文摘
创伤性脑损伤(TBI)导致高死亡率和伤残率,和它的治疗仍然是有限的。丢失的神经元受损区域不是获救的相对分子疗法。根据疾病的特点,我们移植人类胚胎干细胞——(hESC)派生的脑损伤脑瀑样皮质影响控制——(CCI)建模重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠。嫁接瀑样存活和分化CCI-induced病变池在小鼠大脑皮层组织。植入大脑瀑样分化成各种类型的神经细胞,延长长期预测,并显示自发的行动,由肌移植的活动表示。诱导血管化和减少胶质瘢痕瀑样植入后还发现,表明移植可以改善当地情况,促进神经修复。更重要的是,CCI小鼠的空间学习和记忆瀑样嫁接后改善。这些发现表明,脑瀑样病变植入网站分化成皮质神经元,形成长期的预测,和逆转赤字在空间学习和记忆,一个潜在的创伤性脑损伤的治疗途径。
1。介绍
创伤性脑损伤(TBI)是死亡的主要原因之一,在发达国家的年轻人(1,2]。创伤性脑损伤诱发损伤两个阶段:急性机械组织病变常导致神经元死亡和慢性神经变性的神经损害特点contusive地区(3,4]。目前,严重创伤性脑损伤是目前在重症监护病房管理结合外科方法(5,6]。治疗的目的是防止额外的脑损伤和脑复苏的优化条件4]。然而,神经元损失和有限的再生病变通过当前网站无法挽回一些分子靶向治疗。干细胞疗法是一个潜在的方法来提高神经元的修复能力和追求全球近900临床试验(https://www.clinicaltrials.gov/ct2/home)。早期的研究表明,干细胞细胞移植试验疗法可以对抗各种疾病,如肾损伤(7,8)、血液疾病(9,10),和心肌缺血11,12]。在脑损伤中,人类胚胎干细胞移植神经干细胞(NSC)是一个潜在的治疗缺血性中风通过改善功能恢复(13,14]。NSC移植也被一种可能有效的治疗创伤性脑损伤(15]。然而,一般NSC移植表明穷人生存和不满足差异化(16),分散细胞无法聚集在受损区域没有流动。因此,修改后的方法改善NSC发展和分化是必要的在活的有机体内。
我们使用三维(3 d)从人类胚胎干细胞生成神经组织(为),也称为“脑瀑样,”曾被用于不仅药物筛选,而且神经发育机制探索(17- - - - - -19]。他们有巨大的潜力来填补受损区域和调查神经反应,因为他们的特殊特点:稳定的形态学和神经分化。不像一般NSC疗法(20.),我们使用脑瀑样在体外和植入。球形莲座状结构被镊子容易转移,移植到损伤领域,人类第一次使用的瀑样在SCID控制皮质(CCI)小鼠模型的影响。
我们使用一个有效的在活的有机体内CCI瀑样移植模型小鼠的大脑。大约两个月的植入后,微磁磁共振成像(MRI)显示,植入瀑样已经融入周围的老鼠大脑病变池中。移植细胞也表现出神经分化和体面的电生理活动。血管化标记,CD31还发现,一些从未见过的脑瀑样在体外。减少胶质疤痕移植后60天的发展,后被发现,从而缓解阻碍轴突生长和再生。脑瀑样植入也提高了内存,CCI后小鼠的空间学习能力。总之,脑瀑样移植是一个潜在的治疗逆转创伤后神经元损失和提高学习和记忆能力。
2。材料和方法
2.1。脑瀑样文化和转染
脑瀑样是从人类培养多能干细胞(为)由dispase分离。瓶中的分散细胞悬浮生成胚胎的身体(EBs)神经感应介质(NIM),含有DMEM / F12, MEM-NEAA N2补充1%,和1%。7天(D7)、EBs是神经管形成附加菜。D16,细胞被吸管resuspended形成neurospheres (NSs),被转移到基底膜基质滴一个接一个,进一步培养在D25 60毫米盘,最后形成脑瀑样。试剂使用的所有信息的补充表所示1。在这个实验中,所需要的培养瀑样表达GFP在后续实验。总之,脑瀑样与慢病毒转染GFP (Genechem、上海、中国)和被转染与10%聚凝胺20莫伊60毫米。12 h孵化后37°C, neural-basal介质与一个新鲜的改变。和绿色荧光强度得到了使用Eclipse E600尼康显微镜(尼康,梅尔维尔,纽约)。
2.2。Immunofluorescent染色
