文摘
背景。心脏肥大是一种补偿性响应过载的压力,最终导致心力衰竭。目前的研究探讨了烟酰胺核苷的保护作用(NR)河畔+助推器可能通过饮食管理,在心肌肥大的发生和揭示其潜在机制的细节。方法。横向主缢痕(TAC)手术建立小鼠心肌肥厚模型。老鼠被随机分为四组:骗局,TAC,假+ NR, TAC + NR。NR治疗了每天口服填喂法。心脏结构和功能使用小动物超声心动图评估。线粒体氧化应激是由dihydroethidium评估(她)染色,丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。表达水平的心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP), il - 1β肿瘤坏死因子-α,Sirtuin3衡量实时PCR和ELISA。表达水平的Caspase-1, Caspase-1 pro,裂解Gasdermin D (GSDMD) NLRP3, ASC, Sirtuin3, ac-MnSOD,总MnSOD测量免疫印迹。结果。减少心脏/体重比(HW / BW)和肺/体重比值(LW / BW)和ANP、BNP和LDH水平观察NR (TAC集团管理的 )。此外,超声心动图数据显示,心脏功能障碍和结构变化引起的TAC是提高了NR治疗( )。NR治疗也降低炎性细胞因子的水平,il - 1β和肿瘤坏死因子-α,减毒激活NLRP3 inflammasomes TAC引起的。此外,改变在染色,MDA含量和SOD活性表明,NR治疗缓解氧化应激引起的TAC。数据从ELISA和西方印迹显示心肌NAD升高+内容和Sirtuin3活动和乙酰化作用降低MnSOD NR治疗后,暴露方面的潜在的信号通路。结论。NR治疗缓解TAC-induced病理性心脏肥大和功能障碍。机械,这些有利影响归因于抑制NLRP3 inflammasome激活和心肌炎症反应通过调节河畔+-Sirtuin3-MnSOD信号通路。
1。介绍
心脏肥大是许多心血管疾病常用的功能1]。肥大良性发展,对生理和病理刺激适应性反应和结果增加心脏收缩性。然而,持续的刺激,肥大的进展心脏重构和功能障碍,成为病理性肥大,一个复杂的过程,最终导致心力衰竭(2]。最近的研究已经确定了一些机制,导致病理性肥大,包括细胞的新陈代谢、免疫应答、lncRNAs异常表达,表观遗传变化(3,4]。然而,这仍然是一个需要进行进一步研究以确定分子治疗的目标。
炎症被认为是一个关键的标志肥大(5]。然而,炎症在肥大的致病作用是不完全理解。胞质inflammasome multiprotein复杂,由许多刺激炎症反应的主要监管机构。由此产生的激活Caspase-1诱发成熟促炎细胞因子(6]。有越来越多的证据表明,链接nucleotide-binding和富亮氨酸重复pyrin域蛋白3 (NLRP3) inflammasome及其刺激细胞因子分泌各种心血管疾病的发病机制,包括动脉粥样硬化、急性心肌梗死(AMI)急性心肌炎,发展为心力衰竭(HF)。这些发现暴露的可能性的口服NLRP3 inflammasome抑制剂来治疗心血管疾病(7]。因此,有越来越多的审查inflammasome-based心血管治疗的方法。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)是一种辅酶参与多样化的生物过程(8]。减少NAD+和随后的线粒体蛋白质水平hyperacetylation已报告与心衰的发展。因此,提升NAD的潜力+水平在治疗心血管疾病(9]。值得注意的是,饮食管理NAD的潜在好处+推进器已经备受关注(10]。然而,这种代理的有益健康的影响在肥厚性心脏尚未探索。
在目前的研究中,我们使用了一个横向主缢痕(TAC)小鼠模型证明NLRP3 inflammasome激活与心脏肥大的进展。此外,我们已经确认了心血管作用烟酰胺核苷(NR)的一个河畔+增压可以通过饮食和抑制了NLRP3 inflammasome和炎症反应通过Sirtuin3-MnSOD信号通路的调控。
2。材料和方法
2.1。材料
2.1.1。动物
