文摘
阿司匹林丁香酚酯(爱意)是一种新的药物化合物酯化阿司匹林丁香酚,抗炎,抗氧化剂和其他药理作用。本研究旨在确定爱意的保护作用与H2O2全身的细胞凋亡在大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞和可能的机制。细胞生存能力分析的结果表明,爱意会增加PC12细胞的生存能力刺激H2O2独自一人,而爱意对PC12细胞的生存能力没有显著的影响。与对照组相比,活动的超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),以及谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)明显降低,丙二醛(MDA)的含量是在H显著增加2O2组。爱意预处理,MDA的水平降低,SOD水平,猫,氧化酶在H增加2O2刺激PC12细胞。此外,爱意能减少引起的PC12细胞凋亡的H2O2通过减少超氧化物阴离子、细胞内活性氧和线粒体ROS (mtROS)和提高水平的线粒体膜电位(ΔΨ米)。此外,免疫印迹结果显示,与对照组相比,p-PI3K的表达,p-Akt,和bcl - 2明显减少,而Caspase-3和伯灵顿的表达显著增加在H2O2组。爱意组,爱意预处理可以移植的表达p-PI3K, p-Akt和bcl - 2表达下调Caspase-3的表达和伯灵顿在PC12细胞刺激与H2O2。沉默的PI3K shRNA及其inhibitor-LY294002可以废除爱意在PC12细胞的保护作用。因此,爱意有保护作用2O2全身的PC12细胞通过调节PI3K / Akt信号通路抑制氧化应激。
1。介绍
越来越多的证据,氧化应激密切相关,人类神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病(AD)和亨廷顿氏舞蹈症(高清)1- - - - - -5]。过度生产活性氧(ROS)是氧化应激的主要原因之一(6- - - - - -9]。活性氧在体内主要包括羟基自由基、超氧化物阴离子,单线态氧(10- - - - - -12]。正常的ROS水平有助于维持正常的细胞功能。然而,过量的活性氧会刺激细胞不仅造成结构性损伤和促进氧化应激,还破坏了氧化还原平衡,导致细胞损伤和凋亡13- - - - - -15]。有很多体内抗氧化系统密切相关。抗氧化系统的主要作用是防止氧化损伤身体从细胞通过移除多余的活性氧16- - - - - -18]。事实上,体内动态平衡的氧化剂和抗氧化剂对神经保护非常重要(19- - - - - -21]。的关键细胞内抗氧化酶SOD,猫,氧化酶(22- - - - - -24]。ROS-mediated主要氧化应激激活固有细胞凋亡通路通过释放各种prodeath因素进入细胞质中线粒体受损(25- - - - - -27]。其中,PI3K / Akt通路是一个重要的信号通路促进神经元存活。研究表明,它能影响细胞生存通过抑制proapoptotic蛋白质的表达和诱导凋亡蛋白的表达的bcl - 2家族(28- - - - - -30.]。
作为一个新化合物,爱意在许多方面起到了积极的作用(31日- - - - - -40]。爱意可以防止老鼠的尾巴kappa-carrageenan引起的血栓形成(39]。同时,爱意可以减弱血栓与高脂肪饮食诱导大鼠通过调节血液流变学和血液生物化学(37]。进一步的研究,建立了大鼠血瘀模型,观察到爱意能减轻大鼠血瘀的症状(41]。它也表明了爱意可以抑制agonist-induced血小板聚集在大鼠通过调节PI3K / Akt信号通路(33]。爱意不仅抗炎的影响,antithrombosis, antiblood停滞而且antiatherosclerosis和其他心血管疾病的影响。先前的研究证明,爱意有抗氧化作用,可以降低H2O2全身的线粒体功能障碍通过调节bcl - 2和Nrf232,34]。目前尚不清楚爱意可以在神经退行性疾病发挥神经保护作用。本研究的目的是探索爱意能否减弱H2O2全身的PC12细胞氧化损伤及其可能机制。
