增加血脑屏障(BBB)通透性是由MMP3通过ERK信号通路

文摘

背景。血脑屏障(BBB)之间的交换的分子调节大脑和外周血和主要由微血管内皮细胞(BMVECs),形成大脑血管内壁,通过紧密连接(套)有关。BBB是由细胞外基质(ECM)成分,和基质金属蛋白酶3 (MMP3)重塑ECM的基板,形成BBB的一部分。氧化应激与基质金属蛋白酶的激活和BBB受损。因此,我们调查是否MMP3调节BBB通透性。方法。实验包括在活的有机体内评估异氟烷麻醉和染料溢出从野生型(WT)和大脑MMP3-deficient (MMP3-KO)老鼠,以及在体外评估WT单层膜的完整性和MMP3-KO BMVECs和连接蛋白的表达。结果。WT老鼠相比,测量使用异氟烷麻醉诱导时间和高MMP3-KO老鼠和降低WT,对待MMP3 (WT + MMP3),而麻醉MMP3-KO老鼠出现时间短,长在WT + MMP3老鼠比WT。外渗的系统性管理染料也低MMP3-KO老鼠大脑和高WT + MMP3鼠脑,比WT老鼠的大脑。三通和Transwell化验的结果表明MMP3不足(或抑制)增加,而MMP3 upregulation减少BMVEC或coculture屏障的完整性。MMP3不足也增加了大量的套在BMVECs VE-cadherin蛋白质,和蛋白质丰度拒绝BMVECs MMP3活动调节时,但当细胞外信号的细胞抑制剂处理related-kinase (ERK)。结论。MMP3 BBB通透性增加的政府异氟烷通过上调ERK信号通路,从而降低TJ和VE-cadherin BMVECs蛋白质。

1。介绍

血脑屏障(BBB)之间的交换的分子调节大脑和外周血,主要由内皮细胞组成(ECs),以及和周围的周endfeet星形胶质细胞的1]。脑微血管内皮细胞(BMVECs)形成大脑血管内壁和相互联系通过紧密连接(套),以及套的结构稳定性,在某种程度上,(能)[粘合连接处并且2,3]。众多研究表明,BBB通透性的增加与套的退化和五角ECs (4- - - - - -7),它可以破坏脑功能(8,9),增加巨噬细胞的通道,白细胞,引起内毒素、细菌,和毒品从末梢循环进入大脑(10- - - - - -12]。因此,BBB通透性的规定是至关重要的对于保护大脑免受有害成分的末梢循环和治疗中枢神经系统(CNS)疾病。BBB的监管主要通过其细胞组件之间的相互作用和细胞外基质(ECM);因此,基质金属蛋白酶(MMPs), ECM降解的主要驱动因素和重塑,似乎打破了BBB的关键作用。(13]。此外,激活细胞外signal-related激酶(ERK)通路已被证明诱导BBB研究通过改变组成套(14- - - - - -16),但TJ蛋白羊胸膜完好无损后接触MMP2和MMP9 [17,18),这表明这两种基质金属蛋白酶通过另一种机制调节BBB通透性。MMP3, MMP的另一个成员的家庭,是一个通过autocleavage zinc-dependent蛋白酶的激活,激活MMP3整编ECM的基板,形成BBB的一部分(19]。然而,MMP3调节BBB是否完整,如果是这样,是否它的调节作用是通过ERK信号和/或TJ稳定性的变化,仍不清楚。

对大多数分子,BBB的被动渗透率很低,但吸入麻醉剂异氟烷等高度脂溶性的,因此,可以遍历BBB和进入脑组织20.]。然而,因素增加BBB通透性增强异氟烷的通道进入中枢神经系统,提高麻醉(9]。因此,本报告中给出的实验评估的潜在作用MMP3 BBB通透性相结合在活的有机体内评估异氟烷麻醉和染料在野生型小鼠(WT)和MMP3-deficient溢出在体外评估的完整性BMVEC细胞层和连接蛋白的表达。我们的研究结果表明,MMP3可以治疗针对操纵BBB通透性和治疗神经系统疾病。

