文摘
自身免疫性肝炎(AIH)是一种肝脏的炎症性自身免疫性疾病。氧化应激引起的活性氧自由基是一种常见的许多肝脏疾病的发病机制,病理生理基础和ferroptosis与有毒活性氧的积累。负责铁处理的信号转导途径和脂质过氧化作用机制被认为ferroptosis开车。然而,调节ferroptosis中用的具体机制还不清楚。这次调查的目的是确定ferroptosis的可能的效应函数,基于谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)规定在一个S100-induced自身免疫性肝炎小鼠模型和肝细胞损伤模型。S100肝脏antigen-induced AIH小鼠模型是用来检测ferroptotic生物标志物使用西方墨点法。调节水平的cyclooxygenase2 (COX2)和Acyl-Coenzyme合成酶长链家人4 (ACSL4)观察S100-induced AIH模型组,而GPX4水平和铁蛋白重链1 (FTH1)表达下调( )。COX2的表达谱,ACSL4 GPX4, FTH1 ferrostatin-1管理后恢复。此外,Nrf2和HO-1水平S100-induced AIH模型小鼠治疗后与ferrostatin-1表达下调与nonferrostatin-1-treated S100-induced AIH模型小鼠( )。此外,COX2和ACSL4水平显著调节,与AIH,差别显著FTH1对这些模型小鼠肝脏特异性GPX4沉默时使用AAV8结构。这些数据表明,抑制ferroptosis显著改善AIH的影响在核因子E2-related因子2 (Nrf2) /血红素oxygenase-1 (HO-1)信号通路,ferroptosis可能充当发起者或导致AIH中间调停人。
1。介绍
自身免疫性肝炎(AIH)的特征是炎症、自身抗体的存在,hypergammaglobulinemia,和接口肝炎(1]。在女性中更为常见,似乎在增加患病率增加。慢性肝脏疾病是一种严重威胁健康,因此经济后果(2]。虽然AIH的致病的机制还不清楚,鼠标AIH模型引起的肝脏特异性抗原S100 AIH被广泛用于研究[3]。
通常,小鼠腹腔注射等量的肝脏S100抗原与完全弗氏佐剂乳化和混合第0天、第七天显示显著的肝脏炎症和自身免疫免疫球蛋白升高。尽管先前的研究已经涉及遗传易感性、分子模仿,以及外部因素在AIH发病机理4),确切发病的机制仍不清楚。因此,负责AIH的潜在机制的深入研究可以帮助AIH的新疗法的发展。
Ferroptosis被定义为iron-dependent细胞死亡由磷脂过氧化反应。Ferroptosis铁代谢涉及铁储存蛋白质铁蛋白特异表达的结果,由铁蛋白轻链(FTL)和铁蛋白重链1 (FTH1) [5]。自从FTH拥有铁氧化酶活动,它将二价铁(Fe2 +氧化铁(Fe)3 +)形式,允许绑定铁铁蛋白外层,从而降低了游离铁的浓度在细胞(6]。高水平的自由铁与脂质过氧化作用有关。有几种机制参与脂质过氧化反应的预防包括谷胱甘肽过氧化物酶的作用4 (GPX4)进行磷脂过氧化物作为一种保护措施对ferroptosis [7]。不正常的铁代谢和脂质过氧化作用被认为在ferroptosis扮演关键的部分。此外,脂质过氧化作用是影响频谱不同的脂质和酶(8]。尽管脂质过氧化充当关键过程ferroptosis开车,脂质代谢的监管者ferroptosis尚不清楚(9]。Acyl-Coenzyme合成酶长链家人4 (ACSL4)是至关重要的在铁链癌细胞凋亡。ACSL4表达式ferroptosis-resistant细胞已被证明是显著降低(10]。因此,ACSL4参与多不饱和脂肪酸氧化的催化作用。这种酶lysophosphatidylcholine酰基转移酶3(选区T3)介导lipotoxicity ferroptosis [10- - - - - -12]。此外,一些细胞内信号通路在ferroptosis扮演关键的部分。例如,调查涉及ferroptosis在病理条件下在不同的器官,包括大脑、肾脏,肝脏和心脏13]。Ferroptosis在铁和活性氧的积累(ROS)和抑制XC的活动——通过减少半胱氨酸和GPX4系统吸收和使用谷胱甘肽(14]。脂质过氧化作用的有害行为在实际ferroptotic过程中可以通过lipophilic-free抑制激进的陷阱(如维生素E, ferrostatin-1和liproxstatin-1)。然而,在AIH ferroptosis的影响尚不清楚。核转录因子erythroid-related因子2 (Nrf2)是一种转录因子,保持强调细胞内环境的稳定和体内平衡,而且,虽然它似乎是参与,其潜在的作用机制是未知的15]。越来越多的证据牵连Nrf2 ferroptosis发病机理(16]。在我们目前的研究中,血红素oxygenase-1表达式被发现显著增加肝脏的S100-induced AIH老鼠,而其他的研究表明,过度Nrf2 / HO-1刺激可以导致ferroptosis通过扰乱铁离子的平衡(17,18]。在这里,我们假设ferroptosis扮演关键的角色Nrf2 / HO-1信号S100-induced AIH。因此,在当前的调查,ferroptosis AIH鼠标模型及其机制进行评估以确定其在AIH可能的致病作用,生成AIH患者的新疗法。
