文摘

酚类化合物的红酒粉(RWP)从意大利红酒Aglianico del秃鹰已经调查了潜在的人类巨噬细胞免疫调节和抗炎能力。这些化合物降低il - 1的分泌β、il - 6和TNF -α促炎细胞因子和增加释放il - 10的抗炎细胞因子诱导的脂多糖(LPS)。此外,RWP恢复膜联蛋白A1水平,因此涉及proresolutive通路的激活。值得注意的,RWP降低NF -κB蛋白水平,推广活动,和核易位。由于NF -κB抑制,降低了启动子的活动SLC25A1编码线粒体柠檬酸(中投)——载体ATP柠檬酸裂解酶(中国国际皮革展)代谢基因已经被观察到。中投、ac、柠檬酸和柠檬酸是组件的途径:在LPS-activated巨噬细胞,线粒体柠檬酸是由中投公司出口到细胞溶质在ac裂解的草酰乙酸、乙酰辅酶a, ROS前兆,没有⋅和铂族元素2炎症介质。我们确定柠檬酸通路RWP目标在执行其抗炎活性自RWP减少中投和ace蛋白水平,ace酶活性、胞质柠檬酸浓度,从而ROS,没有⋅,铂族元素2和组蛋白乙酰化水平。整体的研究结果表明,RWP可能恢复巨噬细胞内稳态通过抑制炎症通路和激活proresolutive流程。

1。介绍

免疫调制剂是异构化合物能够与免疫系统主机的上调或下调特定生物方面的回应。例如,酚类化合物清除自由基,防止脂质过氧化作用,调节炎症通路,并阻止促炎细胞因子的分泌1]。白藜芦醇抵消促炎细胞因子的生产,而花青素下调环氧酶2的表达(COX2)巨噬细胞暴露在脂多糖(LPS) [2]。有趣的是,白藜芦醇可以抑制炎症和免疫细胞的诱导凋亡引发proresolutive中介膜联蛋白A1 (AnxA1)途径3,4]。

此外,cyanidin-3-O-glucoside、petunidin-3-O-glucoside delphinidin-3-O-glucoside抑制免疫功能的主监管机构在哺乳动物细胞中,转录因子NF -κB,在增殖作用的蛋白激酶(MAPK)依赖的方式(5,6]。特定的花青素可以抑制活性氧的生成(ROS) (7,8]。例如,cyanidin-3-O-glucoside伟大的氧自由基吸收能力(ORAC)在体外(9]和花翠素是一个最活跃的拾荒者对超氧化物阴离子(10]。红酒中发现的化合物也可以上调表达的转录因子的抗氧化和解毒酶在哺乳动物细胞,改善cytoprotection对几种类型的压力(10]。

在炎症过程中,代谢变化来满足新的细胞能量需求。结果是代谢物的生产,既可以作为免疫信号分子和供应所需的基质生物合成的促炎介质(11,12]。激活树突状细胞和巨噬细胞开关迅速从静止到激活状态不同的代谢轮廓的特征。特别是,有限合伙人或经典激活macrophages-also称为M1 macrophages-have高糖酵解和磷酸戊糖途径而克雷布斯循环坏了在两个点和脂肪酸氧化和氧化磷酸化表达下调(11,12]。克雷布斯循环的两个断点琥珀酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶和琥珀酸和柠檬酸循环的顺向取款。柠檬酸的大部分流向柠檬酸通路,柠檬酸的线粒体运输载体(中投)和ATP酶柠檬酸裂解酶(ace) [13- - - - - -16]。中投公司出口柠檬酸的线粒体换苹果酸。在细胞溶质,ac劈开成草酰乙酸(OAA)和acetyl-coenzyme(乙酰辅酶A)。OAA由胞质苹果酸转化为苹果酸脱氢酶1 (MDH1)和丙酮酸的苹果酸脱氢酶1(组织)与顺向生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。值得注意的是,NADPH氧化酶和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)需要NADPH活性氧和一氧化氮(NO⋅)合成,分别13,15]。乙酰辅酶A是加工成malonyl-coenzyme (malonyl-CoA)乙酰辅酶A羧化酶(ACC)。Malonyl-CoA是胆固醇和脂肪酸合成的底物。因此,它可以用于生产花生四烯酸、前列腺素E的前兆2(铂族元素2),炎症的关键调制器具有至关重要的作用在炎性疾病13,15]。蛋白质乙酰辅酶a也是一个衬底和组蛋白乙酰化作用17]。此外,柠檬酸是隐含在itaconate合成,调节生产不同的炎症介质,作为负调节炎症的18]。柠檬酸通路也有一个关键的角色在唐氏综合症等疾病和遗传病综合症(19,20.]。

红酒已经成为流行,近年来由于其内容的酚类化合物抗氧化活性以及降血脂药和抗炎作用。虽然不同的研究一直在进行红酒的化合物,其中大部分都是旨在调查化学成分、生物多样性、遗传多样性、谱系调整,一般抗氧化性能。在这项研究中,我们调查了有益的免疫调节效应的粉富含酚类化合物的红酒Aglianico del秃鹰。这是一个最好的意大利红酒,从未被研究过。我们专注于促炎和抗炎细胞因子的分泌,NF -κB表达,柠檬酸通路,表观遗传修饰在LPS-activated人类巨噬细胞。这样的研究将有助于确定目标RWP和潜在疗法的发展炎症慢性疾病的预防和治疗。