2。材料和方法

2.1。动物

所有动物程序依法进行指导机构提供的芝加哥大学动物保健和使用委员会(芝加哥,伊利诺斯州)。C57BL / 6-MMP3不足(MMP3−−)老鼠ttm - 610和宝石收藏模型生成所述前(21]。12代的线是backcrossed C57BL / 6小鼠,泰康利生物科学公司提供的。雇佣一个pcr分析小鼠基因型。老鼠住在一个房间里在22 - 24°C 12小时光/暗周期和获得饮用水随意。我们使用8-week-old雄鼠在这项研究。

基因分型:我们从老鼠尾巴孤立的基因组DNA片段使用从Gentra Puregene DNA隔离工具系统根据制造商的指示。大约10 ng的基因组DNA用于PCR。

2.2。实验设计

当前研究的实验设计描述如下,见图1。所有失明的方式进行了实验调查MMP3的BBB的完整性的影响,我们分配所有的老鼠在异氟烷三种不同的团体,包括WT (MMP3 + / +), KO (MMP3 - / -),和WT + MMP3(人员重组人类MMP3通过给予小鼠尾静脉注射(iv),从Abcam购买)。每个实验组包含8老鼠。在活的有机体内BBB通透性是评估通过测量伊文思蓝和sodium-FITC-dextrans外渗22]。在体外研究中,发现BBB通透性的在体外BBB的典范。评估在BBB MMP3结蛋白的作用,我们使用了MMP3重组人类蛋白质刺激大脑微血管内皮细胞(BMVECs)。之后,我们发现MMP3的蛋白质含量,ZO-1, occludin, VE-cadherin, claudin-5通过免疫印迹和荧光染色。增加MMP3水平、脂多糖(LPS) 100年一剂μg / mL作为刺激增加MMP3水平(23,24),然后,ERK抑制剂FR1080204 [25)(从Sigma-Aldrich购买)管理调查背后的机制在BBB MMP3的影响。

2.3。在体外血脑屏障的模型

模仿的解剖结构在活的有机体内BBB,我们开发了一个在体外基于大脑ECs的coculture BBB模型与星形胶质细胞,其他出版物中描述(26]。在这个模型中,BMVECs Transwell插入被播种,然后,主要分离星形胶质细胞种植的底面Transwell插入。隔离BMVECs和星形胶质细胞的补充文件中详细描述(可用在这里)。

2.4。MMP3管理在活的有机体内和在体外研究

MMP3重组人类蛋白质从σ购买被稀释20倍μg / mL检测缓冲区:50毫米三,10毫米氯化钙,150毫米氯化钠,0.05% (w / v)和Brij-35, pH值7.5。下一步,MMP3激活通过增加胰凝乳蛋白酶(σ1毫克/毫升盐酸1毫米)的股票的最终浓度5μ克/毫升。之后,准备孵化在37°C 30分钟(27),和一个剂量的50μ克/公斤MMP3的准备是注入到尾静脉注射伊文思蓝前30分钟在活的有机体内。激活MMP3添加到在体外细胞的剂量150 ng / mL为24小时。

2.5。异氟烷暴露

我们与异氟烷麻醉小鼠室,直到他们失去了知觉,呼吸给一个适当的利率。典型的接触包括3%异氟烷和100% O2,对应的呼吸率1呼吸每2秒。响应脚趾捏或尾巴夹用于确定适当的麻醉状态。老鼠口服插管22 g静脉导管和人工通气啮齿动物呼吸器(哈佛1。设备或类似设备,潮汐卷0.3毫升,率105中风/分钟)(28]。胸腔的空气通过浴缸被疏散,这是连接从老鼠鼻子Fluosorber罐和扩展。与1 - 2%异氟烷麻醉维持1小时100%的氧气。异氟烷的浓度是根据反射损失和重新调整。在麻醉过程中,老鼠放在加热垫保持体温在37°C和监控,直到完全动态。麻醉被中断异氟烷政府终止。异氟烷麻醉效果(诱导时间、出现时间、和异氟烷使用卷)仔细记录。

