文摘

背景。Bu沈易隋胶囊(BSYS)是中药处方,表明antineuroinflammatory治疗多发性硬化症(MS)和神经保护效应及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)。小胶质细胞在神经炎症发挥重要的作用。小胶质细胞参与的M1表型促炎这种疾病的过程,而M2表型具有抗炎作用。促进小胶质细胞的极化在MS / M2运算单元是一个有前途的治疗策略。本研究旨在探索BSYS对小胶质极化的影响。在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎方法。运算单元模型建立了百日咳毒素的腹腔内注射和皮下注射的髓少突细胞糖蛋白(MOG)_{- 55}在C57BL / 6 j小鼠。老鼠接受BSYS (3.02 g / kg), FTY720(0.3毫克/公斤),或蒸馏水胃内的管理。)和局部反馈染色,透射电子显微镜,存在,免疫荧光法、ELISA、荧光原位杂交、免疫印迹和用于检测髓的组织学变化,小胶质M1 / M2极化标记,和关键基因的表达参与运算单元。结果和结论。老鼠增加了体重,BSYS治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎临床评分降低,减少炎性浸润引起的髓鞘脱失。BSYS也抑制了M1的mRNA表达小胶质标记,同时增加M2的mRNA水平标记。此外,BSYS导致M1的比值显著降低小胶质细胞(进气阀打开⁺/ Iba1⁺)和一个平方米小神经胶质细胞的数量明显增加(__arg1⁺/ Iba1⁺)。小鼠模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎,mir - 124表达减少,和mir - 155表达增加,而BSYS治疗显著逆转这种效应和调制C / EBP的水平αPU.1, SOCS1 (mir - 124的目标基因和mir - 155)。因此,BSYS的神经保护效应对有关促进/实验性自身免疫性脑脊髓炎女士对M2极化小胶质细胞,这可能是与改变mir - 124和mir - 155体内。

1。介绍

多发性硬化(MS)是一种慢性炎症性疾病的中枢神经系统(CNS)的特点是髓鞘脱失(1),神经衰弱,对氧化应激的敏感性(2,3]。疾病通常发生在年轻人,其主要临床表现包括肢体无力、感觉异常、视力障碍、共济失调(4]。大约有250万人有全世界的女士5]。的神经免疫炎症反应的发病机制的研究中起着至关重要的作用,因此,抗炎策略在治疗女士吸引了太多的关注。

小胶质细胞巨噬细胞,位于大脑和脊髓和中枢神经系统的参与炎症过程6]。在炎症条件下在大脑中,如帕金森病、多系统萎缩,女士,小胶质细胞可能迅速激活和分化成M1和M2表型(7]。M1型小胶质细胞发挥强大的吞噬作用和释放促炎因子如肿瘤坏死因子(TNF)α白介素- 1 (IL)βil - 6,加重炎症反应,导致神经损伤(8]。不仅平方米小胶质细胞释放抗炎因子,包括il - 10,减少炎症的水平还分泌转化生长因子- (TGF)β促进组织修复和髓鞘再生9]。小神经胶质细胞分化的促炎M1型MS发病期间,导致体内M1 / M2的失衡,形成炎性微环境在中枢神经系统,导致髓鞘损伤。因此,开发新的药物,促进M2极化可能在神经退行性疾病提供了一种有效的治疗策略(10]。

基因表达的关键调节器、小分子核糖核酸(大鹏)近年来被广泛研究;它们参与转录后的调控和修改小胶质极化发挥重要作用。许多研究表明小胶质偏振调制的生物过程大鹏展翅的免疫炎症反应与女士/运算单元。mir - 124表达降低,中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎,mir - 155的增加(11,12]。然而,mir - 124 upregulation [13]或[差别mir - 155对这些14,15]体内明显减轻了运算单元的严重性。此外,mir - 124和mir - 155被认为是重要的监管机构平衡M1 / M2的比率(16,17),而一项研究表明,mir - 124不仅通过促进小胶质静止,也减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎的扭曲小胶质极化M1表型通过针对C / EBP M2表型α聚氨酯。1 (18]。此外,mir - 155为小胶质极化是重要的;它针对的是抑制细胞因子信号1 (SOCS1)促进小胶质细胞/巨噬细胞极化对M1表型(19),mir - 155不足导致从M1, M2 (20.]。因此,提升mir - 124的表达和减少mir - 155的表达可能是一个有前途的治疗方法治疗对实验性自身免疫性脑脊髓炎通过促进小胶质对M2表型转换。