2。材料和方法

2.1。葡萄酒样品

红酒(葡萄LAglianico品种)是由食堂提供del Notaio (Rionero、意大利)。葡萄收获在2018年9月,葡萄压后样本收集,葡萄酒发酵完成后(没有残留糖到酒)。样本冷冻和冷冻干燥前储存在-20°C。葡萄酒样品(500毫升)玻璃量筒是连接到一个真空冷冻干燥设备和冷冻干燥使用恒星Millrock ST8S5-l冷冻干燥器(Millrock技术,金斯敦,纽约,美国)。

2.2。质和质/ MS分析

整体的一部分,dealcoholized葡萄酒样品于100年解散μL 40%的甲醇和0.1% ( )甲酸浓度为10毫克/毫升和离心机(5分钟,13000 rpm),和1μL整除在UPLC-ESI-Qtrap注入系统。spectrometry-based质量分析进行了评估的专业代谢物(花青色素,飞燕草色素和二甲花翠素葡萄糖苷,咖啡和香豆酸、白藜芦醇和槲皮素)。Quali-quantitative分析进行了使用一个API6500 Q-Trap光谱仪(美国AB Sciex,培育城市,CA)加上Nexerax2 UHPLC装置(日本岛津公司,京都,日本),在正面和负面MRM工作模式。

仪器参数优化直接注入方案包含纯化合物。Kinetex列(Phenomenex) (C18 100, )采用色谱分析,化合物分离使用线性梯度从5%到50%的乙腈(洗脱液B)和水含0.1%甲酸(洗脱液)在5分钟之后速度梯度,直到95%的流量为0.35毫升/分钟,和注射量是1吗μl .进行准确的定量分析,8点(范围0.010 -10μg / mL)建造了校准曲线的标准化合物。的意思是 从至少三个实验报告。所有数据处理使用分析软件(ABSciex)和鉴定的化合物以保留时间为依据,准确的质量测量,MS / MS数据,探索特定的光谱库和公共存储库MS-based代谢组学分析(21),与文献中报道的资料(7,22- - - - - -25]。

2.3。人类单核细胞从全血的隔离

主要人类单核细胞分离得到健康的捐赠者在获得书面知情同意。这项研究是在协议与赫尔辛基宣言和人类研究按照委员会批准程序。静脉血液被收集到K2 EDTA-coated BD真空采血管管(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)。外周血单核细胞(PBMCs)隔开histopaque - 1077 (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)密度梯度离心法:全血混合着汉克斯平衡盐溶液(哈佛商学院,Sigma-Aldrich)比1:2 ( ),分层的histopaque - 1077 (Sigma-Aldrich)和离心机1000 x g 15分钟。单核细胞的层(PBMCs)间期恢复,在哈佛商学院洗两次。PBMCs孵化了CD14抗体结合磁珠(mac®, Miltenyi研究GmbH, Bergisch格拉德巴赫,德国)15分钟在4°C。洗后,细胞被加载到mac®列(Miltenyi研究GmbH)放置在一个磁场,和CD14 -积极(CD14+)和CD14-negative (CD14- - - - - -)人口划分。CD14的+单核细胞是分化人类巨噬细胞通过使用100 ng / mL - csf在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)补充10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。

2.4。细胞培养和治疗

Sigma-Aldrich 293年人类胚胎肾细胞(HEK293)是生长在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM热费希尔科学)补充10%胎牛血清,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素在湿润商会有限公司为5%2在37°C。评估的免疫调节和抗炎作用Aglianico del秃鹰红酒,主要人类单核细胞和HEK293细胞治疗RWP 20或200μ克/毫升1小时。然后,炎症引起的1μ克/毫升的脂多糖的分离和纯化大肠杆菌应变EH100 (AdipoGen生命科学公司,圣地亚哥,美国)。除了细胞因子和铂族元素2量化,细胞被洗两次与PBS的有限合伙人进行前处理后续的分析,如下面进一步详细。

2.5。细胞计数

CD14+单核细胞被播种到96孔板( 细胞/)和处理各种RWP浓度:2.5,5、10、20、50、100、200,400,800,1600,3200μ克/毫升。72小时后,细胞计数是由使用自动手持权杖2.0细胞计数器(默克密理博、瑞士)。

2.6。细胞因子的量化

CD14+单核细胞( 细胞)进行预处理与RWP 24-well板20或200μ克/毫升1小时然后刺激1μ有限合伙人的g / mL。收集24小时后,浮在表面的游离和化验白细胞介素1的浓度β、6、10 (il - 1β、il - 6和il - 10)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)通过Luminex100系统(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国)使用特定匹配配对抗体和重组细胞因子标准遵循制造商的建议。

2.7。西方墨点法

细胞颗粒在Laemmli resuspended缓冲区和煮5分钟在100°C。30毫克的蛋白质受到sds - page然后electroblotted硝化纤维膜上。1小时的膜被封锁在tris-buffered盐水(TBS)解决方案包含5%的脱脂奶粉和0.5%的渐变20,然后应用在4°C隔夜anti-NF -κB / p65 (ab7970 Abcam,剑桥,MA), anti-CIC [26,27),anti-ATP柠檬酸裂解酶(ab157098 Abcam) anti-acetylated H3 (ab47915 Abcam) anti-total H3 (ab1791 Abcam) anti-AnxA1 (GTX101070 GeneTex)和anti-FPR2或反β肌动蛋白(ab8227 Abcam)抗体。小时后孵化与合山羊anti-Rabbit免疫球蛋白二次抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),使用辣根过氧化物酶底物的免疫反应被发现WesternBright™发射极耦合逻辑(美国Advansta,门洛帕克,CA)在Chemidoc™XRS探测系统配备图像实验室软件图像采集与光密度分析(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。

