),相比ESRD患者GSTM1-active基因型(532.51 ng / ml (420.78 - -653.24), )。

5。讨论

在这项研究中,我们发现尿毒症血清引起的氧化还原平衡GSTM1基因击倒的独立,以及在一系列炎性细胞因子的表达。此外,减少在HUVECs GSTM1基因导致MCP-1表达增加。此外,GSTM1基因可拆卸的诱导在体外upregulation细胞粘附分子和标记的内皮功能障碍,ICAM-1 VCAM-1,也被证实在临床设置使用ESRD患者的血浆样本。

GSTM1基因属于解毒的酶能够消除大量活性化合物从身体24,25]。患者血液透析对GSTM1基因纯合缺失整体和心血管死亡风险较高(16,17[],一大部分原因要归咎于高氧化负担8]。考虑到关键作用,氧化应激在内皮功能障碍的发展,我们假定GSTM1基因活动的缺乏导致活性氧的形成和氧化损伤。进一步阐明GSTM1基因的影响减少氧化应激在尿毒症的条件,在这项研究中,我们进行了一系列HUVEC-based在体外实验后GSTM1基因击倒。用此方法给出的结果表明,引起尿毒症血清SOD、GPX减小抗氧化酶的活动,这是伴随着增加MDA水平。这些结果是符合的在体外Chen等人的研究证据确凿的MDA水平的提高以及表达下调细胞外抗氧化能力在临床设置(26- - - - - -28]。综上所述,我们的研究结果提供进一步的证据表明,内皮细胞导致系统性氧化应激在尿毒症。这种效应在HUVECs暴露于氧化应激出现尿毒症的条件独立的GSTM1基因水平。

关于细胞因子的表达,孵化在尿毒症血清RBP4导致显著高表达,咆哮,c反应蛋白,和血管生成素,而消退,PF4的表达抑制。这些变化应该解释的复杂的病理生理学ESRD患者的血管,常导致动脉硬化和动脉粥样硬化。钙和磷酸盐的干扰体内平衡与尿毒症毒素在动脉硬化中起着关键作用,有助于加速CKD患者动脉钙化。的蛋白质参与矿化或动脉壁钙化是消退(29日]。消退是一种行之有效的蛋白与成骨细胞激活受损和骨质流失。到目前为止,几种方法研究shh建议其保护作用在动脉钙化。有趣的是,负面循环消退与动脉硬化之间的关系被发现在predialysis CKD患者(30.]。在目前的研究中,我们已经表明,第一次,组件的尿毒症血清改变HUVECs shh的表达。我们的研究结果与其他作者报告负循环消退和动脉钙化斑块之间的联系在2型糖尿病31日]。虽然我们的研究应该在较大的临床研究证实,这些结果可能表明在ESRD消退可能是一个潜在的治疗目标。