雄性C57BL / 6 j小鼠(8周,体重180 - 200克)是购买从金陵的动物中心医院。动物是维持在标准条件下的温度( °C)和湿度( %)和一个交替12 h光/ 12 h暗周期。动物有免费的自来水和足够的食物。的程序在活的有机体内研究动物保健金陵医院委员会批准。所有动物研究程序进行依照中国国家卫生研究院的实验动物的使用指导方针。
2.1.2。试剂
汤普森NR购买从中国生物有限公司,有限公司她探头从生物学实验室购买公司(冰冻切片活性氧检测装备,生物学实验室,北京,中国)。抗体对Caspase-1长大,Caspase-1 pro, NLRP3, ASC, Sirtuin3,β从细胞肌动蛋白免疫印迹的购买信号技术(细胞信号技术,美国),和抗体提高裂解GSDMD, MnSOD(总),和ac-MnSOD (MnSOD-acetyl K68)买来Abcam(美国Abcam)。
2.2。方法
2.2.1。实验分组和手术治疗
使用TAC小鼠模型建立了心脏肥大手术。总共40实验小鼠被随机分配到四组之一:骗局,TAC,假+ NR和TAC + NR每组10只老鼠。TAC过程如下。老鼠和2%异氟烷麻醉。在无菌条件下,用鼠标仰卧位,左边第二根肋骨的胸腔被切断了与手术剪刀和胸腺轻轻摘下充分暴露主动脉弓。27 g枕头放置在主动脉弓的方向,其次是结扎,以细线收缩主动脉弓直径约0.4毫米当枕头了。虚假的组的老鼠受到皮肤切口和钝分离没有收缩的主动脉。的胸腔被关闭并与碘载体皮肤消毒。参与,青霉素被注入腹腔内,以防止感染。超声心动图进行TAC手术后一周确认结扎线的位置。 Mice in the sham+NR and TAC+NR groups were given NR by daily oral gavage at a dose of 400 mg/kg/d for 8 weeks.
2.2.2。组织收集和测量
参与八周,小鼠禁食12小时,称重,由2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。血从颈动脉和心脏和肺被移除,重。心脏/体重比值(HW / BW):心质量(mg) /体重(g)和肺/体重比值(LW / BW):肺质量(mg) /体重(g)计算。站了15分钟后,颈动脉血液离心10分钟收获血清的2000克。心肌损伤标志物的活动,乳酸脱氢酶(LDH)测定spectrophotometrically使用商用设备(南京建成生物工程研究所,中国)。水平的il - 1β和肿瘤坏死因子-α在心肌组织使用ELISA试剂盒测定根据制造商的指示。
2.2.3。超声心动图评价心脏功能
Vevo 2100超声波超声心动图系统(Visual-Sonics,多伦多,加拿大)被用来评估心脏功能。总之,老鼠与异氟烷麻醉。心脏是在二维成像胸骨旁的极震区视图和一个M-mode midventricle产生的超声心动图。详细的程序之前报道(11]。
2.2.4。测量心肌氧化应激
Dihydroethidium(她)染色法被用来评估心肌的生产活性氧(ROS)对TAC的回应。短暂,冰冻组织部分孵化了她30分钟解决方案在黑暗中在37°C。细胞核被DAPI复染色(1毫克/毫升)为5分钟。洗后,幻灯片可视化在激光扫描共焦显微镜(奥林巴斯FV1200,奥林巴斯、东京、日本)。三个复制的部分进行了分析计算的平均数据。
水平的丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的活动在心肌组织测量与商业分析工具(Beyotime、上海、中国),根据制造商的指示。
2.2.5。ELISA试验
水平的炎性细胞因子,il - 1β和肿瘤坏死因子-α,测定心肌组织中使用商业ELISA试剂盒(il - 1β和肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒:abs520001 Abison上海生物科技有限公司有限公司,中国),根据制造商的指示。每个测试样本一式三份。
2.2.6款。Sirtuin3活动
Sirtuin3活动进行了分析使用商业套装(Sirtuin3活动试验设备,Abcam,剑桥,妈,美国),根据制造商的指示。荧光在 纳米测量使用标。Sirtuin3活动提出了相对于虚假的组。