总之,thirty-five-micrometer冻结部分被4%的多聚甲醛固定1 h然后孵化磷酸盐(PBS)和0.3% Triton x - 100和5%的牛血清白蛋白1 h。阻塞后,部分被沾相对抗体在4°C 8小时或过夜。随后,二次抗体(Alexa萤石,549年或488年;英杰公司)使用,赫斯特(Ho)被用来可视化细胞核。使用Eclipse E600尼康显微镜图像得到(尼康,梅尔维尔,纽约)。所有信息的使用主要抗体是显示为:兔多克隆anti-Doublecortin(克莱斯勒)Abcam,猫# ab18723;鼠标微管蛋白多克隆antibeta三世(Tuj-1) Abcam,猫# ab18207;兔多克隆anti-Tbr1,圣克鲁斯生物技术、猫# sc - 48816;兔多克隆anti-Tbr2 Abcam,猫# ab23345;兔多克隆anti-Ctip2 Abcam,猫# ab18465; Rabbit polyclonal anti-Foxp2, Abcam, Cat# ab16046; Rabbit polyclonal anti-Pax6, Abcam, Cat# ab195045; Rabbit polyclonal anti-Nanog, Cell Signaling Technology, Cat# 4903; Rabbit polyclonal anti-Sox2, Abcam, Cat# ab93689; Rabbit polyclonal anti-Ki67, Abcam, Cat# ab15580; Mouse polyclonal anti-Brn2, Millipore, Cat# MABD51; Mouse polyclonal anti-Stab2, Abcam, Cat# ab51502; Rabbit polyclonal anti-Hopx, (Santa Cruz Biotechnology, Cat# sc-30216; Rabbit polyclonal anti-CD31, Abcam, Cat# ab28364; Mouse monoclonal anti-human nuclei, Millipore, Cat# MAB1281; and Mouse monoclonal anti-STEM121, Takara Bio, Cat# Y40410.
瀑样播种到玻璃晶片与冷却4%多聚甲醛固定15分钟和孵化PBS 0.1% Triton x - 100和5%的牛血清白蛋白1 h。下面的流程在组织染色相同。
2.3。动物和移植模型
所有实验程序中执行SCID小鼠预先批准和执行准则建立的南京医科大学实验动物保健管理面板。SCID小鼠为实验都是女性,被随机分配到实验组。八周大的男性SCID小鼠(南京医科大学、南京、中国)受到严重的CCI如前所述[21]。麻醉诱导与3%异氟烷(R.W.D.,Shenzhen, China) in nitrous oxide : oxygen (7 : 3) and maintained with 1.5% isoflurane via a nose cone. After anesthesia, the mice were fixed to a stereotaxic frame (R.W.D., Shenzhen, China). The skin was cut open, and the bone with a diameter of 5 mm overlaying the left parietal cortex was removed with a drill. CCIs were produced using an impactor tip ( ,50毫秒停留时间,深度1.4毫米)。头皮是缝合,另一个7天前通过减少头皮又植入瀑样。一个小裂缝是在皮下软组织,和瀑样被镊子嫁接到病变区域。值得注意的是,皮下软组织的裂缝是适合镊子到达病变池;一个超大号的裂缝可能影响移植的成功率,因为脑脊液外流可以挤出接枝瀑样。头皮又缝合了,老鼠的温度与加热垫保持。
2.4。莫里斯水迷宫测试
所有实验都是在一个圆形池直径(2.0米)的光大约2.0米的中心和4个不同的标签在墙上的池。4象限中的数据的平均值的数据样本。水温保持在 是不透明的,用一个黑色油漆在隐藏的训练测试。
首先,老鼠( 老鼠在虚假的和 在其他组)分别为在实验开始前1天处理让它们适应从池中介绍和删除。习惯化时期后,老鼠接受为期3天的培训课程(每天4试验)可见的平台(直径10厘米)是通过附加一个浅色的立方是可见的地标。如果鼠标发现平台1分钟内,它仍然在那里,持续5秒。如果不是,那是温柔地引导向平台在继续之前。平台上的5 s期后,在加热垫老鼠干,然后回到他们的笼子里。