2.6。在活的有机体内在老鼠身上BBB通透性测定

要么伊文思蓝(29日,30.异硫氰酸)或萤光素钠(FITC)试验31日)是用于评估BBB的完整性。老鼠注射2%伊文思蓝或sodium-FITC盐水(1毫克/毫升)200μL通过尾静脉牺牲前2小时。此外,他们用1 - 2%异氟烷麻醉1小时,然后用10毫升生理盐水灌注transcardially移除伊文思蓝染料和sodium-FITC血管。从双边颞叶脑组织是小心翼翼地从动物牺牲后删除。关于老鼠注射伊文思蓝染料,总共0.5毫升的甲酰胺添加到脑组织匀浆溶解伊文思蓝染料。孵化后55°C水浴48小时,样本离心机在12000 g×30分钟。当时上层清液吸光度测量之前收集的632海里进行使用紫外分光光度计(日立公司)。伊文思蓝含量是根据标准曲线计算。为老鼠注射sodium-FITC,总共1毫升50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液的解决方案是添加到脑组织匀浆,然后离心机在3000 rpm 30分钟。我们开始收集上层清液,当时与甲醇混合(1:1)离心机在3000 rpm 30分钟。收集上清液,其荧光强度测量板的读者。 Finally, the concentration per mg of tissue was calculated using a standard curve.

2.7。RNA隔离、逆转录和定量PCR

总RNA分离细胞和组织使用RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的协议。提取的RNA治疗用重组DNAse(表达载体,宏伟的岛,纽约)根据制造商的协议来删除任何DNA污染。500 ng的互补脱氧核糖核酸合成的RNA使用上标三世逆转录工具包(表达载体)。定量实时PCR进行使用7300实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)来确定MMP3基因表达的使用验证TaqMan®基因表达测定底漆/探针组合(应用生物系统公司)。所有qPCR结果归一化的表达内生控制18岁。折叠的变化记录测定使用三角洲循环阈值(即, )方法。

2.8。Transendothelial电阻(te)测量

测量transendothelial电阻(te)在小鼠大脑EC使用电的细胞基质层进行阻抗传感系统通性(应用生物物理学,特洛伊,纽约,美国),如先前所述的研究[32,33]。对阻抗测量,细胞生长在8 w10e +数组。数组处理10毫米半胱氨酸(猫# C7352-25G, Sigma-Aldrich)其次是涂层与胶原蛋白I型(猫# A1048301热费希尔科学)1μ克/厘米²。阵列的电稳定命令在欧洲互通性系统委员会的软件用于消毒和清洁金电极。BMVECs被播种到数组的密度60000细胞/厘米²400年μL L-DMEM增长的媒体。欧洲互通性系统委员会进行了使用多个频率/时间(MFT)选项来记录阻抗测量在一个广泛的频率。

2.9。BBB通透性检测在体外研究

构建一个在体外BBB模型(34),我们孤立和识别老鼠BMVECs和星形胶质细胞(补充图1)。我们放置一个Transwell室插入0.4 -μ米孔径(美国纽约康宁)容量的玻璃瓶。星形胶质细胞( )被添加到下面的Transwell和孵化37°C和5%的公司₂为24小时。仔细钱伯斯被放置成6-well板(康宁(图)1(b))。在星形胶质细胞融合在倒置显微镜下达到了60%,ECs ( )被播种的Transwell(图137°c和5% (c))有限公司₂。此外,我们观察到的细胞在倒置显微镜下直到星形胶质细胞和BMVECs达到高密度coculture,这时,FITC-dextran (Dextran-blue-3KD和Dextran-red-40KD) (35]Transwell试验被用来评估在体外BBB通透性。

2.10。免疫印迹

细胞被放置在冰,和媒体与冰冷的PBS吸气之前洗两次。细胞裂解缓冲准备通过添加一个完整的微型蛋白酶抑制剂平板(罗氏诊断,印第安纳波利斯)和蛋白质磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)隔离缓冲区(40毫米玫瑰120毫米生理盐水1毫米EDTA, 3%的家伙 )。冰冷的缓冲区被添加到每个好,这些细胞被机械破坏用橡皮刮刀。像之前描述的那样我们执行西方的屁股,在我的论文36]。短暂、蛋白质提取的细胞受到冻结/解冻周期之前离心机(6000 rpm×20分钟)。收集上清液、蛋白质浓度测定用BCA试验(热费舍尔进行了sds - page使用4 - 12% Bis /三羟甲基氨基甲烷凝胶液(Biorad)和蛋白质被转移到硝化纤维膜。在TBST阻挡5%的脱脂牛奶之后,我们孵化与anti-MMP3膜(1:1000;Abcam), anti-ZO-1(1: 1000年,表达载体),anti-occludin(1: 1000年,表达载体),anti-VE-cadherin(1: 500年,表达载体),anti-claudin-5(1: 1000年,英杰公司),和anti-p-ERK(1: 2000表达载体)抗体在4°C为16小时。与辣根过氧化物酶-孵化后(合)共轭二次抗体,增强化学发光的膜是(ECL)试剂和成像ChemiDoc成像系统(Biorad)。定量评估了使用图像实验室软件(Biorad)。