2.8。瞬时转染

监测的活动NF -κB信号通路,暂时HEK293细胞转染和NF -κB记者质粒含有萤火虫荧光素酶基因由5 NF -副本κB响应元件(5 - - - - - -GGGACTTTCC-3 )位于上游的最小启动子(pGL3-5xNF - TATA框κB)。测量SLC25A1基因启动子活动,HEK293细胞转染如前所述[28)使用pGL3 basic-LUC向量(WI Promega,麦迪逊,美国)包含1785 /−−20 bp SLC25A1基因启动子区域(SLC25A1pGL3)上游的荧光素酶报告基因(29日]。ace基因启动子活动,在pGL3, basic-LUC向量是克隆3116 /−−20 bp ace基因启动子区域(称为“3000”)或删除本地区的片段(称为“1000”)(30.]。规范化转染的程度,细胞转染与10 ng pRL-CMV (Promega)。转染24小时后,HEK293细胞触发与LPS存在与否的RWP 20或200μ克/毫升。后的第二天,细胞是细胞溶解和化验LUC活动通过Dual-Luciferase®记者分析系统(Promega),根据制造商的协议。

2.9。免疫细胞化学

细胞与LPS诱导1或3小时的存在与否RWP 20或200μg / mL,然后洗在PBS和固定用3%多聚甲醛交联的解决方案。与PBS + 0.25%透化作用后特里同x - 100 (PBST)和阻塞PBST + 1% BSA(牛血清白蛋白),细胞与anti-NF -孵化κB / p65 (ab7970 Abcam)主要抗体在一夜之间在4°C。488年后的第二天,Alexa萤石(热费希尔科学)被用作二次抗体与DAPI Fluoroshield安装介质时(ab104139 Abcam)是用来保护DNA荧光和复染色。用荧光显微镜获得的图像(evo不健全细胞成像,热费希尔科学)。

2.10。量化的柠檬酸

柠檬酸的量量化在巨噬细胞对有限合伙人的存在与否RWP 20或200μg / mL的荧光方法使用柠檬酸比色/荧光测定工具包(美国BioVision苗必达,CA)按照制造商的指示。

2.11。交流活动

主要的单核细胞使用RWP 20或200年μ克/毫升1小时,然后激活巨噬细胞与有限合伙人。治疗结束时,细胞在冰冷的PBS洗两次。细胞颗粒在冰冷的resuspended PBS NP40 0.1%,和三个freeze-melt周期(-80°C 8分钟/ 4分钟40°C)进行。离心后,上清液收集和蛋白质浓度由布拉德福德分析决定。交流活动由耦合评估方法(苹果酸脱氢酶31日,32,如前所述30.]。具体交流活动被表示为一个百分比控制规范化后的蛋白质浓度。

2.12。ROS,没有⋅和铂族元素2检测

评估ROS也没有⋅水平,CD14+单核细胞的存在与否是由有限合伙人RWP 20或200μ克/毫升。表明,细胞治疗也有5毫米苹果酸钠(Sigma-Aldrich)或者500μM NADPH (Sigma-Aldrich)。24小时后,ROS和没有⋅通过使用6-Carboxy-2浓度测定 ,7 - - - - - -二乙酸Dichlorodihydrofluorescein (DCF-DA热费希尔科学)和4-Amino-5-Methylamino-2 ,7 - - - - - -Difluorofluorescein二醋酸盐(二乙酸DAF-FM热费希尔科学),分别如前所报道(33]。

对铂族元素2量化,细胞暴露在RWP 20或200μg / mL为1小时,表明,cotreated与5毫米醋酸钠(Sigma-Aldrich);然后被LPS诱导炎症。在48小时内有限合伙人治疗;铂族元素2测量用DetectX®前列腺素E2灵敏度高免疫(美国,化验,安阿伯市MI)如前所述[33]。

2.13。统计分析

结果显示为 的,至少三个独立的实验。决心利用统计学意义上的差异单向方差分析紧随其后的是Dunnett的或图基的测试多个比较。每个实验使用的统计方法是详细图传说。星号图表示统计学意义: , ,和 。当图基的事后测试执行,不同字母表示治疗之间的显著差异 。

3所示。结果

3.1。红酒的成分和识别粉组件

红酒粉Aglianico del秃鹰是在真空冷冻干燥。Quali-quantitative RWP是由LC-ESI-QTrap-MS / MS分析和LC-ESI-QTrap-MS分析。Kinetex列的使用和LC-ESI-MS / MS(交替积极和消极电离模式)允许同时分离和鉴定的化合物。化合物鉴定显示很好的结果优化的色谱柱的保留时间,范围从1.21到2.51分钟。每个化合物提取离子色谱图呈现在图S1。确定了各个组件相比之下的 总离子流中的值(TIC)概要文件与所选文献中描述的化合物。特别是,七个化合物中确定RWP(表1)属于各种结构不同的代谢类:酚酸(咖啡酸和p-coumaric酸);对称二苯代乙烯(白藜芦醇);花青素(delphinidin-3-O-glucoside cyanidin-3-O-glucoside,二甲花翠素3-O-glucoside);和黄酮醇(槲皮素)。