2。材料和方法
2.1。化学物质
3% H2O2解决方案和二甲亚砜从σ(圣路易斯,密苏里州)。trypsin-edta rpmi - 1640培养基,0.05%,胎牛血清(的边后卫)来自Gibco(美国纽约大岛)。一步TUNEL细胞凋亡测定设备,嘌呤霉素盐酸盐,bicinchoninic酸试验装备,谷胱甘肽过氧化物酶的装备,过氧化氢酶试验装备,DAPI染色方案,二乙酸DAF-FM装备,dihydroethidium,超氧化物歧化酶和丙二醛测定装备获得Beyotime(上海,中国)。Anti-Bax、anti-Bcl-2 anti-Caspase-3来自Abcam(美国Cambridge, MA)。Anti-PI3K、anti-Akt antiphosphorylation-PI3K, antiphosphorylation-Akt从细胞信号技术,购买公司(美国贝弗利,MA)。Immobilon-PSQ转移膜得到微孔(美国Billerica的)。膜联蛋白V / FITC凋亡检测设备是双相障碍生物科学(美国圣地亚哥,CA)。pi3激酶LY 294002购买MedChemExpress LLC(美国新泽西州)。Lipofectamine™3000转染试剂购自热费希尔科学,Inc .(美国表达载体)。慢病毒控制和PI3K shRNA U6-MCS-Ubiquitin Cherry-IRES-puromycin)从GeneChem购买(上海,中国)。
2.2。细胞培养和细胞治疗
PC12细胞经常保持rpmi - 1640中含有10%的边后卫( )在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2然后随机分为对照组,H2O2组和爱意预处理组。
2.3。细胞生存能力
细胞生存能力通过CCK-8试验确定。简单地说,PC12细胞( 4细胞/)镀96孔培养板和孵化24 h。10μL CCK-8的解决方案是添加到每个。可行的细胞的数量是由吸光度的测量评估在450海里。
2.4。TUNEL染色
PC12细胞( 4细胞/)被播种到12-well文化板块。治疗后,细胞被洗PBS和4%多聚甲醛固定在PBS 25°C为30分钟。PBS的细胞被洗两次后,添加0.3% Triton x - 100 PBS和孵化25°C 5分钟。井与PBS洗两次,TUNEL检测解决方案是补充道。孵化后的细胞在37°C 1 h, DPAI染色的解决方案是添加和孵化在室温20分钟。PBS的细胞被洗。使用扫描激光共焦显微镜图像捕获(LSM800,卡尔蔡司,德国)。
2.5。流仪结果
PC12细胞被播种6-well板。治疗后,PC12细胞被评估使用相应的商业工具根据制造商的协议(34]。PC12细胞分类的流式细胞分析仪(BD FACSVerse、钙、美国),并与FlowJo 7.6的数据进行了分析。
2.6。线粒体膜电位(ΔΨ米)化验
的ΔΨm决心使用MitoTracker®红CMXROS(表达载体;热费希尔科学,Inc .)。简单,细胞被播种在12-well盘子。MitoTracker®红色探针直接加入培养基和培养30分钟37°C在黑暗中。使用扫描激光共焦显微镜图像捕获(LSM800;德国卡尔蔡司)。
2.7。测量细胞内超氧化物阴离子和总细胞和线粒体ROS生成
细胞内线粒体ROS生成和超氧化物阴离子测定使用DCFH-DA或MitoSOX™红色探针或Dihydroethidium(她)如前所述42]。
2.8。测定MDA, SOD、氧化酶和猫
氧化酶的活动MDA, SOD, CAT在PC12细胞中被评估使用相应的商业工具根据制造商的协议(43,44]。
2.9。蛋白表达分析