越来越多的证据证实,中药在中国传统医学(中医)是有效的在治疗中枢神经系统的神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病(AD) [21,22),肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS) (23女士,之前的研究表明,许多中药处方和草药提取物对疾病有保护效应通过调制各种大鹏(24- - - - - -27]。因此,它是合理的探索新的治疗策略基于中医治疗但是沈女士易隋胶囊(BSYS)修改的刘伟Di黄丸,一个著名的中国传统配方,已用于临床治疗女士10年在天坛医院(中国,北京)。我们先前的研究发现BSYS可以改善脱髓鞘和轴突损伤通过调节Th17 / Treg细胞[28)和促进少突细胞祖细胞(OPC)成熟29日,30.]。本研究旨在评估老鼠BSYS在实验性自身免疫性脑脊髓炎的神经保护效应和小胶质极化受BSYS的潜在机制。

2。材料和方法

2.1。药物制剂

BSYS由以下中药:(生地黄根)、蜀(生地黄基数Praeparata)、Heshouwu (Polygoni Multiflori基数),大黄,(中药)Rhei Yimucao (Leonuri草),Zhebeimu (Fritillariae Thunbergii球),Shuizhi(水蛭)Quanxie(天蝎座),天马(天麻),Lianqiao (Forsythiae果实)。BSYS由Asia-East生物制药有限公司(中国,北京)。的详细描述BSYS制备和质量控制程序已发表在其他地方(31日][32]。Fingolimod (FTY720)被用作积极控制药品和购买从诺华(瑞士巴塞尔)。

2.2。动物

健康女性C57BL / 6 j小鼠在6 - 8周的年龄(重达15至17 g)购买的重要河流(中国,北京)和被安置在特定无菌(SPF)条件在12/12 h光/暗周期控制房间温度( °C)和湿度(40 - 50%)在首都医科大学实验动物中心。所有的老鼠实验的批准下进行动物实验和首都医科大学实验动物福利委员会(许可证号码:aeei - 2018 - 137)。

2.3。模型的建立和实验治疗

5毫克的髓少突细胞糖蛋白(MOG)_{- 55}肽,溶解在生理盐水(10毫升),乳化1:1完全弗氏佐剂补充0.3毫克结核分枝杆菌H37Ra(美国圣地亚哥BD生物科学)。接下来,0.2包含50毫升的乳液μ克撤走_{- 55}皮下接种成4个不同位置的女性C57BL / 6 j小鼠。0,第二天天postimmunization (dpi)、C57BL / 6小鼠腹腔注射500 ng百日咳毒素(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。

老鼠被随机分为四组:(1)正常对照组(NC, ),,模型组(2)实验性自身免疫性脑脊髓炎(实验性自身免疫性脑脊髓炎 ),(3)0.3毫克/公斤FTY720治疗组(33,34)(FTY720 ),和3.02克/公斤BSYS治疗组(BSYS, )。此外,临床等效剂量小鼠BSYS 3.02克/公斤,这是在我们之前的研究最优用量对实验性自身免疫性脑脊髓炎(35]。治疗组服用相应的每日剂量BSYS或FTY720通过填喂法,虽然同样体积的蒸馏水组用于NC和实验性自身免疫性脑脊髓炎。

动物模型建立后,观察小鼠的临床体征实验性自身免疫性脑脊髓炎每天40天基于以下的成绩。缺尾巴的分数如下:0,正常;1、部分瘫痪;2、完全瘫痪。每个下肢或前肢是评估如下36,37):0,正常;1、弱或改变步态;2、轻度瘫痪;和3,完全瘫痪的肢体。因此,根据这一评分系统,鼠标与完整的四肢瘫痪将得到14分,而死亡将拿下15分。