可见训练后,老鼠接受7天隐藏训练(每天4试验)的平台被1.0厘米在水面以下。整个实验平台的位置是固定的。如果老鼠发现平台,数据被记录。当老鼠找不到该平台在60年代,他们引导向它,在它十年代,和延迟到达平台记录60年代。起始位置是随机在每个象限的审判。对于每个审判,延迟到达平台(s)、游泳(cm)的距离,和游泳速度(cm / s)测量使用时间微波加工软件(奥哈拉& Co .)、东京、日本)。
2.5。Micro-MRI化验
老鼠在11.7 T MRI仪器(力量,皇冠500 WB)动物提供的南京医科大学的核心设备是用于实验。老鼠和3%异氟烷和维护1.5%异氟烷麻醉通过鼻锥。核磁共振在下列条件下进行:t2加权快速自旋回波(罕见)序列( ; ; ; ; ; )。
2.6。被动回避试验
所有组的老鼠放在光线的明暗箱第一天(D1),虽然他们往往徘徊在黑暗的房间里。D2和D3, 0.3 mA的电刺激应用黑盒,迫使所有老鼠呆在光明的一面。第四天,老鼠放在一个明暗箱没有电刺激在黑暗的一面。运动曲线和持续时间上光明与黑暗框第一和第四天被软件记录。
2.7。电生理检测
录音与小鼠进行移植了70天。老鼠深麻醉,并进行了注入冷95% O2和5%的公司2饱和sucrose-substituted人工脑脊液(aCSF)通过左心室。aCSF包含以下(毫米):110 mM的蔗糖,60毫米的氯化钠,氯化钾的3毫米,1.25毫米的不2阿宝4NaHCO 28毫米3,500年5毫米的葡萄糖μ米的CaCl2MgCl 7毫米2,600的μ抗坏血酸盐。冠状切片400μ米厚的准备Vibratome和孵化的位置在含氧aCSF网电生理记录前至少1小时。片被转移到记录室和灌注aCSF(1毫升/分钟)为100%。所有的解决方案都不断沸腾O为95%2和5%的公司2。嫁接瀑样使用488激发荧光光谱中被发现。自发电位和动作电位记录获得使用吸入电极刺激和记录,如前所述[22,23]。势都记录HEKA放大器。信号处理使用Metalab (PatchMaster)软件。
2.8。统计分析
GraphPad 8.0软件的数据分析和报告 。一个未配对 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)和图基的测试应用于相对免疫荧光强度的措施和行为测试在每个时间点包括61 - 70 dpi比较两组之间的差异。行为测试,包括莫里斯水迷宫(微波加工)化验,整个集团的数据分析了用双向方差分析重复测量图基紧随其后事后。设定在显著差异 。
3所示。结果
3.1。一代的人类大脑瀑样培养体外
实验过程(图所示1(一))。总之,瀑样注入之前,控制皮质损伤(CCI)进行提前7天。需要大约2个月移植瀑样分化,成熟,和发展。人类ESC-derived瀑样是有文化的在体外随着时间的推移,他们的大小增加(图1 (b))。在33瀑样的图像理查德·道金斯,45岁th,58th天3 d文化展示。瀑样有效表示新生神经元的特点被克莱斯勒和Tuj-1 58天(图1 (c))。克莱斯勒是一种microtubule-associated蛋白的初始步骤需要大脑皮层神经元色散和皮质纹理在发展。它参与的信号通路的关键神经元交互迁移之前和期间,可能作为ion-dependent钙信号转导通路的一部分(24,25]。表达Tuj-1主要局限于中部和周围神经系统。Tuj-1在适当的轴突引导和维护起着至关重要的作用,这是一个pan-neuronal标记(26,27]。在这个时间点,成熟的神经元(标记为“NeuN”)和神经干细胞(标记为“Nanog”)测定在瀑样(图1 (d))。Pax6,标记的神经前体细胞,并表示在发展中中枢神经系统(28,29日),(图中也检测到1 (e))。细胞表达的中心腔神经干细胞标记(标记为“Sox2”)和细胞增殖标记(标记为“Ki67”)(数据1 (e)和1 (g))。58-day 3 d文化进行分化干细胞Tbr1-positive细胞(图1 (h))。Tbr1深皮质层的特点是(30.)和转录抑制因子参与脑皮质发育的多个方面,包括神经元迁移、层流和真实身份,和轴突投射31日,32]。除了Tbr1, Ctip2的表情,Foxp2基因被发现(图1(我))。