2。材料和方法
2.1。动物模型
雄性C57BL / 6 WT小鼠称重第23 - 25 g从杭州探月购买实验动物技术有限公司有限公司(中国)。研究和动物处理动物政策和福利委员会批准温州医科大学(批准文件号wydw2020 - 0861)。老鼠的护理是依照NIH指南(指导实验室动物保健和使用)。老鼠被安置在一个无菌的环境12:12 h明暗骑车和美联储在标准啮齿动物食物。所有的老鼠都可以适应新环境至少14天前开始AIH的建模。十个实验小鼠随机选择得到的腹腔内注射S100注入,因此,包括鼠标AIH模型组。
2.2。制备小鼠肝脏组织
准备肝脏特异性抗原S100、三个老鼠被随机选择和牺牲在戊巴比妥钠麻醉。肝脏灌注了磷酸盐(PBS)和删除(如前所述)和用于准备新鲜S100抗原(3]。简而言之,肝脏在预冻PBS均质,后跟一个60分钟的离心150 g。60分钟的上层清液进一步离心机的离心器(100)000克(3]。的S100-containing上层清液集中到5毫升通过Amicon®Ultra-15超滤系统(美国微孔),其次是分离一个AKTA纯(美国通用电气医疗集团)90厘米CL-6B琼脂糖®列(法玛西亚、美国)。从列筛选了三个蛋白峰,峰2有害成分和峰1和3所需的和无毒的组件,分别的肝抗原。蛋白质分数从第一高峰使用的浓度0.5 - -2.0 g / L。AIH模型的建立,肝S100抗原是用同等体积的弗氏完全佐剂乳化(Solarbio,中国)和用于接种10老鼠相同的批处理腹腔内第0天、第七天(图1(一))。在建模中,两个AIH模型组小鼠的死亡。注射后4周,小鼠戊巴比妥钠麻醉下牺牲了。血液样本收集和离心机在4°C 3000 rpm 15分钟得到血清。肝脏样本固定在4%多聚甲醛对免疫组织化学和组织学检查或冻结在-80°C。
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2.3。Ferrostatin-1治疗的老鼠
10用传统控制老鼠啮齿动物食物和水在建模阶段。实验进一步证明ferroptosis发生在S100-induced AIH和干预是否ferrostatin-1干预能够改善它。实验组接受腹腔内注射的老鼠ferrostatin-1(1毫克/公斤体重5% DMSO) (19]。
以下实验团体使用:(i)正常对照组,(ii) S100-induced AIH模型组,(iii)正常小鼠+ Ferrostatin-1干预组,及(iv) S100-induced AIH + Ferrostatin-1治疗组。总共40实验老鼠与每组10只老鼠一起使用。AIH模型建立了如上所述。Ferrostatin-1腹腔内注射,如图2(一个),使用相同的剂量和程序对正常和AIH老鼠。Ferrostatin-1干预完成后,四组的小鼠戊巴比妥麻醉下牺牲的同时,收集和血液样本和肝脏组织进行进一步的实验分析。
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2.4。AAV8-m-GPX4治疗的老鼠
AAV8-m-GPX4用于基因表达沉默GPX4调查是否S100-induced ferroptosis在AIH GPX4表达式。实验小组如下:(i)正常小鼠+ AAV8-m-GPX4组,(2)AIH + AAV8-m-GPX4集团(iii)正常小鼠+ AAV8-negative对照组,及(iv) AIH + AAV8-negative对照组。共40个老鼠与每组10只老鼠一起使用。的时机AAV注入如图3(一个)。4周后第一个S100的腹腔内注射,四组老鼠都牺牲了,血液和肝组织提取样本进行进一步的实验分析。
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2.5。他走时染色
肝脏组织和4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,5μ米的部分。部分被苏木精和伊红染色())。淋巴细胞浸润程度、炎症坏死和破坏肝脏结构的光学显微镜下观察(奥林巴斯、日本)。