表1
红酒粉的组成(RWP)获得Aglianico del秃鹰(收获2018)。质量spectrometry-based分析进行评估的专业RWP代谢物。的 (SD)从至少三个独立的实验,每一式三份,报告。

测试Aglianico del秃鹰红酒粉含有大量的花青素。特别是malvidin-3 -O葡萄糖苷是最丰富的( 毫克/ 100毫升),其次是cyanidin-3 -O葡萄糖苷( 毫克/ 100毫升)和delphinidin-3 -O葡萄糖苷( 毫克/ 100毫升)(表1)。我们的结果是按照典型的花青素的分析Aglianico酒,二甲花翠素3 -O配糖体代表大约60%的总花青素而cyanidin-3——内容O葡萄糖苷和delphinidin-3 -O配糖体非常低(5%左右)34]。中白藜芦醇的含量Aglianico del秃鹰是 毫克/ 100毫升,类似于其他意大利红酒26,35,36]。咖啡酸的浓度p -香豆酸是 毫克/ 100毫升 分别毫克/ 100毫升。槲皮素决心等于 毫克/ 100毫升,列在表中1。

3.2。评价RWP以初级人类单核细胞毒性

我们接下来研究RWP毒性。主要人类单核细胞,从健康献血者外周血分离,采用RWP浓度的增加,从3200到2.5不等μ克/毫升。72小时后,进行细胞计数。如图1,RWP并不影响细胞的数量到800年的剂量μ克/毫升。观察一个轻微的细胞毒性测试浓度最高的1600年和3200年μg / mL,减少细胞数量与未经处理的细胞(0)分别约20%和40%,分别为( ,Dunnett多个对比测试)。


图1
RWP对主要人类单核细胞数量的影响。主要人类单核细胞治疗RWP浓度的增加,从3200到2.5不等μg / mL,由细胞计数和细胞生存能力评估后72小时暴露。的 三个独立的实验在每个显示四个复制。差异显著( )根据单向方差分析。Dunnett多个对比测试是运行事后测试比较治疗组与对照组(0,设定为100%);表示,差异具有统计学意义( )。
3.3。RWP对il - 1的分泌的影响β、il - 6、TNF -α和细胞因子il - 10

开始了解这个RWP对人体的影响,分析其职业——和消炎作用。我们主要治疗人类单核细胞与有限合伙人,一个组件的革兰氏阴性细菌外膜诱发炎症级联通过toll样受体4 (TLR4) [27]。有限合伙人导致的快速激活促炎细胞因子il - 1β、il - 6和TNF -α(37)和il - 10的生产,一个强有力的抗炎细胞因子。

因此,我们评估了释放il - 1β、il - 6、TNF -α24小时后,il - 10细胞因子刺激单核细胞与LPS RWP的存在与否。我们观察到显著、显著提高的水平与LPS诱导后的细胞因子分析(数据2(一个)- - - - - -2 (d):如果细胞vs。有限合伙人, ,图基的测试)。RWP降低il - 1β、il - 6和TNF -α分泌剂量依赖性的方式(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。具体地说,在一个剂量的200μg / mL, RWP显著减少了一半的水平与LPS刺激后,释放的促炎细胞因子的剂量而RWP 20μg / mL降低il - 1的含量β、il - 6和TNF -α(数据2(一个)- - - - - -2 (c):有限合伙人vs。 20μg / mL, p < 0.001,图基的测试),约为35%。另一方面,il - 10水平显著增加浓度的方式当单核细胞治疗RWP相比只有有限合伙人(图被触发2 (d):有限合伙人vs。 20μg / ml - 200μg / mL, ,图基的测试)。

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图2
RWP影响il - 1的分泌β、il - 6、TNF -α和细胞因子il - 10。主要人类单核细胞与RWP孵化和激活巨噬细胞和1μ克/毫升有限合伙人。24小时后,促炎il - 1的含量β(一)、il - 6 (b), TNF -α(c)和抗炎细胞因子il - 10 (d)在细胞培养上清液测定。价值观代表了 三个独立实验的四个复制。根据单向方差分析,il - 1的差异β(一)、il - 6 (b), TNF -α(c)和il - 10 (d)水平显著( )。因此,图基的事后考验执行,不同字母表示治疗之间的显著差异 。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μ克/毫升。
3.4。Aglianico del秃鹰红酒粉调节Proresolutive AnxA1在炎症条件下蛋白质的表达

我们接下来关注的角色AnxA1 / FPR2轴LPS-induced炎症在体外。AnxA1 proresolutive蛋白诱导和激活炎症期间,旨在限制组织损伤和恢复体内平衡通过激活甲酰肽受体2 (FPR2) [3]。有限合伙人治疗减少总AnxA1表达式,而与RWP预处理,在浓度(20或200使用μg / mL),能够恢复其生理量,从而防止细胞进行过度的炎症(图3(一个))。此外,表达FPR2受体表达下调了有限合伙人管理(图3 (b))。虽然不显著,RWP略微增加FPR2表情,只造成一个积极的趋势(图3 (b))。

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图3
RWP显著恢复表达AnxA1 LPS-induced炎症。主要人类单核细胞与RWP孵化20μg / mL或RWP 200μ1 g / mL和激活μ克/毫升有限合伙人。表达AnxA1 (a)和FPR2 (b)评估后24 h与LPS处理。介绍过o。d。邓肯蛋白表达是量化利用光密度()比AnxA1或FPR2 vsβ肌动蛋白;在免疫印迹图像归一化值获得。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μ克/毫升。
3.5。影响表达式,推广活动和NF -核易位κB