2.11。评估由定量免疫荧光蛋白表达

固定样本解冻和水化与PBS含有甘氨酸在50毫米(Sigma-Aldrich) 10分钟。细胞被permeabilized Triton x - 100, 0.1%和非特异性结合位点被封锁阻止缓冲区(PBS包含1%的牛血清白蛋白BSA和10%的物种提出了二级抗体的血清)。细胞被孵化一夜之间在4°C主要抗体之一以下目标:vWF(1: 500稀释;卡奔塔利亚,Dako CA), GFAP(1: 50稀释;表达载体,卡尔斯巴德,CA)、MMP3(1: 50稀释;表达载体,卡尔斯巴德,CA)或ZO-1(1: 50稀释;表达载体,卡尔斯巴德,CA)。孵化后的主要抗体,幻灯片是清洗和孵化使二次抗体(1:200稀释;表达载体,卡尔斯巴德,CA)和安装在玻璃盖玻片Vectashield-containing DAPI核识别(向量实验室,伯林盖姆,CA)。幻灯片是在荧光显微镜成像和分析使用图像软件。 The average maximum intensity was calculated, and this value was used as the measurement threshold. Next, ten fields were selected at random, and the average of the maximum and mean intensities were calculated correcting for the background threshold. Three images per animal were assessed.

2.12。MMP3水平的检测

MMP3血清水平和培养BMVECs MMP3蛋白质表达水平也决定使用特定的酶联免疫试剂盒遵循制造商的指令(酶联免疫试剂盒Abcam;ab203363)。50μL血清(稀释100倍)和细胞培养上清液或标准与抗体鸡尾酒加在一起,适当的井。孵化后1小时在室温下平板振动器设置为400 rpm,微型板块是洗3次。此外,100年μL(三甲衬底被添加到每个。最后,OD被记录在450海里后停止反应通过增加100μL停止解决方案。

2.13。统计分析

所有的数据都显示为 。Shapiro-Wilks决心是正常的数据测试,和未配对 - - - - - -测试被用于比较两组。比较多个组,单向方差分析与图基的多个测试或双向方差分析比较Bonferroni事后考验进行根据实验变量的数量。小动物——一张长有小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。数据可视化和分析使用SPSS 17.0版(纽约阿蒙克)和GraphPad棱镜版本8.0.0 (CA)圣地亚哥。

3所示。结果

3.1。MMP3 BMVECs中高度表达

测量MMP3 mRNA (1 vs。 , ;图2(一个))和蛋白质丰度( vs。 , ;图2 (b))确认MMP3-KO突变BMVECs MMP3水平和星形胶质细胞明显减少。然而,测量在WT老鼠表明MMP3 BMVECs的表达明显高于原发性星形胶质细胞或微血管内皮细胞(MVECs)与心脏、肺、肾、脾(1 vs。 vs。 vs。 vs。 , )图2 (c)),这表明在BMVECs MMP3可能有一个独特而重要的作用,不同于其在ECs的角色从其他器官。因此,我们开始调查是否MMP3调节BBB完整性通过监测MMP3-KO小鼠异氟烷麻醉的影响( ),在WT老鼠( )(数据3(一个)和3 (b)),在WT老鼠一直在接受静脉注射重组人类MMP3 (WT + MMP3; )(体重: , ,和 ,分别 , )。在WT评估老鼠相比,麻醉诱导时间的测量高MMP3-KO老鼠( vs。 ; ;图3 (c))和低WT + MMP3老鼠( vs。 ; ;图3 (c)),麻醉MMP3-KO老鼠的出现时间短( vs。 ; ;图3 (d)在WT + MMP3老鼠(),时间更长 vs。 ; ;图3 (d)),异氟烷使用卷在MMP3-KO大鼠( vs。 ; ;图3 (e))和WT + MMP3小老鼠( vs。 ; ;图3 (e))。因此,MMP3似乎对异氟烷麻醉的易感性增加。