2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)
炎性细胞因子(TNF -的浓度α,干扰素γ,IL-17)、纤维化细胞因子TGF -β和抗炎细胞因子il - 10,扮演了一个重要的角色在AIH进展测量肝组织溶解产物。以下鼠标使用ELISA试剂盒,所有从Multisciences(阎连科)生物科技(杭州):TNF -α(EK282/3-48)、干扰素γ(EK280/3-48) IL-17 (EK217/2-48), il - 10 (EK210/4-48), TGF -β(EK981-48),根据制造商的指示。尽管不同的包有不同的测定方法,主要实验步骤是相似的。在此,我们使用TNF的测量αELISA方法的浓度作为一个例子。总之,TNF -α标准,空白的控制,和被测试样例(100μ信用证)被添加到96孔板。然后,添加50μl稀释的抗体(1:100稀释)。密封板与板在室温下密封膜和孵化为90分钟。洗后释放的生物素化的抗体,增加100μl标记Streptavidin-HRP每个(1:100稀释)和孵化在室温下30分钟。洗后,增加100μl衬底三甲每个孵化在室温下15分钟,避免光。反应被终止终止试剂和光学密度(OD)值是衡量一种酶标记的波长450纳米。细胞炎症因子的浓度是使用标准吸光度的标准曲线回归方程计算值。
2.7。免疫印迹分析
肝脏组织中均质裂解缓冲。离心后,溶解产物的蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(P0012 Beyotime,中国),符合制造商的协议。等量(50μg)的蛋白质sds - page分离和转移到PVDF膜(微孔)。5%脱脂奶的膜被封锁Tris-buffered盐水与0.1%渐变20 (TBST)和孵化抗体COX2(1: 1000年,12375 - 1 - ap, Proteintech), ACSL4(1: 1000年,A16848 ABclonal) GPX4(1: 1000年,BM5231博士德),FTH1(1: 1000年,A19544 ABclonal), Nrf2(1: 1000年,16396 - 1 - ap, Proteintech), HO-1(1: 1000年,10701 - 1 - ap, Proteintech),或GAPDH(60004 - 1 - 1: 000,美联社,Proteintech)一夜之间在4°C。洗后,膜被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体兔子和老鼠免疫球蛋白g(1: 5000年,LF101 LF102,分别Epizyme)在室温下1小时。一个Bio-Rad免疫印迹分析检测系统(美国Bio-Rad大力神,CA)是用于可视化。蛋白质带密度被ImageJ分析软件评估,和相对密度对加载控制(GAPDH)计算。
2.8。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
从均质肝组织总RNA收集试剂盒®试剂,1 g总RNA reverse-transcribed进cDNA使用PrimeScript RT大师混合®(完美的实时)工具包(RR036A、豆类、日本)。定量聚合酶链反应进行的10μL反应混合物包含特定的引物和TBGreen预混料交货Taq II。放大了的实时荧光定量PCR系统(AB 7500)。使用的引物包括以下:
ACTB (5 - - - - - -CCTCACTGTCCACCTTCC-3 ,5 - - - - - -GGGTGTAAAACGCAGCTC-3 ),
Nrf2 (5 - - - - - -TCTTCACTGCCCCTCATC-3 ,5 - - - - - -CTCCTGCCAAACTTGCTC-3 ),
HO-1 (5 - - - - - -ACAGCCCCCCACCAAGTTC-3 ,5 - - - - - -GGCGGTCTTAGCCTCTTC-3 )。
数据集使用7500实时PCR系统软件进行评估。肌动蛋白用于规范化水平。三个技术复制每个RT-qPCR进行分析。
2.9。免疫组织化学(包含IHC)
免疫组织化学进行石蜡包埋老鼠肝脏部分。的半定量的包含IHC数据集是基于平均每组三个老鼠。从每个鼠标评估三个部分,收集的成像光学显微镜(日本奥林巴斯)。染色强度进行了分析使用ImageJ软件,和三个显微镜字段随机计算集成光密度(IOD)为目标蛋白质。
2.10。血清转氨酶和免疫球蛋白分析