当LPS结合TLR4在巨噬细胞的表面,导致转录信号转导级联的特定的酶,如COX2、矩阵metalloproteinase-9,炎性细胞因子TNF -α、il - 1、il - 6、引发和趋化因子(38]。NF -κB通路中起着核心作用的保护特性摄入适量的酒(39]。因此,我们评估如果红酒粉Aglianico del秃鹰会影响NF -κB通路。我们专注于NF -的表达κB,其启动子活性和细胞定位。

为此,人类单核细胞主要是对有限合伙人RWP的存在与否。LPS诱导明显过度的亚基p65 NF -κB(图4(一))。RWP,用作20μ克/毫升和200年μp65 / NF - g / mL,减少κ(图B蛋白质含量约40%4(一))。同样,即使显著(图基的测试),没有强烈的差异被发现在抑制NF -的能力κB RWP 20之间的推广活动μg / mL, RWP 200μ克/毫升(图4 (b))。监控RWP NF——的影响κB信号转导通路,暂时HEK293细胞转染和NF -κB记者质粒含有萤火虫荧光素酶基因由5 NF -副本κB响应元件位于启动子上游的最小的塔塔框。激活后炎性刺激内源性NF -κB与DNA结合响应元素,诱导荧光素酶报告基因的转录。细胞治疗有限合伙人时,我们观察到荧光素酶活性显著增加,相比,未经处理的细胞(图4 (b)Cvs。有限合伙人, ,图基的测试);RWP报道LPS-triggered细胞的荧光素酶活性水平值相似的控制。接下来,我们分析了p65的细胞定位,NF -亚基κ1小时后(图4 (c)(图)和3小时4 (d)与有限合伙人)的治疗,我们观察到的亚基p65易位NF -κB细胞溶质的细胞核。在细胞cotreated RWP,主要NF -κB本地化是胞质(数据4 (c)和4 (d))。总之,这些数据表明,在抑制NF - RWP扮演一个角色κB通路。

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图4
RWP抑制NF -κ转录因子。(一)主要人类单核细胞与RWP孵化20μg / mL或RWP 200μ1 g / mL,激活巨噬细胞μ克/毫升有限合伙人。特定的抗体检测单元p65 NF -的表达水平κB和β肌动蛋白。immunolabeled蛋白带的强度是衡量一个定量软件和规范化β肌动蛋白;报告在免疫印迹图像获得的值。蛋白表达水平控制样本作为1,和其他样本表示的比例控制。(b)和NF - HEK293细胞转染κ荧光素酶报告质粒和对有限合伙人的存在与否RWP 20μg / mL或RWP 200μ克/毫升。条形图报告 三个独立的实验,每一式三份。根据单向方差分析,差异显著( )。因此,图基的事后考验执行,不同字母表示治疗之间的显著差异 。(c - d)免疫细胞化学实验进行识别的细胞定位单元p65 NF -κB,被一个特定的抗体。细胞治疗RWP 20μg / mL或RWP 200μg / mL,与LPS激活。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μ克/毫升。
3.6。影响柠檬酸出口途径:关注中投和柠檬酸

在NF -促炎基因激活κB是SLC25A1柠檬酸,编码线粒体载体(CIC)。它的组件是柠檬酸通路负责出口柠檬酸退出克雷布斯循环LPS刺激后细胞溶质(13,14]。

人类的SLC25A1子包含两个NF -κB响应元素位置−414 / 1314 405 bp和−−−1305个基点。验证如果RWP诱导的转录率变化SLC25A1子,我们转染HEK293细胞与前所述SLC25A1pGL3-a向量SLC25A1启动子包括1785 /−−20基点的区域SLC25A1基因克隆的上游的荧光素酶报告基因29日]。接下来,我们对待有限合伙人,RWP的存在与否。我们发现RWP显著降低荧光素酶活性剂量依赖性的方式50% (RWP 20μg / mL)和60% (RWP 200μ在LPS刺激(g / mL)细胞中图基的测试,图5(一个))。我们也测量了中投公司的蛋白质含量和蛋白质水平差别证实了对这些(图5 (b))。然而,我们没有观察到剂量依赖性效应在蛋白质水平。LPS诱导的三倍超表达中投对未经处理的细胞(图5 (b)),和RWP 20μ克/毫升和200年μg / mL,中投公司报道水平值控制细胞(图类似5 (b))。记者发现降低柠檬酸在胞质水平:RWP 20μg / mL或200μg / mL胞质减少大约40%的柠檬酸对LPS-triggered细胞(图5 (c))。

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图5
柠檬酸RWP对中投和胞质。(a)与SLC25A1pGL3暂时HEK293细胞转染,的pGL3 basic-LUC向量包含1785 /−−20 bp的区域SLC25A1基因克隆的荧光素酶报告基因的上游。然后,细胞与有限合伙人在没有触发(LPS)或在RWP 20μg / mL或RWP 200μ克/毫升。如果细胞(c)被用作一个消极的控制。荧光素酶基因记者活动评估后24小时。人类单核细胞(b)主要与RWP preincubated 1小时20μg / mL或RWP 200μg / mL,中投公司与有限合伙人被激活巨噬细胞,蛋白水平进行评估。中投和β肌动蛋白的蛋白质是immunodecorated与特定的抗体。immunolabeled蛋白带的强度是衡量使用量化软件和规范化β肌动蛋白:报告在免疫印迹图像获得的值。蛋白表达水平控制样本作为1,和其他样本中表达的比例控制。(c)在细胞治疗(b),胞质柠檬酸水平量化。在(a)和(c),代表值 三个实验的三个复制。统计分析是由one-way方差分析紧随其后的是图基的测试为多个比较。不同的字母表示显著性差异 。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μ克/毫升。
3.7。影响柠檬酸出口途径:关注ATP柠檬酸裂解酶