2.2.7。定量实时聚合酶链反应
如前所述(执行定量实时聚合酶链反应11]。简单地说,从心肌组织总RNA是孤立的,互补脱氧核糖核酸合成使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒,希登,德国)。实时PCR过程都使用了KAPA SYBR快速qPCR工具包(沃本KAPA生物系统公司,妈,美国)。引物序列表中列出1。四十个循环扩增的基因编码ANP和法国巴黎(94°C 30年代,60年代60°C, 1分钟和72°C)。相对mRNA表达式计算的ΔΔCT方法使用7500系统SDS软件版本1.2.1.22(应用生物系统公司)。GAPDH(管家基因)是作为一个内部标准。
2.2.8。西方墨点法
总之,心脏组织收集到埃普多夫管。蛋白质被均质化提取组织里帕缓冲区(热里帕缓冲区,热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)含1%热科学停止蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。蛋白质执行量化使用热科学皮尔斯BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。免疫印迹分析,组织匀浆是装上sds - page凝胶;乐队都被转移到NC膜(微孔、Billerica MA)和阻塞adipoprotein 5%,其次是孵化与主抗体在一夜之间4°C (ASC, Caspase-1, Caspase-1 pro, NLRP3 GSDMD, Sirtuin3, MnSOD, MnSOD-acetyl K68,和β肌动蛋白(1:2000))。膜与TBST清洗解决方案和孵化与相应的二次抗体在室温下1 h。乐队是由化学发光检测可视化工具包(热电子集团,罗克福德,IL)与ImageJ软件和分析(NIH ImageJ系统,马里兰州贝塞斯达)。
2.2.9。统计数据
所有数据用Prism 6.0软件进行统计分析。实验数据表示为 。数据是由单向方差分析比较分析,其次是图基的分析。 被认为是统计学意义的门槛。
3所示。结果
3.1。NR减毒TAC小鼠心肌肥厚标记
超声波超声心动图的结果,执行后一周TAC,如图所示1(一)。主动脉缩窄的TAC组与虚假的组。NR的影响治疗心肌肥厚的标记,包括心脏质量指数、ANP、BNP水平,和LDH活性评价TAC 8周后手术。如数据所示1 (b)和1 (c)HW / BW和LW / BW比率TAC组(HW / BW: 和LW / BW: )显著高于在虚假的集团( ; 和 ; )。NR治疗显著降低比率。TAC + NR组HW / BW: 和LW / BW: 相比之下, 和 ,分别对TAC集团( )。ANP、BNP水平较低的NR + TAC组与TAC组(ANP: vs。 ; ;法国巴黎: vs。 ; ),表明NR治疗显著改善了TAC(图引起的心肌肥厚1 (d))。TAC引起心肌损伤标志物的活动的增加,LDH,而虚假的组(TAC: U / L与虚假的: U / L; ),与NR和活动减少治疗(TAC + NR: U / L; )(图1 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。NR缓解TAC造成的心脏功能障碍
心脏结构和功能被超声波超声心动图评估。图2(一个)显示M-mode超声心动图midventricle的乳头肌水平。没有显著差异在鼠标心率(HR)组织与人力资源从400年到450年bpm(图2 (b))。射血分数(EF)和部分缩短(FS) TAC组显著减少(EF: TAC: 与虚假的: ;FS: TAC: 与虚假的: ; ),这表明TAC引起的心肌功能受损。NR治疗恢复TAC小鼠的左心室收缩功能(EF: TAC + NR: 与TAC: ;FS: TAC + NR: 与TAC: ; )(数据2 (c)和2 (d))。所示的数字2 (e)- - - - - -2 (g),TAC小鼠心脏结构的变化引起的,表现为左心室舒张末期维度(LV EDD),左心室收缩末期维度(LV ESD)和左心室壁厚(LV壁厚)增加(LV EDD: TAC: 与虚假的: ;LV ESD: TAC: 与虚假的: ;LV壁厚:TAC: 与虚假的: ; )。