从血液样本血清收集在250 g离心10分钟。Serumalanineaminotransferase (ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)浓度进行了分析使用全自动生化分析仪,在制造商的协议(美国雅培公司,芝加哥,IL)。血清免疫球蛋白含量测定用鼠标酶联免疫试剂盒(EK271-48 Multisciences)。所有实验都是按照制造商的指示执行。
2.11。脂质过氧化丙二醛(MDA)测定
组蛋白分离使用脂质过氧化丙二醛测定试剂盒(S0131 Beyotime,中国)。每个样本的丙二醛(MDA)浓度测定在532 nm使用酶标记(热Multiskan MK3,热费舍尔,沃尔瑟姆,妈,美国),和490海里被用作控制。
2.12。铁负荷试验
组蛋白分离使用铁化验设备协议(ab83366 Abcam,剑桥,英国)。肝组织(10毫克)被prechilled PBS和均质与铁的4到10部分分析缓冲区使用冷冻道斯均质器(10 - 15通过)。样品在16 000 g离心10分钟。上层清液的收集和转移至干净的离心管。试验井处理100人μL标准稀释和样本。铁剂(5μL)被添加到每个。kit蛋白标准和组织原液混合,添加到混合物30分钟在恒温培养箱37°C。一百毫升水中的铁探测器被添加到所有井含铁标准和测试样品。样本混合和孵化37°C为60分钟,远离光线。吸光度测定的酶比色标准之后立即(OD 593海里)。
2.13。细胞培养
α老鼠肝12 (AML12)细胞在DMEM培养/ F-12(1: 1)中含10%胎牛血清40 ng / mL的地塞米松和1% insulin-transferrin-selenium-ethanolamine(它的x) 37°C公司5%2湿润恒温培养箱。当细胞达到70% - -80%融合,小干扰rna和非特异性控制siRNA GPX4-specific击倒,以及GPX4-specific超表达质粒和非特异性控制质粒,转染了Lipofectamine 2000试剂(热费希尔)严格按照制造商的说明。转染后,上层的丢弃,孵化是继续OPTI介质(Gibco,热Fisher) 6小时后跟孵化48小时在DMEM / F12完全培养基含有脂多糖(5 ug /毫升)。小干扰rna (5 GPX4-specific击倒 - - - - - -CUGACGUAAACUACACUCATT-3 ,5 - - - - - -UGAGUGUAGUUUACGUCAGTT-3 )和非特异性控制核(5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ,5 - - - - - -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3 ),和GPX4-specific超表达质粒和非特异性控制质粒从GenePharma购买(上海,中国)。
2.14。免疫荧光
AML12细胞培养48小时12-well盘子。达到大约80%融合后,这些细胞被洗prechilled PBS和与4%多聚甲醛固定15分钟,其次是透化作用与0.5% Triton x - 100在PBS为20分钟。细胞被屏蔽5% BSA在37°C 1 h和孵化与相应的抗体主要在一夜之间在4°C。第二天,Alexa萤石488 -标记的样本孵化山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体(1:1000、33106 es60 Teasen生物科技、上海、中国)1 h在黑暗中在室温下,紧随其后的是孵化与DAPI 5分钟。三个地区字段的视图被随机选中每个荧光部分在ortho-fluorescent显微镜下观察(德国徕卡),实验组的盲法。
2.15。统计分析
统计分析采用GraphPad®8.6.3软件。所有的研究进行了三次,被随机分配。的 - - - - - -测试未配对的结果是用于比较分析。数据集被表示为 ,与 被认为具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Ferroptosis扮演关键的角色S100-Induced AIH