交流是巨噬细胞激活调节早期由有限合伙人或TNF -α和/或干扰素γ(干扰素γ)以及在炎症条件下(15,19,20.]。确定影响RWP NF -κB绑定来交流,我们分析了启动子区域的人类中国国际皮革展基因。因为它包含一个活跃的NF -κB响应元件局部在2048 /−−2038个基点(15暂时),细胞转染与pGL3 basic-LUC向量包含3116 /−−20 bp的完整的区域中国国际皮革展基因启动子(称为“3000年,”图6(一)),包括NF -κB反应的元素。控制,我们也转染细胞突变,包含这个地区的截断版本(称为“1000年,”图6(一)),没有NF -κB反应的元素。两个质粒被用来测试RWP在荧光素酶活性的影响。没有结合位点的NF -κB负责较低中国国际皮革展基因启动子活性在细胞转染1000比3000(图6(一))。有限合伙人治疗24小时后,最强的子活动于3000年注册转染细胞( ,图6(一))。荧光素酶基因记者活动显著降低水平相似,如果细胞(3000,图6(一))RWP 20μ克/毫升和200年RWP到更低的水平μ克/毫升(图6(一))。RWP诱导一个平行的交流减少,蛋白质含量和酶活性LPS-triggered巨噬细胞(数字6 (b)和6 (c))。更详细,LPS诱导增加双重的交流表达水平(图6 (b))和一个交流活动(图将增长35%6 (c))。没有观察到显著差异之间RWP 20μ克/毫升和200年μg / mL将ace蛋白水平(图6 (b)(图)和活动6 (c))。这些结果,加上柠檬酸中投和胞质损耗,在immunometabolism定义RWP的至关重要的作用。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图6
RWP对交流的影响。(一)暂时HEK293细胞转染pGL3 basic-LUC向量包含3116 /−−20基点的完整的区域中国国际皮革展基因启动子(3000)或本地区的截断版本(1000)。然后,细胞与有限合伙人在没有触发(LPS)或在RWP 20μg / mL或RWP 200μ克/毫升。如果细胞作为消极的控制。荧光素酶基因记者活动评估后24小时。主要人类单核细胞,与RWP preincubated 1小时,被激活的巨噬细胞与有限合伙人,和蛋白质水平的交流(b)和乙酰化H3和总H3 (d)进行评估。在(b, d)交流,乙酰化H3,总H3,β肌动蛋白的蛋白质是immunodecorated与特定的抗体。immunolabeled蛋白带的强度是衡量使用量化软件和规范化β肌动蛋白:报告在免疫印迹图像获得的值。蛋白表达水平控制样本作为1,和其他样本中表达的比例控制。(c)在细胞治疗(b, d) ace酶活性被量化。在(a)和(c),代表值 三个实验的三个复制。统计分析是由one-way方差分析紧随其后的是图基的测试为多个比较。不同的字母表示显著性差异 。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μ克/毫升。

此外,它最近表明,快速代谢变化LPS-induced巨噬细胞是重要的增加ACLY-derived乙酰辅酶a,反过来导致组蛋白乙酰化作用(40,41),调节全球染色质可访问性和基因转录的关键。基因的转录调控巨噬细胞激活和失活或确定其偏振状态发生通过组蛋白修饰42]。因此,在炎症组蛋白乙酰化作用的变化有很大的影响。我们表明LPS刺激后交流的水平上升,增加H3组蛋白乙酰化作用(图的后果6 (d))。另一方面,细胞治疗与RWP降低乙酰化H3剂量依赖性的方式(图6 (d)),建议一个后生RWP的活动。

3.8。柠檬酸对炎症介质水平的影响下游的通路:ROS也没有⋅

自RWP下调中投和交流,我们分析它的作用在调节柠檬酸LPS-activated巨噬细胞的途径。柠檬酸乳沟由ac供应中介生物合成的三种炎症介质:ROS,不⋅和前列腺素E2(16]。柠檬酸在LPS-triggered巨噬细胞,积累是由中投公司出口从线粒体细胞溶质,通过交流转换成草酰乙酸、乙酰辅酶a。OAA转化为丙酮酸NADPH的顺向生产(43),用于ROS和没有⋅合成。我们的分析显示,增强和ROS的重要版本,也没有⋅当人类主要单核细胞治疗与有限合伙人(数字7(一)和7 (b))。RWP,另一方面,减少活性氧和一氧化氮的水平剂量依赖性的方式(数字7(一)和7 (b))。特别是,RWP 20μ克/毫升下降了10和活性氧的水平,没有15%⋅分别对细胞治疗只有有限合伙人;200年RWP减少引起的μ克/毫升(约20和35%的数字7(一)和7 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
RWP降低ROS也没有⋅水平,恢复了外源性酸盐和NADPH。主要人类单核细胞治疗与有限合伙人(左)在没有或仅在存在RWP +苹果酸和NADPH。24小时后,ROS (a)和没有⋅(b)水平进行评估,并表示如果细胞的比例(100%)。 三个复制独立实验在每个显示五个复制。根据单向方差分析,不同的ROS (a)和没有⋅(b)含量显著( )。因此,图基的事后考验执行,不同字母表示治疗之间的显著差异 。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μg / mL;M:苹果酸;护士:NADPH。