NR治疗显著提高TAC-induced心脏结构的变化(LV EDD: TAC + NR: 与TAC: ;LV ESD: TAC + NR: 与TAC: ;LV壁厚:TAC + NR: 与TAC: ; )。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.3。NR可以抑制NLRP3 Inflammasome TAC引起的激活和炎症细胞因子表达
ELISA和免疫印迹结果炎性细胞因子的测量图所示3。水平的炎症因子,il - 1β和肿瘤坏死因子-α,增加心肌组织的TAC集团(il - 1βTAC: 与虚假的: ; ;肿瘤坏死因子-αTAC: 与虚假的: ; ),和NR治疗显著降低这些水平(il - 1βTAC + NR: 与TAC: ; ;肿瘤坏死因子-αTAC + NR: 与TAC: ; )。免疫印迹结果(图3 (c))的比例显示,Caspase-1 / Caspase-1 pro的心肌TAC组增加( ),随着表达裂解GSDMD和NLRP3蛋白质。NR治疗减少NLRP3的表达和裂解GSDMD,连同Caspase-1激活的TAC + NR集团( )。这些结果表明NR在inflammasome激活的抑制效应引起的TAC。
(一)
(b)
(c)
3.4。NR TAC-Induced减轻氧化应激
线粒体ROS生产通过她染色法测定心肌组织。数据4(一)和4 (b)表明,荧光强度增加在TAC心肌组织( ),产生影响,降低了NR治疗( )。此外,TAC组心肌MDA水平升高与骗局相比,表明严重氧化应激( )。NR治疗降低MDA水平( ,图4 (c))。此外,TAC也受损心肌抗氧化酶的活性,SOD,恢复的NR活性的治疗( ,图4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。通过NAD NR调节NLRP3 Inflammasome激活+-Sirtuin3-MnSOD轴
NR的治疗效果是依赖于河畔+池。图5(一个)表明NAD+内容是降低心肌组织的TAC集团( ),一个由NR改善治疗效果( )。此外,TAC-induced减少Sirtuin3蛋白质也改善了NR治疗( ,图5 (b))。MnSOD Sirtuin3监管衬底和关键蛋白质在细胞氧化应激的规定。图5 (c)表明ac-MnSOD蛋白水平增加了TAC治疗后,效果由NR部分逆转治疗( )。这些变化与Sirtuin3活动的改变水平相一致。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们已经表明,NLRP3 inflammasome激活,以及伴随的分泌细胞因子,导致心脏肥大的发展在TAC小鼠模型。此外,我们的数据建立了NR的治疗潜力,河畔+增压,可以通过饮食的口服药物。底层机制揭示了涉及Sirtuin3-MnSOD信号通路及其抑制NLRP3 inflammasome。
心脏肥大患者很容易受到心脏衰竭和心律失常的病理心脏重构(12]。因此,迫切需要探讨肥厚性发展的机械的原因。先前的研究已经涉及炎症过程的病理生理学心脏肥大,和这种机制暴露潜在目标的识别药理调制(13,14]。NLRP3是一个模式识别受体(PRR),允许细胞应对危险信号。激活NLRP3与适配器凋亡speck-like蛋白质含有c端半胱天冬酶招聘领域(ASC)形成NLRP3 inflammasome激活Caspase-1和结果在生产的促炎细胞因子(15]。当前的研究建立的存在过度NLRP3 inflammasome激活TAC-induced心脏肥大和功能障碍。NLRP3的抑制炎症反应对肥厚性心脏有益的影响。以前的工作的结果也表明,选择性NLRP3 inflammasome抑制有保护作用,减少心力衰竭的风险或其他心血管疾病(16,17]。然而,这些结论有一定程度的争议。李等人报道反对发现NLRP3表达式在肥厚性过程中表达下调,NLRP3加剧压力的缺乏overload-induced心脏重构(18]。然而,这些结果之间的明显差异,当前的研究的结论也可能被解释成NLRP3蛋白的影响表达下调toll样受体(TLR) 4和没有考虑的更广泛的角色完成NLRP3 inflammasome。平衡的观点主要是赞成的不利影响NLRP3 inflammasome导致心血管疾病的病理过程,承认NLRP3 inflammasome是一种很有前途的治疗目标(19,20.]。