实验设计的建立S100-induced AIH模型如图1(一)。的ALT和AST水平明显提高AIH组和免疫球蛋白水平增加(数据1 (b)- - - - - -1 (d))。组织病理学)染色显示S100-induced AIH导致炎性坏死的许多领域,增加淋巴细胞浸润和破坏肝结构(图1 (e))。ELISA分析表明,炎性细胞因子的浓度TNF -α,干扰素γ,IL-17和纤维化细胞因子TGF -β水平显著增加AIH肝脏的小鼠和对照组相比,而抗炎细胞因子il - 10水平明显降低(图1 (f); )。免疫印迹和免疫组织化学分析也用于检测ferroptosis在自身免疫性肝炎的发生。免疫印迹结果显示调节COX2的表达和ACSL4 AIH实验组,而GPX4的表达和FTH1严重表达下调(数字1(我)和1 (j); )。免疫组织化学结果显示,COX2在控制小鼠肝细胞染色较弱,而COX2在肝细胞显著增加S100-induced AIH。GPX4染色是在控制老鼠的肝细胞,S100-induced自身免疫性肝炎模型组,GPX4表达显著降低(数字1 (g)和1 (h); )。因此,我们的研究结果建议在S100-induced ferroptosis自身免疫性肝炎的发生。
3.2。Ferrostatin-1 Ferroptosis抑制剂,极大地提高了S100-Induced自身免疫性肝炎
Ferrostatin-1 ferroptosis抑制剂,用于调查ferroptosis是否起到了很重要的作用在S100-induced AIH。实验协议如图2(一个)。水平的ALT, AST,免疫球蛋白明显提高AIH组比空白对照组(数字2 (b)- - - - - -2 (d); )。Ferrostatin-1治疗后,S100-induced自身免疫性肝炎组显著降低ALT、AST,免疫球蛋白水平相比S100-induced自身免疫性肝炎模型组( )。组织学)染色表明Ferrostatin-1有效减毒肝损伤,保护肝脏结构和有限的肝脏炎症淋巴细胞浸润。Ferrostatin-1减毒S100-induced炎症治疗自身免疫性肝炎组相比S100-induced自身免疫性肝炎模型组(图2 (e))。ELISA分析表明,Ferrostatin-1逆转的调节表达炎性细胞因子TNF -α,干扰素γIL-17,纤维化细胞因子TGF -β和抗炎细胞因子il - 10在肝脏S100-induced AIH老鼠在某种程度上(图2 (f); )。免疫印迹显示Ferrostatin-1显著调节GPX4和FTH1显著下调COX2和ACSL4(数字2 (g)和2 (h); )。与此同时,免疫组织化学结果表明COX2的表达在肝细胞显著增加S100-induced AIH相比控制。然而,COX2的表达显著抑制S100-induced AIH Ferrostatin-1治疗后组。此外,Ferrostatin-1治疗显著增加GPX4表达肝细胞(数字2(我)和2 (j); )。脂质过氧化反应的丙二醛测定,Ferrostatin-1减少MDA水平S100-induced AIH组(图2 (k); )在某种程度上也逆转后在小鼠肝亚铁离子的水平升高AIH感应(图2(左); )。我们的发现进一步表明ferroptosis与S100-induced AIH, Ferrostatin-1改善S100-induced自身免疫性肝炎的作用。
3.3。通过Nrf2 Ferrostatin-1改善S100-Induced AIH / HO-1信号通路
Nrf2扮演了一个主要部分在保护细胞免受氧化应激。西方墨点法和RT-qPCR分析表明,蛋白质和信使rna表达水平的Nrf2和HO-1 S100-induced AIH组增加。然而,更值得注意的是,S100-induced AIH显著抑制Nrf2和HO-1 Ferrostatin-1治疗后蛋白质和mRNA水平相比S100-induced AIH模型组(数字4(一)- - - - - -4 (e); )。
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3.4。恶化的S100-Induced GPX4击倒后自身免疫性肝炎
两种病毒,AAV8-m-GPX4和AAV8-EGFP从HANBIO[购买20.]。HANBIO构造由GPX4击倒序列腺相关病毒(AAV)。四十雄性C57BL / 6小鼠被随机分为四组,(我)数控+ AAV8-m-GPX4, (ii) AIH + AAV8-m-GPX4,(3)数控+ AAV8-EGFP,及(iv) AIH + AAV8-EGFP,每组10只老鼠。每个鼠标被注射 病毒的复制。实验协议转染AVVs和建立S100-induced小鼠自身免疫性肝炎模型如图3(一个)。