苹果酸和NADPH是两个代谢物下游柠檬酸通路:特别是,苹果酸在反应中催化产生MDH1,虽然NADPH来源于ME1乳沟的丙酮酸苹果酸。外源性酸盐单独使用或结合NADPH恢复ace抑制表型导致巨大的ROS和没有增加⋅炎症介质。如数据所示6(一)和6 (b),添加苹果酸单独或结合NADPH足以增加活性氧以及没有⋅水平与RWP LPS-triggered细胞治疗。因此,RWP ROS和没有的效果⋅通过柠檬酸通路抑制水平可能发生一起直接抑制NF -κB,控制交流的表达,但也的表达NADPH氧化酶和伊诺基因(44,45]。

3.9。抑制COX2和减少铂族元素2水平:柠檬酸的参与途径

最后,重点是其他炎性介质下游柠檬酸通路,铂族元素2,其合成和酶COX2负责。众所周知,葡萄酒多酚抑制COX2在LPS引起的炎症。Aglianico del秃鹰红酒粉20岁μ200克/毫升以及μg / mL COX2的表达水平降低几乎一半对巨噬细胞激活只有有限合伙人(图8(一个))。最强的减少测试RWP浓度最低的观察(图8(一个))。有趣的是,醋酸,柠檬酸的代谢物下游通路,恢复COX2诱导的抑制RWP(图8 (b))。铂族元素时观察到类似的趋势2水平测定细胞培养上清液与有限合伙人(图48小时后孵化8 (c))。在细节,RWP-stimulated细胞表现出铂族元素2如果细胞水平相似。我们观察到在铂族元素降低40%2水平相比LPS-triggered细胞。另一方面,乙酸的加入带来了铂族元素2水平(图8 (c))。这降低了铂族元素2水平很可能因为减少铂族元素2生产,由于降低了铂族元素的前兆2可以转化为乙酰辅酶a醋酸合成:乙酰辅酶a合成酶(ACSS),醋酸添加外源性救援ace抑制在铂族元素的影响2生产。这些数据,与以前的关于RWP ROS和没有的效果⋅加强,证实我们的假设,RWP的柠檬酸通路是一个目标,开展其抗炎活性。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图8
RWP降低COX2和铂族元素2的水平。主要人类单核细胞被激活的巨噬细胞与有限合伙人(LPS)没有或仅在存在RWP +醋酸和COX2 (a, b)和铂族元素2水平量化。在(a)和(b), COX2和β肌动蛋白的蛋白质是immunodecorated与特定的抗体。immunolabeled蛋白带的强度是衡量使用量化软件和规范化β肌动蛋白;报告在免疫印迹图像获得的值。蛋白表达水平控制样本作为1,和其他样本表示的比例控制。(c) 48小时后,铂族元素2水平进行评估和表达为未经处理的细胞的百分比含量(100%)。 三个复制独立实验在每个显示三个复制。根据单向方差分析,差异显著( )。因此,图基的事后考验执行,不同字母表示治疗之间的显著差异 。C:控制;L:有限合伙人;R20: RWP 20μg / mL;R200: RWP 200μg / mL;Ac:醋酸。

4所示。讨论

在这项研究中,第一次,我们有调查的生物属性Aglianico del秃鹰红酒,我们已经表明,它对潜在的健康益处多酚众所周知的由于其含量作为免疫调制剂和抗炎分子(1,2,5,6,9,10,46- - - - - -49]。

二甲花翠素3 -O葡萄糖苷和cyanidin-3 -O葡萄糖苷是我们已经找到了最丰富的酚类化合物,按照典型的花青素的分析Aglianico酒,二甲花翠素3 -O虽然cyanidin-3——葡萄糖苷代表约60%O葡萄糖苷和delphinidin-3 -O葡萄糖苷是大约5%的总花青素(34]。这些化合物中更高浓度对另一个DOC红酒Carignano del沟,培养在撒丁岛的西南地区(意大利)24]。在我们的示例中,对称二苯代乙烯白藜芦醇的浓度较低( 毫克/ 100毫升)比红酒从威尼托地区(意大利),白藜芦醇的平均为0.083毫克/ 100毫升(50)和坎帕尼亚地区(意大利)26]。另一方面,黄酮醇槲皮素更丰富Aglianico del秃鹰红酒,相比过去的坎帕尼亚的红酒,特别是对Aglianico del战后(26]。最后,在酚酸中,较高的咖啡酸被发现在我们的样例与葡萄酒相比跻身最佳葡萄酒消炎物质丰富的酚类化合物,如赤霞珠,梅洛,西拉,来47]。

人类主要单核细胞已经使用了我们的调查。细胞治疗的有限合伙人,触发先天免疫反应导致细胞因子il - 1的分泌β、il - 6和TNF -α和促炎介质被Aglianico del秃鹰粉。另一方面,RWP诱导释放il - 10,增加必要的启动宿主抵御微生物入侵(37]。然而,过度分泌的促炎细胞因子对寄主可能是有害的,因为它们导致全身性代谢和血流动力学干扰。出于这个原因,巨噬细胞产生il - 10,巨噬细胞产生的一种强有力的抗炎细胞因子作为负反馈机制抑制感染中过度的炎症反应。