河畔+是一个丰富的分子无处不在的参与生物过程(21]。在过去的十年中,已经有新的NAD的兴趣+由于其与Sirtuins蛋白(Sirtuin1-7),一个家庭NAD-dependent蛋白质deacylases [22]。水平的河畔+被认为是随着年龄增长而减少,病理条件和NAD吗+已经提出补充作为治疗心血管疾病(23]。目前的研究结果表明,NAD的水平+减少在TAC小鼠模型。补充与NR、药理河畔+前体,导致心脏功能的恢复和重建。之前的临床研究报道,单剂量口服1000毫克NR提高血液河畔+水平的2.7倍,展示NAD的可行性+补充的人类患者(23]。最近,周等人报道的促炎激活的心脏衰竭的病人口服NR增加NAD含量(24]。总的来说,这些研究表明临床NAD潜力巨大+饱满的治疗心血管疾病。进一步的研究是必要的澄清NAD的治疗潜力+辅助治疗以改善心脏肥大的病人。
目前的研究还探讨了NAD之间的关系+在肥厚性心中补充和NLRP3 inflammasome激活。线粒体ROS的生成被认为是一个关键NLRP3 inflammasome激活(25,26]。因此,我们认为调节氧化应激可能顺利地编排NLRP3炎症反应。我们发现NR补充减毒TAC-induced心肌氧化应激,这显示一致的关系NLRP3 inflammasome激活。这些研究结果强烈表明,抑制作用的NR NLRP3 inflammasome可以归因于线粒体ROS生产。
先前的研究显示减少Sirtuin3表达式和高赖氨酸乙酰化的线粒体蛋白质在高血压心力衰竭模型,表明受损Sirtuin3协会活动与病理性心脏重构(27]。我们的研究结果表明,提高河畔+水平通过NR补充导致高架Sirtuin3 MnSOD活动和脱乙酰作用和缓解TAC-induced心肌氧化应激。这些发现从当前研究与临床前数据协议由李等人发现NADH / NAD正常化+失衡的线粒体蛋白质hyperacetylation在心力衰竭模型9]。目前的研究发现,Sirtuin3的有益作用是由锰超氧化物歧化酶(MnSOD),过氧化物清除剂,减少过氧化物生产导致氧化应激的衰减。然而,之前Diguet等人的一项研究发现饮食补充NR减弱高频在老鼠身上的发展没有影响全球心脏蛋白脱乙酰作用,他们观察到的强劲增加FOXO1和p53转录因子的乙酰化水平。相比之下,我们已经提出的证据表明,NR引起心肌Sirtuin3活动和减少乙酰化水平的升高MnSOD [28]。有大量的乙酰基转移酶和去乙酰酶抑制剂,其中一些是河畔+当别人在NAD端依赖+独立。进一步的临床前和临床调查增强NAD的影响+蛋白质乙酰化是必要的。
本研究在分析Sirtuin3的活动,Sirtuin蛋白的大家庭的成员。Sirtuins1-7 NAD的主要下游介质+调节生物过程(22]。有几项研究已经报道了河畔+后端依赖激活Sirtuin1和Sirtuin6补充与NR (29日- - - - - -31日]。可想而知,Sirtuin蛋白家族的其他成员也在NR补充目标TAC的上下文模型。进一步的调查需要更好地理解效果和潜在机制参与河畔+辅助治疗。
5。结论
一起,本研究的结果证明NR的效用作为NAD的助推器+水平衰减心脏肥大引起的过载压力。我们揭示了一个机制与减少氧化应激和抑制NLRP3 inflammasome通过Sirtuin3-MnSOD信号通路激活。我们得出这样的结论:NR,河畔+增压,可以通过饮食,伟大的承诺作为小说心脏肥大的治疗干预。
数据可用性
数据请求。
的利益冲突
所有作者声明不存在竞争的经济利益。
作者的贡献
西马和冯京同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81900409和81900409)和中国人民解放军医学青年培训项目(19 qnp037)。