一般来说,Ctip2表示在许多大脑区域,但其表达在皮质脊髓运动神经元(CSMNs) [33]。转录因子的Foxp2基因参与建立神经通路在哺乳动物和被认为是声乐学习中发挥了特殊作用的进化人类语言和语言(34]。也与遗传有关面部肌肉运动障碍和穷人的控制(35]。Satb2,一层层标记(36),发现在这个时间点(图1 (j))。在胚胎发育期间,Satb2是至关重要的建立适当的身份和胼胝体的神经元的轴突投射在老鼠大脑皮层37]。Brn2,特异性神经元转录因子(38),也是58-day脑瀑样(图中找到1 (k))。它是一个重要的转录因子在皮层神经发生39]。超表达Brn2增强的神经元分化和减毒在皮层星形胶质细胞分化多能神经前体细胞(npc)文化40]。因此,脑瀑样进行3 d文化表现出的身份皮质层和神经祖细胞(npc)。
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3.2。植入瀑样显示适当的增长和发展
不同于以前的方法将神经干细胞注入小鼠大脑(41),58-day瀑样被镊子植入。简要过程操作显示在图2(一个)。控制大脑皮层的影响(CCI)在SCID小鼠表现,和随后的7天需要避免局部炎症风暴。一个小裂缝是在皮下软组织,和瀑样被镊子嫁接到病变区域。值得注意的是,裂缝的大小在皮下软组织适合镊子到达病变池。为了检测CCI受伤后病变和贪污瀑样的发展,micro-MRI测试使用。脑脊液(CSF)填补了病变部位。嫁接的状态在40天瀑样postimplantation (dpi), 50 dpi, 60 dpi也显示在图1 (b)。随着dpi的增加,接枝瀑样逐渐增长的病变区域。尤其是植入瀑样生长良好,倾向于延长60 dpi。75%的移植动物存活超过70 dpi,这比CCI组(图没有区别2 (c))。形态学,植入瀑样可以填补CCI-induced病变池,而不是像一个颅内肿瘤生长占领(图2 (d))。因此,它是适当的,老鼠的大脑移植大脑瀑样收获在55 - 70 dpi和分析的基础上,一个大约两个月的植入期被用于进一步的研究。
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3.3。植入瀑样表现出进步的分化
植入前,40瀑样GFP和65瀑样没有GFP是培养为进一步实验流程。检查是否发生渐进分化和成熟在活的有机体内,我们检查了新生儿神经标记Doublecortin(克莱斯勒)和人类细胞质STEM121标志,指示开发、分化良好型的神经细胞,甚至通过胼胝体与投影到另一个半球在55 dpi(图3(一个))。在65 dpi,植入瀑样表示Tbr1 Tbr2, Foxp2基因和Ctip2(数字3 (b)- - - - - -3 (e))。相比58-day脑瀑样在体外,一个更高比例的细胞表达Tbr1, Foxp2基因,Ctip2被发现在65 dpi在活的有机体内,这表明在活的有机体内环境增强细胞成熟和分化皮质(图3 (f))。不仅皮层标记检测而且Hopx,代表外subventricular区(OSVZ区域(图)1 (g))。Hopx表达式区分成年SGZ神经祖细胞和SVZ和潜在的调节齿状神经发生42]。的GFP-conjunct瀑样也移植到老鼠CCI-model和幸存(数字3 (h)和3(我))。Brn2高度表达了两个月后植入(图3 (j))。Satb2,调节胼胝体的和subcerebral投射神经元的分化发展中大脑皮层(37在移植瀑样),检测60 dpi(图3 (k))。而脑瀑样在体外,Brn2的数量+和Stab2+细胞60 dpi比增加在体外(D58)(图3(左))。在他们的阶段在体外文化、脑瀑样由npc和成熟神经细胞(标记为“NeuN”)。随着时间的推移是否发生类似的逐步成熟的过程在活的有机体内我们寻求Sox2 Ki67表达式(数字3(米)和3 (n))。在65 dpi, Sox2和Ki67表达式在嫁接瀑样比脑瀑样几乎不太可能在体外(图3 (o))。总之,嫁接瀑样表现出进步的分化在活的有机体内。
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3.4。植入瀑样开发有助于当地神经修复