AAV8-m-GPX4用于干扰GPX4的表达在S100-induced击倒正常控制和自身免疫性肝炎模型验证的作用GPX4蛋白质S100-induced AIH ferroptosis发展。的表达ALT, AST,免疫球蛋白在AIH + AAV8-m-GPX4组相比显著增加数控+ AAV8-m-GPX4集团(数字3 (b)- - - - - -3 (d); )。然而,值得注意的是,数控+ AAV8-m-GPX4组显示略高表达的ALT, AST,免疫球蛋白比数控+ AAV8-EGFP集团( )。此外,他走时病理染色的结果表明,肝损伤,肝脏结构破坏,在AIH肝脏淋巴细胞浸润更严重+ AAV8-m-GPX4组相比AIH + AAV8-EGFP组。数控+ AAV8-EGFP组相比,数控+ AAV8-m-GPX4组显示轻微肝损伤和肝淋巴细胞浸润H&E-stained部分(图3 (e))。此外,ELISA分析表明,炎性细胞因子肿瘤坏死因子的水平α,干扰素γIL-17,纤维化细胞因子TGF -β在某种程度上增加AIH + AAV8-EGFP组小鼠的肝脏与数控+ AAV8-EGFP组相比,在抗炎细胞因子il - 10的水平降低了。GPX4击倒后,炎性细胞因子的表达TNF -α,干扰素γ,IL-17和纤维化细胞因子TGF -β是调节在更大程度上的肝脏AIH + AAV8-m-GPX4组比AIH + AAV8-EGFP组,而抗炎细胞因子il - 10水平显著下调(图3 (f); )。此外,免疫印迹显示,数控+ AAV8-EGFP组相比,COX2蛋白表达和ACSL4强烈AIH + AAV8-EGFP组的增加,虽然GPX4的蛋白表达和FTH1表达下调。COX2和ACSL4水平的增加更大的AIH + AAV8-m-GPX4组与AIH + AAV8-EGFP组GPX4击倒后,虽然FTH1的相关蛋白表达也显著降低(数字3 (g)和3 (h); )。肝细胞的免疫组织化学染色结果表明,COX2 AIH + AAV8-m-GPX4组显著增强AIH + AAV8-EGFP组相比,在GPX4染色肝细胞强烈降低前相比AIH + AAV8-EGFP组。此外,COX2在肝细胞染色略提高数控+ AAV8-m-GPX4组数控+ AAV8-EGFP组相比,在GPX4染色肝细胞减少相比数控+ AAV8-EGFP组在前(数字3(我)和3 (j); )。脂质过氧化反应的丙二醛测定MDA表达式GPX4击倒后的增加在一定程度上AIH模型组和S100感应(图3 (k); )。同时,GPX4击倒的亚铁离子的水平在一定程度上增加(图3(左); )。这表明在S100-induced ferroptosis自身免疫性肝炎可能通过GPX4监管。
3.5。通过GPX4 LPS-Induced Ferroptosis AML12细胞发生监管
进一步研究肝ferroptosis的机制,在AML12 LPS诱导肝细胞细胞进行了分析。
实验小组调查如下:(i)对照组,(ii) LPS-induced肝细胞ferroptosis模型组,(3)LPS-induced肝细胞ferroptosis集团GPX4-specific击倒后,(iv) LPS-induced小干扰rna转染肝细胞ferroptosis组特异性的控制后,(v) LPS-induced GPX4-specific质粒进行靶向治疗后肝细胞ferroptosis集团,和(vi) LPS-induced肝细胞非特异性控制质粒转染后ferroptosis集团。免疫印迹分析表明,COX2的蛋白质含量和ACSL4 LPS-induced肝细胞ferroptosis组显著提高,相比那些GPX4和FTH1(数字5(一个)和5 (b); )。此外,值得注意的是COX2的蛋白质含量和ACSL4增加小干扰rna转染GPX4-specific击倒后紧接着LPS-induced肝细胞相比ferroptosis LPS-induced肝细胞ferroptosis模型组,相比增加了更大的控制。水平的FTH1也下调GPX4击倒后在更大程度上。值得注意的是,与GPX4-specific转染后超表达质粒之后,相同浓度的LPS诱导肝细胞ferroptosis, COX2和ACSL4表达式表达下调相比LPS-induced肝细胞ferroptosis模型组,当控制相比,虽然FTH1的水平也增加GPX4超表达。
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(d)
细胞免疫荧光染色显示,COX2染色(绿色)是LPS-induced丰富的肝细胞ferroptosis模型组,主要定位在细胞质中。此外,GPX4击倒后紧接着LPS-induced肝细胞ferroptosis,有更强烈的COX2染色相比LPS-induced肝细胞ferroptosis模型组,而COX2染色后GPX4超表达其次是相同浓度的LPS-induced肝细胞ferroptosis LPS-induced相比明显降低肝细胞ferroptosis模型组(数据5 (c)和5 (d))。这些结果表明,GPX4调节的感应LPS-induced ferroptosis AML12细胞。
4所示。讨论