bcl - 2的表达,伯灵顿,Caspase-3 PI3K, Akt, phospho-PI3K, phospho-Akt被免疫印迹分析评估。细胞样本细胞溶解在冰上裂解缓冲包含鸡尾酒蛋白酶抑制剂和蛋白质磷酸酶抑制剂(美国罗克福德热费希尔科学,Inc .)。蛋白质浓度使用bicinchoninic酸(BCA)量化分析工具(Beyotime、上海、中国)。蛋白质样品被使用4 - 20% sds - page分离预制梯度聚丙烯酰胺凝胶(上海Suolaibao生物技术有限公司,上海,中国。通过sds - page分离后,蛋白质被转移到PVDF膜。这些墨迹被孵化与主要抗体,随后孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体。结果发现使用G:盒子化学XRQ成像系统(英国剑桥)。
2.10。细胞转染
慢病毒载体表达PI3K成分或控制成分来源于GeneChem(上海,中国)。制造商的协议后,PC12细胞cotransfected与慢病毒包装向量使用Lipofectamine 3000。慢病毒转染48 h后收获,离心机,透过0.45μm膜过滤器(微孔)。慢病毒转导在50%汇合的PC12细胞。稳定细胞被选择中选择1μ克/毫升嘌呤霉素。
2.11。后测定细胞凋亡抑制信号通路
PI3K / Akt信号通路在PC12细胞被抑制短发卡RNA(成分)和抑制剂对PI3K LY 294002。在这部分,分为11个组。这些PC12细胞治疗与4.0μM爱意和H2O2根据协议中描述的部分2。2。
2.12。统计分析
使用SAS 9.2执行统计分析软件(SAS研究所Inc .,卡里、数控、美国)。被定义为统计意义值< 0.05。统计分析是应用于所选对。
3所示。结果
3.1。爱意保护细胞的可行性2O2刺激PC12细胞
如图1(一)不同浓度的爱意对PC12细胞生存能力没有显著影响。与对照组相比,100年μM H2O2治疗12 h可以显著减少PC12细胞(数据的可行性1 (b)和1 (c))。如图1 (b)爱意的最佳工作时间是8小时。相比之下,H2O2集团PC12细胞的生存能力显著增加后使用不同浓度的爱意(1.0、2.0和4.0μ为8 h (M)数据1 (b)和1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。爱意抑制H2O2全身在PC12细胞凋亡
细胞凋亡的形态被DAPI染色法评估。与对照组相比,细胞核明显小,亮度增强,细胞凋亡的特征有H2O2组(图2(一个))。评估apoptosis-induced DNA碎片,TUNEL检测。与对照组相比,TUNEL-positive细胞的数量(红色荧光)的PC12细胞治疗H2O2显著增加(图2(一个)和2 (b))。流式细胞术的结果表明,H2O2能显著增加PC12细胞凋亡,而爱意可以抑制H2O2全身的PC12细胞凋亡(数字2 (c)和2 (d))。此外,不同浓度的爱意(1.0、2.0和4.0μ米)可以抑制PC12细胞的凋亡诱导H2O2。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。爱意对抗H2O2全身在PC12细胞氧化应激
验证PC12细胞的氧化还原状态的变化,超氧化物阴离子的水平,总活性氧和线粒体活性氧(mtROS)被发现。爱意单独超氧化物阴离子的含量并没有改变,细胞内ROS, mtROS。与对照组相比,100年μM H2O2可以显著提高超氧化物阴离子的水平,细胞内ROS,和mtROS。预处理为1.0、2.0和4.0μM爱意8 h可以显著抑制超氧化物阴离子的生产,总ROS, mtROS由h2O2(数据3(一个)- - - - - -3 (d),3 (f),3 (h))。此外,线粒体膜电位(ΔΨ米)进一步检测。结果表明,爱意就没有影响ΔΨPC12细胞的m(数字3 (e)和3 (g))。爱意预处理能显著增加ΔΨ米在PC12细胞中,而H2O2集团(数据3 (e)和3 (g))。结果表明,爱意可以显著减轻PC12细胞的线粒体功能障碍通过抑制细胞内ROS, mtROS,超氧化物阴离子的水平。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4。爱意增强ROS-Scavenging酶酶活动的H2O2刺激PC12细胞