除了检测分化过程,改善当地情况也是一个推杆式神经修复。谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质(43]。在接枝瀑样,谷氨酸也被检测到在活的有机体内(图4(一))。血管化是特别必要的营养供给和有效的神经祖细胞分化,而脑瀑样系统在体外缺乏,但检测到CD31在嫁接瀑样在活的有机体内(图4 (b))。突触前标记Synapsin和突触后标记PSD95被免疫染色检测,显示多个Synapsin和PSD95与puncta移植(图和说明突触连接4 (c))。胶质瘢痕的形成是重要的因素之一,影响再生的神经纤维和神经元44]。GFAP丰富星形胶质细胞标记,尤其是在损伤病变,CCI(数据后被发现4 (d)和4 (e))。植入瀑样缓解GFAP表达交界地区30 dpi, 45 dpi, 60 dpi(图4 (f)左)。中心区域的嫁接瀑样,GFAP也发现(图4 (f)右),其荧光强度类似像是虚假但低于CCI组(图4 (g))。因此,嫁接瀑样有助于改善当地情况,促进神经修复。
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3.5。成熟的瀑样神经保护作用与神经电生理活动和动物行为的改善
瀑样移植是否表现出电生理活动,我们进行了细胞记录使用多级阵列在70 dpi。细胞表达绿色荧光蛋白(图中被发现5(一个))。我们还成功地记录了自发电位(图5 (b))和动作电位(数字5 (c)和5 (d))刺激。因此,嫁接瀑样可能会分化成成熟的神经细胞和神经信息被传输。CCI-induced神经损伤也包括慢性神经退化,两个在记忆和认知障碍的特征。我们进行行为测试,包括莫里斯水迷宫测试和被动回避试验(微波加工)。在微波加工测试,首先在老鼠受到执行为期3天的培训,可见在平台表面的水用黑色的染色表示。在为期三天的训练,在延迟没有发现差异,距离,或游泳速度的平台,表明所有的老鼠没有视觉障碍和运动能力的差异(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。在隐藏的测试中,小鼠瀑样嫁接表现出更好的空间学习能力比老鼠只有CCIs,延迟和较短的距离第五隐藏的平台开始测试一天。游泳的速度在这个测试并没有改变在任何时候,不包括著名的电机干扰因素whole-MWM实验(数字5 (h)- - - - - -5 (j))。除了微波加工,被动回避试验为短期记忆(数据是另一个测试5 (k)和5(左))。电刺激在黑盒老鼠被迫留在灯箱尽管他们自然倾向于黑暗的环境。测试一天,老鼠接受瀑样嫁接仍然倾向于留在灯箱超过CCI与电刺激小鼠移除。因此,移植小鼠更容易记住的危险在黑盒和留在灯箱。综上所述,嫁接瀑样大约2个月改进CCI-induced小鼠的学习和记忆能力。
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4所示。讨论
创伤性脑损伤导致神经元不可逆损失和结果,不仅在急性损伤,而且在慢性损伤与神经退行性疾病,其特征是记忆相关的恶化。我们引入了一个新的CCI-induced植入大脑瀑样病变区域的方法。与较早的研究不同的是关于相对分子靶向治疗减少神经元死亡在周围挫伤脑组织(45,46),植入大脑瀑样,而不是一般NSC,有效地填补了病变池和恢复原始神经元损伤的功能领域,超越NSC移植的存活率低,可怜的分化。相比普通2 d NSC文化、3 d-cultured瀑样生成神经元的结构特点,包括相对人类大脑器官发生和细胞结构,并被用作研究模型的相对大脑发育和疾病在先前的研究47,48]。植入3 d-cultured瀑样也更方便比植入2 d-cultured nsc。以前NSC移植已经由细胞悬液注入当地组织(49),这是无效的,因为大脑不能聚集在CCI-induced分散细胞病变,可怜的存活和分化率。培养脑瀑样也保持球形卷在体外,可以被镊子。在这项研究中,58-day培养瀑样的大小是一个立体镜适合捡不使用。