动脉粥样硬化是动脉内膜中直径的障碍,表现为斑块形成、狭窄、闭塞的血管。很可能ESRD患者的动脉粥样硬化的机制包括相同的事件在其他人群没有慢性肾病。然而,动脉粥样硬化的发展速度以及氧化程度的修改,表达粘附分子,形成泡沫细胞,平滑肌细胞的增殖是CKD患者更为明显。我们的研究结果表明,尿毒症血清对几个分子的表达变化在HUVECs参与动脉粥样硬化的进程。这些蛋白可以刺激细胞增殖(血管生成素)或单核细胞粘附(ICAM-1,咆哮,PF4)。血管生成素诱导血管生成通过激活内皮细胞和血管平滑肌细胞(32]。根据我们的结果,尿毒症血清内皮血管生成素的表达增加。它已被证明与慢性肾病恶化之前,血管生成素水平显著增加33]。此外,高血管生成素水平与外周动脉闭塞疾病和急性冠脉综合征(34,35]。因此,我们的结果表明,内皮细胞可能导致尿毒症条件加速动脉粥样硬化的移植血管生成素的表达。在动脉粥样硬化的早期阶段,刺激内皮细胞导致粘附分子的分泌,导致血管壁的招募白细胞。ICAM-1持续表达,而VCAM-1是弱表达的休息内皮(36]。这两种分子都调节炎症刺激。免疫印迹分析显示ICAM-1表达的增加,但不是VCAM-1在尿毒症血清HUVECs孵化。我们的结果符合Tumur等人的研究发现,其中一个尿毒症毒素,硫酸吲哚酚,HUVECs ICAM-1表达明显增加,而这种效应在VCAM-1慢(36]。在我们的实验设计中,孵化尿毒症血清只持续了6 h,这可能不是一个足够的时间为内皮响应VCAM-1表达式。先前的报道表明,慢性肾病患者的水平会升高ICAM-1和VCAM-1粘附分子(37]。的可能的解释可能是,高位VCAM-1 CKD患者不仅影响由其他来源内皮也如单核细胞和巨噬细胞。增加额外的粘附分子的表达是在孵化尿毒症血清在我们的研究中,是咆哮。咆哮介导单核细胞的轮回和逮捕到激活内皮。据我们所知,这是第一个报告在尿毒症的条件下调节咆哮的表达式在体外。咆哮是一个完善的中介硬化的过程(38]。此外,咆哮的重要性在肾脏疾病成立于接受肾移植排斥的研究(39),因为拒绝移植展出大量的咆哮绑定到血管内皮。在我们的研究中,咆哮HUVECs暴露于尿毒症血清,而HUVECs孵化控制血清没有视觉检测这种蛋白质的表达。在我们的研究中,只有粘附分子表达减少尿毒症血清PF4。鉴于PF4抑制祖细胞增殖和血管生成40HUVECs],其表达下降可能导致动脉粥样硬化的推广,因此生物似乎是合理的。

此外,在我们的研究中,HUVECs孵化在尿毒症血清显示增加两个急性期反应物的表达式,RBP4和CRP。RBP4血浆蛋白,这主要是由肝脏和脂肪组织分泌的,和被运输血液中维生素a (41]。已经表明RBP4海拔诱发炎症主要人类视网膜微血管内皮细胞(HRECs)和HUVECs通过增加促炎细胞因子的表达,趋化因子、粘附分子(42]。RBP4水平也展示了积极与媒体颈动脉内膜厚度的程度(43]。此外,RBP4水平已报告在晚期肾脏疾病(升高44]。值得注意的是,弗雷等人表明,相对数量的RBP4亚型提高CKD患者相比,控制(45]。相对于其他的炎症的标记,CRP在2倍在HUVECs孵化控制血清相比,尿毒症血清。HUVECs表达c反应蛋白mRNA和蛋白结构上,显示血管细胞的另一个来源CRP生产(46]。除了是炎症的标志,越来越多的证据表明,CRP可能直接参与动脉粥样硬化血管疾病的发展。因此,c反应蛋白水平升高已成为其中一个最强大的心血管疾病的独立预测指标。我们的研究首次显示,c反应蛋白表达可能增加内皮细胞暴露于尿毒症血清。

人们很容易推测,监管和行政粘附分子对尿毒症血清可以重叠信号通路的激活的结果。即ICAM-1的推动者,咆哮,RBP4, CRP基因包含转录因子结合位点NF -κB (36,47- - - - - -49]。已是不争的尿毒症毒素促进氧化应激激活的NF -κB信号通路在HUVECs [50- - - - - -53]。鉴于尿毒症血清导致HUVECs氧化还原平衡在我们的研究中,感应的NF -κB信号通路可能是一个潜在的可能机制解释了upregulation HUVECs提到的粘附分子。