2.4。中枢神经系统组织病理学染色

在40 dpi,老鼠深麻醉,牺牲,包括磷酸盐(PBS)和4%多聚甲醛(PFA)。大脑和脊髓的部分从subventricular区(SVZ),胼胝体(CC)和腰椎扩大(LE)四组的老鼠沉浸在4% PFA 24 h,然后嵌入石蜡。组织部分(5μ米)受到苏木精和伊红染色())和Luxol快速蓝色(局部反馈)染色评估炎性浸润的程度和髓鞘脱失。炎症水平评估基于以下标准(38):0,没有炎症;1,血管周围的细胞只有渗透和脑膜很少;2,1 - 10细胞渗透单位面积(轻度细胞浸润);3、11 - 100细胞渗透单位面积(中度细胞浸润);4,> 100个细胞渗透单位面积(严重的细胞渗透)。如前所述,髓鞘脱失程度计算基于三分范围如下(39]: ; 髓鞘脱失; 髓鞘脱失;和 髓鞘脱失。

2.5。透射电子显微镜(TEM)

髓鞘脱失程度的评估,组织切成大约 毫米³块,放入2.5%戊二醛2 h,然后用0.1 PB冲洗缓冲三次。接下来,该组织与1%锇酸固定,脱水和酒精,浸泡20分钟,与包埋剂嵌入,烤和浸泡在纯嵌入剂。嵌入的样本使用超薄切片机切片,然后染色和涂层。然后在TEM下观察的部分(h - 7700;日立、日本)×5000的放大。g比率被定义为给定的轴突直径的比值和有髓纤维直径(40),测量每组50倍使用ImageJ(美国贝塞斯达国立卫生研究院)。

2.6。免疫荧光染色

大脑和脊髓的部分从SVZ的老鼠和四组deparaffinized,煮在95°C与柠檬酸缓冲20分钟,冷却到30°C,阻止了1%的牛血清白蛋白(BSA)在37°C 1 h。一夜之间被孵化的部分在4°C主要抗体Olig2 (1: 400;AF2418;研发系统,明尼阿波利斯,美国),CC-1 (1: 200;OP80;默克化工、达姆施塔特,德国),伊诺(1:200;ab210823;Abcam,剑桥,英国),精氨酸酶1 (__arg1;1:200;ab91279; Abcam, Cambridge, UK), Iba1 (1 : 200; ab48004; Abcam, Cambridge, UK), followed by 1 h of incubation with FITC- (1 : 400-) and TRITC- (1 : 200-) conjugated secondary antibodies (Southern Biotech, Birmingham, USA) at 37°C. Nuclei were counterstained with DAPI (Southern Biotech, Birmingham, USA). We used a fluorescence microscope to capture the images and then analyzed them using ImageJ.

2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

大脑和脊髓的样本均质使用高速均质器和离心机在4°C 5000×g 10分钟,然后,收集上清液。每个样本的上层清液中总蛋白浓度计算使用BCA蛋白质分析工具包(Applygen,北京)。肿瘤坏死因子的表达水平α,il - 1β、il - 6和il - 10测定使用ELISA试剂盒(Neobioscience、深圳、中国)根据制造商的协议。

2.8。实时定量PCR(存在)的分析

mRNA表达检测,存在分析使用一步qPCR工具包(Toyobo生命科学、大阪、日本)和SYBR绿色方法只连接实时PCR检测系统(美国大力神Bio-Rad)。基因扩增的引物如下:

主要组织相容性complex-II (mhc ii, FWD-GATGTGGAAGACCTGCG REV-TGCATCTTCTGAGGGGTTTC),诱导一氧化氮合酶(进气阀打开,FWD-CTGTGAGACCTTTGATGTCCGAAG REV-CTGGATGAGCCTATATTGCTGTGG)集群分化标记86 (CD86, FWD-GCCACCCACAGGATCAATTATCCT REV-AAAGAGAGAGGCTGTTGGAGATAC) Trem2 (FWD-TGGAACCGTCACCATCACTC REV-TGGTCATCTAGAGGGTCCTCC) __arg1 (FWD-CTTGGCTTGCTTCGGAACTC REV-GGAGAAGGCGTTTGCTTAGTTC)、CD206 (FWD-AGTGATGGTTCTCCTGTTTCC REV-GGTGTAGGCTCGGGTAGTAGT), C / EBPα(FWD-AGCTTACAACAGGCCAGGTTTC REV-CGGCTGGCGACATACAGTAC), PU.1 (FWD-CCCGGATGTGCTTCCCTTAT REV-TCCAAGCCATCAGCTTCTCC), SOCS1 (FWD-CACCTTCTTGGTGCGCG REV-AAGCCATCTTCACGCTGAGC)β肌动蛋白(FWD-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC REV-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC)。

实时PCR使用它连接实时系统和执行下列反应条件:孵化为60年代在95°C,紧随其后的是40 95°C的周期15秒(变性),60°C 15 s(退火)和72°C 45 s(扩展)。信使rna表达数据归一化β肌动蛋白表达,mir - 124水平/ mir - 155是规范化U6水平。数据分析使用相对量化(2^{- - - - - -ΔΔCt})方法。

2.9。hFluorescence原位杂交

荧光原位杂交(FISH)进行PFA-fixed,石蜡包埋部分检测mir - 124和mir - 155在大脑和脊髓的组织。染色是根据既定的协议执行。短暂,4% PFA-fixed石蜡包埋部分预热2 h在62°C。二甲苯用于移除石蜡组织。部分孵化在乙醇浓度的减少20 - 30分钟,然后用蛋白酶K孵化解决方案在37°C。脱水后,biotin-labeled米尔探针被添加到杂化解决方案和孵化一夜之间在37°C。在室温下的部分与DAPI复染色(RT) 8分钟(在黑暗中)。最后,我们用荧光显微镜观察切片。

2.10。液的分离和鉴定小鼠血清

液分离小鼠血清的使用一个exoRNeasy血清中期装备(试剂盒、希尔登,德国)制造商的协议。测量血清液囊的平均直径和尺寸分布(NTA)使用纳米粒子进行跟踪分析,执行和形态学评估使用TEM如我们之前所述的研究。液的生物标记物,如CD63、HSP70和TSG101在exosome-depleted检查媒体和液分离血清用免疫印迹分析。

2.11。免疫印迹分析

组织细胞溶解在缓冲里帕含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Beyotime生物技术研究所、海门、中国)。总从心肌由sds - page分离,分离蛋白转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。膜被封锁在Tris-buffered盐水渐变为0.1% (TBST)含5%脱脂奶粉1 h RT然后孵化通用抗体稀释剂(新细胞和分子生物技术、苏州、中国)使用适当的初级抗体在一夜之间在4°C。在这个实验中使用的主要抗体是针对以下抗原:伊诺(1:1000;ab210823;Abcam,剑桥,英国),__arg1 (1: 1000;ab91279;Abcam,剑桥,英国),C / EBPα(1:1000;18311 - 1 - ap;美国芝加哥Proteintech)、PU.1 (1: 2000;ab88082;Abcam,剑桥,英国),SOCS1 (1: 1000;YT4362;美国纽瓦克Immunoway)、CD63 (1: 1000;ab213090;Abcam,剑桥,英国),HSP70 (1: 1000;ab2787; Abcam, Cambridge, UK), and TSG101 (1 : 1000; ab125011; Abcam, Cambridge, UK). The membranes were incubated with HRP-conjugated secondary antibodies after washing in 5% TBST. Finally, the protein bands were detected using a gel chemiluminescence imaging analysis system and the Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate reagent (Millipore, Billerica, USA) and then were analyzed using ImageJ.