3.2。MMP3促进小鼠的BBB通透性

之间的关系来确定MMP3表达和异氟烷麻醉是由BBB通透性的变化,老鼠系统注射伊文思蓝染料或sodium-FITC和麻醉;然后,染料通过盐水从血管中清除,溢出的染料进入大脑实质是评估(22,37]。小伊文思蓝外渗的证据在MMP3-KO老鼠的大脑,和MMP3治疗明显增加了WT伊文思蓝的老鼠的大脑(图4(一))。此外,伊文思蓝( 每克组织vs。 每克的组织; ;图4 (b))和sodium-FITC ( 每克组织vs。 每克的组织; ;图4 (c))在MMP3-KO鼠脑水平明显下降,并显著大于WT + MMP3鼠脑( 每克组织vs。 每克的组织; ; 每克组织vs。 每克的组织; ;数据4 (b)和4 (c)),比WT老鼠的大脑。总的来说,这些观测表明,MMP3可能调节BBB通透性。

3.3。MMP3调节BMVEC单层膜的完整性在体外

MMP3的潜在作用BBB通透性也被评估在体外通过使用电子细胞基质阻抗传感系统(欧洲互通性系统委员会8 w10e +数组)来衡量transendothelial电阻(te)层的MMP3-KO或WT BMVECs。因为电阻测量是与膜透性负相关,显著降低测量观察isoflurane-treated (30μL /毫升)WT细胞比WT细胞,用生理盐水治疗表明,异氟烷温和BMVEC渗透性增加。电阻测量在MMP3-KO BMVECs也拒绝回应异氟烷治疗,但不明显,测量明显大于MMP3-KO BMVECs WT BMVECs不管治疗(数据5(一个)和5 (b))。此外,生理盐水和电阻测量isoflurane-treated WT BMVECs大幅下降,当细胞被激活cotreated MMP3 (150 ng / mL)和显著增加当isoflurane-treated WT BMVECs cotreated MMP3的抑制剂N-isobutyl-N - (4 - methoxyphenylsulfonyl)氨基乙酰基异羟肟酸(NNGH;25μ米)(图5 (c)和5 (d))。

更准确地模仿在活的有机体内条件下,渗透率也进行了评估与cocultures刚孤立的老鼠BMVECs和初级老鼠星形胶质细胞。细胞生长在Transwell室,室被停职的井6-well板;然后,FITC-dextran (Dextran-blue-3KD和Dextran-red-40KD)添加到Transwell室,渗透率是评价通过测量强度的葡聚糖荧光板井。测量显著降低在cocultures MMP3-KO BMVECs比cocultures WT BMVECs和显著增加WT BMVEC cocultures MMP3治疗后。此外,测量在WT和MMP3-KO BMVEC cocultures治疗后显著增加与脂多糖(LPS);100年μg / mL)激发MMP3活动扰乱了BBB,但仍显著低于LPS-treated MMP3-KO cocultures比LPS-treated WT cocultures,渗透性增加和LPS-induced观察WT cocultures被cotreatment废除NNGH(数字5 (e)和5 (f))。总的来说,来自我们的te和Transwell化验的结果表明MMP3增加BMVEC MMP3-KO渗透性和符合我们的观察,WT、WT + MMP3老鼠。

3.4。MMP3调节TJ蛋白和粘附分子的丰度调制ERK通路活动

BBB的选择性渗透至关重要的是依赖的形成紧密连接(套)和(能)[粘合连接处并且38];因此,我们调查是否MMP3可能增加BBB通透性通过扰乱TJ蛋白的表达ZO-1, occludin, claudin-5,以及AJ蛋白质血管内皮钙粘蛋白(VE);实验用主要BMVECs隔绝MMP3-KO老鼠的大脑或其WT同窝出生的。值得注意的是,激活MMP3治疗并没有改变在WT BMVECs MMP3表达式;然而,所有四个结蛋白的表达显著低于MMP3-treated WT BMVECs和大大增强MMP3-KO BMVECs,比在WT BMVECs MMP3治疗数据6(一)- - - - - -6 (f))。ZO-1表达式也是评估通过免疫荧光BMVECs被孵化的原发性ZO-1抗体和荧光二次抗体(图6(g)):测量荧光强度显著下降在WT细胞治疗后与MMP3 MMP3-KO细胞明显大于没有MMP3的WT细胞治疗(图6(h))。