活动的MDA, SOD、氧化酶和猫在细胞被发现探索爱意衰减的可能机制2O2全身在PC12细胞损伤。H2O2可以显著提高活动的MDA和SOD的活性,减少氧化酶,和猫,与对照组相比。然而,爱意预处理能显著提高SOD的活动、氧化酶、猫和降低MDA(人物的活动4(一)- - - - - -4 (d))。这些结果表明爱意预处理可能减弱H2O2全身的PC12细胞氧化损伤增加ROS-scavenging酶的酶的活动。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。爱意调节Apoptosis-Related蛋白的表达在H2O2刺激PC12细胞
分子机制的进一步探索爱意衰减H2O2全身的细胞凋亡在PC12细胞中,我们用免疫印迹检测Caspase-3的表达,bcl - 2,和伯灵顿。如数据所示5(一个)和5 (b)与对照组相比,H2O2可以显著提高伯灵顿的表达和Caspase-3减少bcl - 2的表达。相比之下,H2O2组,爱意可以显著逆转上述变化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。效果的爱意PI3K / Akt信号通路在PC12细胞刺激H2O2
PI3K / Akt信号通路在调节神经细胞凋亡中起着重要的作用[45,46]。如图5H2O2显著减少的表达p-Akt p-PI3K但没有显著影响Akt和PI3K的表达与对照组相比。相比之下,H2O2组,爱意预处理能显著上调p-Akt的表达和p-PI3K PC12细胞(数字5(一个)和5 (b))。有趣的是,爱意还没有显著影响Akt和PI3K在PC12细胞的表达。这些结果表明,H爱意可能有保护作用2O2全身的PC12细胞通过PI3K / Akt通路。
PI3K抑制剂LY294002和成分被用来抑制PI3K的表达(图6(一))。流式细胞术结果显示,与对照组相比,H PC12细胞的凋亡率2O2组显著增加,而爱意+ LY294002治疗组和爱意+ PI3K shRNA集团不能抑制PC12细胞的凋亡诱导H2O2(数据6 (b)和6 (c))。上述结果表明,爱意可以减轻氧化损伤引起的PC12细胞的H2O2通过PI3K / Akt通路。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
上述研究表明,爱意变弱H2O2全身通过抑制氧化应激在PC12细胞氧化损伤。主要表现在抑制超氧化物阴离子的生产,MDA,细胞内ROS, mtROS和猫的活动增加,SOD和氧化酶。
PC12细胞系来自大鼠嗜铬细胞瘤(18,47,48]。因为高导磁率的质膜H2O2H2O2全身的PC12细胞通常被认为是一个理想的细胞模型研究神经退行性疾病(49- - - - - -51]。研究表明,自由基积累之间的不平衡和抗氧化防御似乎是细胞死亡之间的联系和神经退行性疾病的恶化1,9,52]。ROS和由此产生的氧化压力在细胞凋亡发挥重要的作用。H2O2是一个重要的细胞内活性氧的来源,因为它可以穿透细胞膜,可转化为其他自由基,如超氧化物阴离子和羟基自由基(53,54]。H2O2也可以导致严重的攻击生物分子膜对细胞的损害,最终导致细胞凋亡55,56]。细胞生存能力的结果表明PC12细胞的生存能力下降约50%,此前12 h (100μM H2O2刺激。爱意预处理能显著增加引起的PC12细胞的可行性2O2。