嫁接瀑样60 dpi Tbr1的比例增加,Foxp2基因,Ctip2在体外,显示更多的分化和成熟大脑皮层神经细胞生成在活的有机体内。增加Brn2+和Satb2+神经细胞还表示一个特定的方向进一步分化。Sox2+和Ki67+细胞显著减少,然而,这表明细胞分化,而不是保持原来的扩散能力。当大脑瀑样是有文化的在体外、增加大小可能诱导坏死中心由于氧气渗透不良和营养供应。血管化标记CD31也被检测到在活的有机体内分化和成熟,提供必要的援助,没有发现坏死细胞移植瀑样,虽然这是调查早期血管起源的研究从主机(16]。旁边的血管化,胶质瘢痕的形成是另一个重要因素,影响神经修复。CCI-induced胶质疤痕丰富GFAP表达可以抑制轴突的一代,这一块瀑样分化(50]。瀑样植入后,瀑样和主机之间的交界区域脑组织也显示减少GFAP的表达。嫁接瀑样病变区域,诱导分化长神经投射,这是由于减少胶质瘢痕。因此,瀑样注入改善当地情况有利于细胞分化和成熟。在中央的嫁接瀑样,GFAP也发现但不像CCI-induced积极改变。先前的研究表明,一个拨款星形胶质细胞或水平的GFAP神经分化[至关重要51,52]。因此,改善情况嫁接瀑样是一个推销员,促进细胞分化。
在目前的研究中,空间学习能力是通过微波加工化验发现,表明接枝瀑样有缓解功能记忆障碍。此前的一项研究表明,大脑瀑样移植也提高了神经运动功能在脑损伤后大鼠,但是他们的实验设计主要方法(不同于我们的53]。他们移植人类瀑样的雄性sd大鼠大脑中,用环孢菌素抑制免疫排斥反应。然而,运动不足,一般检测脑损伤后不久,随着时间的推移可以补偿恢复没有治疗;测试2个月postimplantation找运动能力组之间的差异可能是不合适的。我们的研究还发现,没有区别的游泳速度组通过微波加工试验,建立控制来测试他们的空间学习能力。总之,瀑样嫁接了近两个月能适应本体论脑组织发育,结构和功能方面。
至于适当的植入时间,我们选择CCI后的第七天。与其他中枢神经系统(CNS)疾病模型,如阿尔茨海默病和帕金森病,CCI-induced移植急性损伤结合出血是不方便;后立即植入CCI因此效率低下。内大量出血病变CCI可能带走瀑样后,有效地改变了嫁接的位置。快速CCI后炎症反应也会影响分化和成熟的方向,和更大的肿瘤坏死因子-α表达式可能会抑制神经干细胞的分化与增殖上调Acsl2 [54]。CCI-induced小胶质细胞激活也促进了il - 1的表达β、il - 6和地震,影响和干扰神经发生55,56]。增强的炎症反应仍然坚持CCI后第七天,但不像最初的爆炸。因此,避免快速炎症风暴后CCI对于脑瀑样植入是必要的。
5。结论
总之,我们的研究表明,人类大脑的增强的分化和成熟瀑样植入损伤小鼠皮层具有良好host-brain集成提供了一个新颖的秘诀在于其细胞代谢的策略解决创伤性脑损伤和其他神经退行性疾病(图6)。这些观察结果也指出未来的发展方向的探索。例如,如何提高神经干细胞的存活率在宿主的大脑吗?如果是这样,瀑样的使用大脑解决这个问题?此外,更方便使用瀑样移植吗?最后,瀑样贪污是否可以缓解神经胶质疤痕造成的创伤性脑损伤吗?如果是这样,改善局部条件会促进神经细胞的通讯和功能重建。这些问题的答案将提供有价值的见解创伤性脑损伤引发的结构和功能的影响,这可能显示临床有效的治疗干预措施。
数据可用性
生成的数据集在当前研究可从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
京冀和刘燕设计研究。中原宝,宗庆后苗,冲李执行移植操作,疣状,在动物实验和行为分析。Kaiheng大脑瀑样方执行文化。Chaojuan杨神经电生理检查执行。中原宝,刘燕,陈张写了手稿。中原宝,Kaiheng方,宗庆后苗族贡献同样这项工作。
确认
本研究支持由中国国家基础研究计划(2017 yfa0105201);中国国家自然科学基金(批准号。82120108018,81972153,81471269,81472362,81925011,81471301,91849117,,31670842);江苏省创新团队(批准号NR17);战略重点研究项目的中国科学院(批准号XDA16010306);甄江城市的关键研究和发展项目(SH2019034);无锡太湖人才的资助从医学专家团队计划;赠款从北京市科学技术委员会(Z181100001518001和KZ201910025025),高级教师的支持项目在北京市大学13期的五年计划(CIT&TCD20190334);北京青年学者计划(015); and the Key Realm Research and Development Program of Guangdong Province (2019B030335001).
补充材料
源,猫#号和RRID抗体和化学物质。(补充材料)