ERK1/2通路诱导BBB研究通过改变组成套(15,16];因此,我们调查是否ERK在MMP3-regulated TJ蛋白表达的作用通过比较测量BMVECs用生理盐水或ERK抑制剂治疗。实验与WT和MMP3-KO BMVECs,既然MMP3的表达在WT BMVECs并未改变细胞重组MMP3处理时,MMP3表达调节通过治疗有限合伙人(100μg / mL)。LPS诱导ERK的磷酸化BMVECs,感应被MMP3 KO或阻止ERK抑制剂的使用。p-ERK丰度也在所有MMP3 KO组低于WT组和WT BMVECs ERK抑制并没有改变MMP3表达式要么有或没有伴随的有限合伙人治疗,但措施TJ蛋白表达明显高于在细胞治疗ERK抑制剂单独或cotreated比saline-alone ERK抑制剂和有限合伙人或saline-LPS治疗组,分别。抑制ERK和LPS处理改变MMP3表达式,ERK激活,或TJ蛋白表达MMP3-KO BMVECs,但TJ蛋白水平明显高于在WT BMVECs(数字7(一)- - - - - -7 (f))。因此,MMP3似乎减少BMVEC单层膜的完整性,至少部分移植ERK信号,随后减少结蛋白的丰度。

4所示。讨论

我们所知,本文提供的研究首次证明MMP3不足抑制,而治疗激活MMP3提高,异氟烷麻醉小鼠。BBB通透性也量化在老鼠的大脑通过静脉注射染料的溢出(伊文思蓝和钠FITC)和层的BMVECs通过三通和Transwell化验:屏障完整性也显著大于MMP3-KO老鼠的大脑和层的MMP3-KO BMVECs WT老鼠和WT BMVEC单层膜相比,分别,而MMP3 upregulation减少BBB的完整性在活的有机体内和BMVEC单层膜的完整性在体外。值得注意的是,异氟烷显著降低te WT BMVECs评估单层膜的完整性,但不是MMP-KO BMVECs,和治疗MMP3夸大isoflurane-induced BMVEC屏障功能障碍,但不是在NNGH MMP3抑制剂,这表明异氟烷的BBB通透性也可能增加MMP3-dependent地。此外,MMP3激活ERK信号和MMP水平负相关BMVECs TJ和AJ蛋白质的丰度,但当这些细胞被cotreated ERK抑制剂。综上所述,我们的实验结果与WT MMP3-KO老鼠和BMVECs表明MMP3 BBB通透性增加,这种效应可能至少部分由ERK途径活性和ERK-induced inter-EC中断连接(图8)。

在活的有机体内评估MMP在技术上具有挑战性的活动,这可以部分解释为什么从先前的调查结果被基质金属蛋白酶切断的内皮屏障功能有限,有些不一致。例如,MMP2和MMP9表达下调ZO-1表达和增强BBB通透性,以应对局部脑缺血再灌注损伤(39),但缺MMP9没有减少中断期间的BBB病毒性脑脊髓炎(40]。MMP3的角色在BBB维护研究更少,但我们观察到MMP3 BBB通透性增加减少几个结蛋白的表达,包括ZO-1 claudin-5, occludin,符合以前的报告,MMP3扰乱blood-spinal绳障碍(41]。此外,ERK信号似乎规范TJ蛋白表达在老鼠的近端附睾42),研究结果表明,MMP3-induced TJ蛋白水平下降是强烈依赖于ERK激活:ERK的磷酸化水平与MMP3活动相关的积极和消极TJ蛋白水平,并抑制ERK TJ WT BMVEC单层膜中蛋白质含量增加,但不是在层的MMP3-KO BMVECs。ERK的磷酸化机制联系中断的BBB联接的蛋白质是未知的,但可能包括泛素连接酶复杂,目标磷酸化蛋白质的降解(43];这些主题将在将来的研究中得到解决。