过多的活性氧会导致细胞功能和细胞凋亡,特别是在神经退行性疾病(57- - - - - -59]。先前的研究发现,H2O2可能导致细胞内ROS的过度积累,mtROS和超氧化物阴离子在PC12细胞中。爱意预处理可以降低细胞内活性氧的增加,mtROS,她在PC12细胞中诱导H2O2。MDA可以破坏细胞膜60- - - - - -62年]。也是一个重要的生物标志物来评估细胞的氧化应激水平(61年,63年,64年]。此外,还有各种各样的酶清除活性氧在生物,如草地、氧化酶(猫,65年- - - - - -67年]。在正常生理条件下,这些抗氧化剂酶共同努力,保持身体的氧化还原平衡(68年]。SOD的超氧化物自由基催化转换O2和H2O2,而猫催化歧化反应的H2O2在H2O (69年,70年]。氧化酶防止有毒羟基和过氧化氢自由基的形成通过提供电子H2O2和脂质过氧化物71年]。研究表明,H2O2诱导PC12细胞可以产生过度的MDA,细胞内ROS, mtROS显著降低SOD的活动,氧化酶,猫。爱意预处理不仅降低MDA的含量,细胞内ROS,和mtROS PC12细胞SOD的活动也可增加,氧化酶,猫。之前报道,活性氧的积累会导致线粒体功能障碍的线粒体膜电位去极化(72年,73年]。线粒体膜电位(ΔΨ米)是一个敏感的指标来衡量线粒体的功能(74年,75年]。结果表明,有一个明显的细胞凋亡在PC12细胞H2O2刺激,细胞生存能力ΔΨm减少。正如所料,爱意预处理可以降低H2O2全身的细胞凋亡。这些结果表明爱意可以减少引起的PC12细胞凋亡的H2O2通过抑制活性氧的过量生产。
PI3K / Akt信号通路中发挥着重要作用细胞生存、分化、增殖和凋亡76年- - - - - -78年]。磷脂酰肌醇3激酶(pi3k)属于脂类激酶家族,在d 3磷酸化肌醇磷酸肌醇的头的位置,导致d 3磷酸的生产。PI3K介导细胞外信号转导和调节各种细胞事件,包括细胞有丝分裂、细胞生存,和膜运输。根据PI3K的域结构和底物特异性酶,它可以分为三个类别在哺乳动物(》)。其中,类我亚科是最广泛的研究。类我亚由四催化亚单位,包括三个IA亚基(p110α,p110β,p110δ)和一个IB亚基(p110γ)。当磷酸化PI3K的增加,它能传感信号通过肌醇3-phosphate-dependent蛋白激酶1(基因),一个丝氨酸/苏氨酸激酶。基因是招募细胞膜PI3K激活后,磷酸化和Akt, PI3K信号转导通路的主要媒介。丝氨酸/苏氨酸激酶,Akt是关键在细胞新陈代谢,生长,生存(79年,80年]。一种蛋白激酶被激活时,它在PI3K-mediated信号转导中发挥着关键作用81年- - - - - -83年]。一种蛋白激酶的磷酸化可以增加bcl - 2的表达,抑制线粒体的伯灵顿的表达。LY294002不仅是一种竞争dna - pk抑制剂也常用PI3K药物抑制剂,作用于ATP结合位点的PI3K酶,从而选择性地抑制PI3K-Akt连接。预处理与LY294002 2 h大大抵消爱意的保护作用。与此一致的是,使用shRNA击倒PI3K也有类似的结果。H2O2PC12细胞的治疗导致过度的细胞内活性氧的生产。的磷酸化PI3K可以被过度抑制活性氧的生产。然而,爱意预处理可以抑制PI3K磷酸化的减少引起的H2O2。线粒体和线粒体膜电位的恢复,将会减少细胞色素c的释放和抑制半胱天冬酶的激活的家人。同时,猫的酶活性,SOD,氧化酶被爱意改变预处理,进一步消除了过剩的活性氧PC12细胞(图7)。结果表明,爱意可以减轻H2O2通过上调全身的PC12细胞凋亡的表达p-PI3K, p-Akt和bcl - 2表达下调Caspase-3的表达和伯灵顿。
5。结论
爱意抑制氧化应激可能通过调节PI3K / Akt信号通路,从而保护PC12细胞凋亡引起的H2O2。建议爱意可能是一个新的潜在的药物来治疗神经退行性疾病引起的氧化应激。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
李j y的构思和设计实验。Z-D张进行实验和分析数据。刘X-W合成和纯化爱意。Z-Qin Y-J h Li Yang,(白提供试剂。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金的资助(31872518)。