GSTM1基因的沉默HUVECs导致增加内皮细胞粘附分子的表达包括MCP-1和ICAM-1 VCAM-1进行靶向治疗和可能的趋势。值得注意的是,MCP-1表达增加2倍,以应对GSTM1基因击倒在控制和尿毒症血清HUVECs孵化。关于MCP-1吸引单核细胞的作用的血管损伤,我们的研究结果提供一个机械的线索的更高的心血管疾病的风险对象缺乏GSTM1基因(GSTM1-null基因型),这是更加明显在ESRD患者尿毒症的环境。我们的结果符合的最新报告Gigliotti et al .,这表明,GSTM1基因敲除小鼠有显著增加肾脏的表达MCP-1 [54]。MCP-1也是一个重要因素在肾衰竭的发病和进展55]。更高的CKD患者尿MCP-1浓度被发现和与肾脏损害相关。虽然GSTM1-mediated MCP-1监管的确切机制仍然是难以捉摸的,重要的是要注意,GSTM1基因功能的非催化域抑制活化的细胞凋亡signaling-regulating 1 (ASK1) p38激酶信号通路(56]。田农等人报道,ASK1直接调节MCP-1表达式(57]。此外,p38 MAPK-mediated MCP-1表达式的监管也被证实在HUVECs [58]。因此,它是合理的假设GSTM1基因蛋白在GSTM1基因的缺失^{+ / -}HUVECs导致更高的表达MCP-1由于缺乏ASK1抑制。同样,很可能两个调节蛋白质,ICAM-1 VCAM-1,为了应对GSTM1基因击倒可能与ASK1相关信号通路(59]。这在未来的研究应该探索。

6。结论

本研究的结果表明,引起尿毒症血清氧化还原平衡以增强脂质过氧化和抗氧化剂酶活性下降,独立于GSTM1基因击倒。尿毒症的损伤,HUVECs展出一系列细胞因子的表达变化参与动脉硬化和/或动脉粥样硬化,其中一些可能相关的治疗目标。标记的内皮功能障碍,ICAM-1 VCAM-1,都增加了在ESRD患者缺乏GSTM1基因,而ICAM-1调节内皮细胞的低水平的GSTM1基因暴露于尿毒症血清,进一步加强他们的潜在生物标志物作为预测ESRD患者的心血管疾病。有趣的是,我们的研究描述了一个新颖的功能的内皮GSTM1基因调节单核细胞迁移和附着力,通过其MCP-1 upregulation的角色。未来的研究证实,扩大对这些发现的功能检测细胞粘附迁移,并入侵将加强我们的结果。

基于这些结果,它可能会得出结论,孵化尿毒症血清诱导的内皮细胞氧化还原平衡伴随着改变表达式的一系列细胞因子参与了动脉硬化,动脉粥样硬化发病机理。协会与差别GSTM1基因对这些粘附分子的表达改变可能至少部分负责ESRD患者心血管疾病的易感性增加。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Djurdja Jerotic和索尼娅Suvakov贡献同样作为第一作者的手稿。

确认

我们感谢献血对这项研究的参与者。我们感谢教授和她Margariti(贝尔法斯特女王大学)请捐赠HUVECs给我们。我们希望感谢Sanja Sekulic和埃莉诺·吉尔的技术支持。这项工作由教育部支持,科学和技术发展的塞尔维亚共和国,格兰特数175052年,格兰特的欧洲生物化学学会联合会(2月)。

补充材料

补充1。图1:HUVECs的可行性。HUVECs ( )在生长介质孵化;10%、20%和30%的控制和尿毒症血清媒体4 h和6 h。细胞生存能力是由MTS试验。

补充2。图2 s: GSTM1基因在HUVECs击倒。GSTM1基因核成功推倒GSTM1基因表达在HUVECs ~ 90%相比,控制。HUVECs服用100纳米核。证实了96 h posttransfection, GSTM1基因减少免疫印迹(代表照片插图)。给出的结果 , , 。

补充3。图3 s:表达的细胞因子由人类蛋白质组分析器XL细胞因子数组。HUVECs ( /组、池)和GSTM1基因转染核和GSTM1基因^{+ / +}HUVECs孵化在30%控制或尿毒症血清媒体6 h。热图代表像素密度的点归一化各自的参考点。