肝脏是主要的铁在体内存储的网站,与铁铁蛋白和含铁血红蛋白的形式。健康的肝脏,铁蛋白形式存储的主要形式,以最小的含铁血红素的可用性。然而,在iron-overloaded肝脏,有大铁蛋白和血红素的积累,特别是在遗传或继发性疾病(21]。有证据表明,铁蛋白的作用是捕获“免费”铁在其宽敞的存储的核心,因此,保护细胞免受活性氧自由基造成的潜在损害芬顿反应生成的(22]。最近的一些研究表明,氧化应激诱导的活性氧是潜在的病理生理机制在一些肝脏疾病(23]。高浓度的活性氧导致DNA损伤,蛋白质变性,脂质过氧化反应和环氧合酶(COX)和脂氧合酶(LOX),连同影响其他酶功能(24]。Ferroptosis,一种新发现的iron-dependent nonapoptotic细胞死亡,是生理和形态有别于细胞凋亡,necroptosis,自噬25]。也表现为自由二价铁过载和脂质过氧化物的积累。然而,过氧化脂质积累主要是由于缺乏,或活动不足,硒的过氧化物酶谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)。GPX4是一个独特的细胞内抗氧化酶抑制生产细胞膜的脂质过氧化作用[26]。考虑到铁的动态平衡是维护人类健康密切相关,在铁稳态扰动容易导致各种疾病(27]。这次调查关注的影响在AIH ferroptosis疾病及其可能的调节机制。
老鼠体内AIH模型使用S100成立,与治疗小鼠血清ALT和AST水平升高,表明肝损伤。海拔血清免疫球蛋白后28天表示AIH的存在。与此同时,炎性细胞因子肿瘤坏死因子的水平α,干扰素γIL-17,纤维化细胞因子TGF -β扮演重要角色在AIH的病理学和进展,都增加,而抗炎细胞因子il - 10水平下降,进一步表明肝脏炎症和纤维化的S100-induced AIH实验小鼠。特定的炎性细胞因子诱导特定转录因子的活动直接相关的免疫细胞的分化亚型(Th1和Treg细胞分泌干扰素γ和TGF -β分别,Th17细胞分泌IL-17) [28]。有越来越多的证据表明,IL-17和Th17细胞扮演关键角色的开发和进展AIH炎症和Th17细胞对身体很重要的防御反应(29日]。而细胞来源的肿瘤坏死因子-α没有具体阐明,也有一些研究表明TNF -α可能发布的激活单核细胞、T细胞、NK细胞、肥大细胞、B细胞和枯否细胞在肝脏30.,31日]。此外,组织学分析表明在肝脏炎性浸润S100干预后符合COX2的表达显著增加。全基因组CRISPR-based ferroptosis-resistant细胞系的遗传筛查和微阵列分析曾宣称ACSL4 ferroptotic过程中是一个关键分子的球员(12]。此外,稳定在正常细胞谷胱甘肽水平提供防止氧化应激和ferroptosis-driven细胞损伤。脂质过氧化可能增加由于GPX4表达减少或降低其代数余子式谷胱甘肽的水平(32]。iron-dependent ferroptosis发作,增加脂质ROS生产压倒GPX4控制多不饱和脂肪酸过氧化的能力,导致异常的脂质过氧化物,因此过氧化反应的控制,这是ferroptosis并导致细胞死亡的标志33]。几项研究已经证明,GPX4 ferroptosis的是一个主要的目标。有直接遗传证据表明GPX4淘汰赛中导致病理相关的细胞死亡形式的ferroptosis [34]。最近,它被触发ferroptosis表明,细胞死亡的淘汰赛GPX4肾脏或T细胞(35]。巧合的是,之前的研究表明,GPX4过度和可拆卸的调制多个ferroptosis抗病诱导剂的杀伤力,但不与其他细胞死亡机制相关的化合物(36]。击倒的FTH1肝癌细胞ferroptosis的发病率增加,表明FTH1可能在细胞ferroptosis起着重要的保护作用,减少体内平衡在铁商店ferroptosis发作可能导致铁过载(37]。因此,FTH1可能导致的异常表达与铁储存和细胞死亡有关的问题通过抗氧化防御系统的中断(38]。的S100-induced AIH模型组,在这个调查,显示upregulation COX2和ACSL4 GPX4和FTH1差别一起对这些。Ferroptosis是通过激活iron-dependent脂质过氧化(39]。因此,我们量化肝脏的脂质过氧化水平使用丙二醛(MDA)。COX2的失调,ACSL4、GPX4 FTH1表达式,以及MDA和铁过载的水平,表明一个重要的角色在S100-induced ferroptosis自身免疫性肝炎。