这些数据符合救助效果RWP施加于AnxA1水平,减少在LPS激活。这种损伤可能会导致无法控制炎症导致慢性疾病后炎症和分辨率之间的不平衡(51]。因此,RWP可以用另一种调节炎症反应机制,控制相关的解决途径AnxA1 / FPR2轴。

体外和体内的研究报道,包含在红葡萄和红酒多酚能够废除LPS-mediated激活NF -κB顺向衰减的促炎细胞因子释放的风暴单核细胞(52),NF -κB通路已被确定为一个关键目标的防护性能温和的葡萄酒消费量。因此,我们的注意力被引导来评估的影响RWP NF -κ转录因子。是可以预料到的,RWP p65亚基的表达降低NF -κB,推广活动,和NF -核易位κNF - b作为结果κB抑制,SLC25A1和中国国际皮革展基因启动子活动降低中投和ace蛋白水平随之降低;平行降低胞质柠檬酸浓度和炎症介质与柠檬酸通路(ROS,没有⋅和铂族元素2)被观察到。显然,在ROS测试粉的效果,没有⋅和铂族元素2也可能的后果的直接抑制NF -κB因为在其转录控制是伊诺和COX2的基因编码。然而,柠檬酸的抑制通路的核心作用。事实上,治疗与代谢物下游柠檬酸通路移除RWP抑制性影响促炎介质:外生苹果酸单独或结合NADPH恢复减少ROS和没有⋅水平;乙酸在铂族元素做了同样的事情2浓度和COX2的表达水平。类似柠檬酸通路被发现参与唐氏综合症,在hydroxycitrate-a自然交流inhibitor-reduced典型prooxidant地位,但添加苹果酸或NADPH废除其抗氧化作用[19]。同样的,黄连木乳香树水溶胶展出其抗炎活性代理通过柠檬酸通路(30.]。

有趣的是,RWP施加其影响也在表观遗传水平上,如图所示,减少H3组蛋白的乙酰化作用。乙酰辅酶a,柠檬酸的产物途径所需的组蛋白乙酰化作用[17),代表了新陈代谢的关键节点由于其交点与许多代谢途径和转换,影响众多生命过程的监管。

除了对柠檬酸的影响途径,它不能排除RWP化合物包含在此酒可能有其他有益的影响。事实上,据了解,增加细胞因子il - 1β和肿瘤坏死因子-α后续增加粘附分子的表达,有利于脂质积聚在动脉粥样化和血管平滑肌细胞的特异表达活动53]。因此,减少促炎细胞因子的RWP也积极影响心血管系统。此外,由于炎症和ROS可能诱发一些microrna的增加/减少,包括氧化逆境应答microrna [54),它也可以推测,这些植物化学物质也会控制一些目标microrna的表达在正常和病理条件下(55]。例如,植物化学的儿茶素可以作为DNA甲基化的表观遗传调制器和染色质重塑,导致基因表达的改变和修改的microrna的活动(56]。其他有利影响,如葡萄糖稳态,线粒体功能、能量代谢、应激反应,被归结为酚类化合物(57]。然而,进一步的研究需要阐明这些RWP和其他潜在的有利影响。

总之,我们的研究首次强调了红酒的贡献Aglianico del秃鹰酚类调制的炎症反应。值得注意的是,我们的研究结果表明一个特定的签名这红酒展示自己的酚醛概要文件。底层机制是关联到不同的路径,包括抑制炎症介质和抑制NF -κB和柠檬酸通路。生物活性化合物等红酒二甲花翠素3 -O葡萄糖苷和cyanidin-3 -O葡萄糖苷、槲皮素和白藜芦醇可以抑制炎症介质通过NF -κB (46,48,49]。柠檬酸的参与途径是最强的新奇,因为这从来没有调查到目前为止可能为任何葡萄酒化合物的作用机制。在这里,我们表明,这个途径介导一些红酒的抗炎作用Aglianico del秃鹰酚类化合物。近年来,交流的激活和柠檬酸的CIC-constituents通路与炎症的存在条件(46,48,49]。因此,柠檬酸炎症途径似乎是一个新的充满希望的目标。在这种背景下,抑制了红酒Aglianico del秃鹰phenols-as分子机制调节巨噬细胞功能能够揭示非常有趣的应用程序在炎症慢性疾病的预防和治疗仅仅通过生物活性化合物的食物。

5。结论

第一次,这项研究调查了免疫调节和抗炎的潜在红酒粉(RWP)从意大利红酒Aglianico del秃鹰。RWP降低il - 1β、il - 6和TNF -α促炎的同时增加il - 10抗炎细胞因子的分泌和抑制NF -κB在LPS引起的巨噬细胞启动子活动。此外,RWP激活proresolutive通路通过恢复膜联蛋白A1水平。除了经典的巨噬细胞功能的目标,我们也确定柠檬酸通路RWP目标在执行其抗炎活动以来,通过减少中投和ace蛋白水平,ace酶活性,RWP降低ROS,没有⋅,铂族元素2和组蛋白乙酰化水平。整体研究证据表明Aglianico del秃鹰粉抑制炎症通路和激活proresolutive过程暗示RWP的潜在价值的预防和治疗炎症条件以及炎症慢性疾病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了FSC欧洲基金(批准号C31G19000020002)和教育部,大学和研究(MIUR)主要(批准号2017 nkb2n4_004)。

补充材料

图S1: MRM数据在两种混合标准溶液的正负离子。(补充材料)