基质金属蛋白酶对正常脑功能至关重要,但高浓度的MMP的表达被认为导致中枢神经系统病理条件下通过破坏神经血管单元和扰乱BBB,也许通过TJ和基底膜蛋白的降解13,44]。氧化应激也与基质金属蛋白酶的激活和BBB[受损45]。几项研究表明MMP2和MMP9可能导致BBB分解(13,17)——例如,MMP9似乎调解TJ的丧失稳定观察小鼠1,2-dichloroethane-induced脑水肿(46)——我们发现MMP3 BMVECs的mRNA水平高得多的比MVECs从其他器官(如心、肺、脾和肾)表明,它可能有一个在BMVECs独特而重要的作用,尤其是许多ECM蛋白质形成大脑血管的基板可以通过MMP3 proteolysed [19]。异氟烷也与BBB破坏(47,48),但可以通过维护预防急性肺损伤内皮屏障的完整性(11),所以异氟烷对BBB通透性的影响仍不清楚。

这项研究的重要发现之一是,MMP3麻醉敏感度升高和BBB开放。因为BBB的主要监管机构末梢循环和大脑之间的交换,和是关键表面通过该系统管理药品进入中枢神经系统(8),BBB的复杂性提供了许多独特的药的机会。因此,我们的研究结果表明,MMP3可能是一个有用的辅助治疗提高其他神经病治疗的功效49),这样就可以减少副作用的发生和/或严重性(以及成本)通过使患者治疗低剂量的主要治疗(35,50]。然而,BBB通透性的增加也会使血液中的免疫细胞进入大脑,引起神经炎症反应(51),越来越多的证据表明,BBB破坏与大脑炎症相关疾病如阿尔茨海默氏症和多发性硬化症52]。氧化应激也涉及MMP的激活和血脑屏障损伤53]。然而,尽管巨大的努力,中枢神经系统药物发现仍然依赖于提高BBB和中枢神经系统治疗的成功发展取决于技术调制BBB通透性和药物分布的动力学,以确保最佳的中枢神经系统渗透(35]。

不像其他基质金属蛋白酶,MMP3主要是用ECs表达,我们的结果表明,它是更多的大脑比其他器官中高度表达;然而,我们的在活的有机体内与全球MMP3-KO实验老鼠,所以我们观察这些动物可能是受到的损失non-ECs MMP3的表达情况,以及BMVECs。此外,由于直接MMP3政府没有增加BMVECs MMP3水平,有限合伙人被用来移植MMP3表达我们的体外研究,因此,我们不能排除潜在MMP3-independent TJ有限合伙人的稳定作用。未来的研究将解决这些局限性进行实验EC-specific MMP3-KO小鼠,通过调查其他MMP3抑制剂的使用,并通过确定有限合伙人如何调节MMP3表达和BBB的完整性。

5。结论

总之,这里给出的结果是第一次揭示BBB MMP3的功能,表明大脑微脉管系统的至关重要的作用,不同于它的功能在其他船只。我们已经表明,MMP3 BBB通透性增加通过上调ERK信号通路,后来减少了TJ和AJ BMVECs蛋白质丰度。氧化应激往往导致BBB的障碍。由于BBB的主要监管机构外周血和大脑之间的交流,我们的观察可能具有重要意义和其他中枢神经系统疾病治疗神经炎症条件涉及内皮MMP3通路。

数据可用性

数据请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

秦和Rongxue构思研究设计和写的手稿。秦执行实验帮助梅、克里斯蒂安和艾伯特,尼古拉。秦分析数据。琼,约翰和JK审核并导致了写作的手稿。Rongxue监督的研究。所有作者阅读和批准了最终版本的手稿。

资金

吴Rongxue支持1 r01hl140114-01a1。詹姆斯·k·廖HL136962支持。

确认

我们想感谢斯蒂芬妮·贝瑟仔细审查的手稿和统计咨询和w·凯文•梅斯纳博士、编辑援助。成像工作是芝加哥大学的集成光学显微镜的核心设备,由吴Rongxue CTSA-ITM核心支持补贴资金,芝加哥大学(通过国家卫生研究院UL1 TR000430)。M手稿提交研究广场。吴Rongxue支持芝加哥DRTC (NIH / e DK020595)和CTSA-ITM核心补贴资金(通过国家卫生研究院UL1 TR000430)。

补充材料

星形胶质细胞的主要文化和识别。BMVECs的主要文化和识别。补充结果:识别和形态学主要培养的星形胶质细胞和BMVECs。补充图1。(补充材料)

引用

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