验证ferroptosis的角色,我们使用了ferroptosis抑制剂的治疗干预Ferrostatin-1 S100-induced AIH老鼠。发现Ferrostatin-1显著减毒ALT, AST,和血清免疫球蛋白水平,以及微观水平的炎症浸润在H&E-stained部分S100-induced AIH老鼠。此外,ferroptosis生物标志物的表达(包括ACSL4、GPX4和FTH1)被Ferrostatiin-1治疗显著降低。此外,iron-dependent ferroptosis氧化应激和脂质过氧化反应是常见的特性和炎性疾病40]。Ferrostatin-1 AIH老鼠肝脏MDA含量减少。因此,我们的数据清楚地说明,ferroptosis可能是主要的潜在机制,协调S100-induced自身免疫性肝炎。
Nrf2,主控制器的抗氧化反应,是一种转录因子,往往是异常调节氧化应激(41]。灭活的稳定性Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1) / Nrf2形成由硫醇抗氧化剂在胞质nonstress条件下(42]。然而,在氧化应激,Nrf2从Keap1的异质二聚体在细胞溶质,允许Nrf2把原子核,Nrf2与抗氧化反应元素(是)触发目标基因的转录(包括HO-1)减轻氧化应激(43]。在目前的研究中,S100诱导肝Nrf2 / HO-1表达增加鼠标AIH模型。此外,治疗ferrostatin-1逆转这些影响,表明ferrostatin-1可能减弱S100-induced AIH通过抑制Nrf2 / HO-1 pathway-mediated ferroptosis。这些数据表明,Nrf2 / HO-1通路在阻挠ferroptosis扮演着关键的角色。这凸显了ferroptosis在S100-induced AIH,与AIH ferrostatin-1改善条件,由Nrf2 / HO-1信号通路。
我们的调查深入研究AIH ferroptosis的可能机制。的规定GPX4在体内体外细胞实验和动物实验评估。被AAV8-m-GPX4 S100-induced AIH老鼠抑制GPX4 GPX4肝脏特异性击倒的基因表达。尾静脉注射AAV8-m-GPX4沉默GPX4表达导致血清ALT水平上升,AST,免疫球蛋白,以及增加炎症细胞的浸润。此外,ferroptosis生物标志物的表达(包括COX2、ACSL4和FTH1)显著增加小鼠S100-induced自身免疫性肝炎后特定的GPX4击倒。之前的研究表明,局部GPX4缺乏可导致脂质过氧化水平(44]。在最近的研究中,肝脏特异性GPX4击倒也增加了肝脏MDA和铁过量水平的S100-induced AIH老鼠。它最近表明,细胞死亡由于ferroptosis GPX4基因的缺失引起的肾脏(35]。提供的数据在我们的研究中明确表明GPX4关键是防止脂质过氧化作用的有害影响和ferroptosis自身免疫性肝炎。体外细胞实验使用GPX4-specific击倒核和GPX4-specific超表达质粒调节LPS-induced ferroptosis AML12细胞模型。发现其他ferroptosis生物标志物的表达(包括COX2、ACSL4和FTH1) GPX4击倒后明显增强。这次调查的结果,这些结果表明ferroptosis发起者或中介AIH的发病机理,这发生在AIH ferroptosis由GPX4监管。
5。结论
总之,我们的结果显示一个重要角色在S100-induced ferroptosis AIH发病机理。它也证明了Nrf2 / HO-1信号通路在抑制ferroptosis扮演一个关键部分。值得注意的是,S100-induced ferroptosis在AIH被发现与GPX4监管控制密切相关。这些结果增加我们的知识分子交互的底层AIH并建议方向发展的新的治疗策略来治疗这种疾病。
数据可用性
可用的数据将在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Lujian朱、陈Dazhi Lanman徐,永平陈导致概念、设计实验,并负责整个工作;阴朱Tongtong锅,Dingchao夏,Tingchen Cai,林宏伟,静林Xiaozhi金,假吴Sijie Yu开鲁朱和执行实验;Lujian朱镕基和陈Dazhi分析实验结果和写的手稿。所有作者导致数据分析、起草或修改这篇文章,已经同意在《华尔街日报》的文章将提交给最终批准出版的版本,并同意负责所有方面的工作。作者通过文章的最终版本,包括作者列表。Lujian朱和陈Dazhi同样这项工作。
确认
这项研究受到了温州科技重大科技创新局攻击(没有医疗保健项目。ZY2019008),温州科技局基本医疗卫生科技项目(没有。Y20210147),浙江省自然科学基金(没有。LD21H030002),中国国家自然科学基金(没有。81770585也没有。82070593)。