2.12。统计分析

统计分析使用GraphPad棱镜(版本8.01;美国圣地亚哥)。)和局部反馈得分统计数据分析了利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的测试。临床评分的实验性自身免疫性脑脊髓炎和体重进行了分析使用双向方差分析Bonferroni期末测验。其他三个或三个以上的分析组织使用单向方差分析和Bonferroni后续测试执行的。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。BSYS减轻小鼠的临床严重性实验性自身免疫性脑脊髓炎

来评估小鼠BSYS在实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗效果,体重和临床评分测试每天40天。老鼠的身体重量实验性自身免疫性脑脊髓炎明显减少来自13个40 dpi相比数控老鼠;然而,这种趋势在FTY720缓解和BSYS组(图1(一))。没有观察到神经系统症状NC组在整个40天。集团与NC组相比,实验性自身免疫性脑脊髓炎开始出现神经功能缺损症状11 dpi,小鼠的临床评分实验性自身免疫性脑脊髓炎迅速增加,达到21 dpi。从11 dpi 40 dpi,增加临床评分FTY720和BSYS团体组显著低于在实验性自身免疫性脑脊髓炎(图1 (b))。老鼠的累积平均得分FTY720和BSYS组也显著降低了与集团的实验性自身免疫性脑脊髓炎(图1 (c))。

3.2。BSYS抑制炎症细胞浸润和减毒脱髓鞘

进一步研究BSYS的保护作用程度的炎症和髓鞘脱失,大脑组织(SVZ CC)和脊髓(LE)观察)和局部反馈染色。运算单元组显示大量的炎性细胞浸润NC组(图2(一个))。治疗BSYS或FTY720病理严重程度减轻。此外,大型脱髓鞘斑块中观察到小鼠治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的LE和CC,而FTY720和BSYS减少了小鼠髓鞘脱失区实验性自身免疫性脑脊髓炎(图2 (b))。此外,我们通过TEM观察髓鞘的超微结构。髓鞘的NC组紧密排列,结构完整,线粒体的形态是正常的。相比之下,老鼠治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎松散片状髓鞘结构,轴突水肿,神经纤维衰变。轴突直径的比值有髓鞘的轴突直径(g比率)被用来量化的髓鞘脱失程度。与对照组相比,小鼠的g比实验性自身免疫性脑脊髓炎接受BSYS和FTY720明显减少,和髓鞘的完整性保护(图2 (c))。

3.3。BSYS促进小鼠成熟的少突胶质细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎

考虑神经结果的显著改善,我们旨在探索BSYS是否影响少突胶质细胞的成熟和remyelination过程,产生一个对运算单元的恢复至关重要的影响。CC-1是成熟少突细胞标记(41]。免疫荧光显示,在这两个大脑和脊髓,CC-1⁺/ Olig2⁺BSYS-treated组的细胞比例明显高于集团在实验性自身免疫性脑脊髓炎(数字3(一个)- - - - - -3 (f))。

髓磷脂含蛋白脂质蛋白(PLP)是另一种成熟的少突胶质细胞和标记的一个主要构成髓鞘膜蛋白(42]。我们量化的在大脑和脊髓,包含IHC染色显示,老鼠的PLP实验性自身免疫性脑脊髓炎在40 dpi显著降低。然而,革新劳工党表达增加FTY720 -和BSYS-treated组织集团的价格相比实验性自身免疫性脑脊髓炎(数字3 (g)- - - - - -3(我))。

3.4。BSYS治疗促进平方米小胶质极化老鼠大脑和脊髓的实验性自身免疫性脑脊髓炎

探索在小胶质BSYS极化的作用,M1标记的信使rna表达水平(mhc ii,进气阀打开,CD86)和M2标记(Trem2、__arg1 CD206)测定在40 dpi老鼠大脑和脊髓。与NC组相比,M1表型标记的mRNA水平是提升集团在实验性自身免疫性脑脊髓炎(数字4(一)- - - - - -4 (f))。然而,BSYS和FTY720治疗减少M1-related标记的表达水平;特别是,mhc ii和伊诺显著下调。相比之下,M2的水平极化标记增加BSYS-treated组的价格相比运算单元组,但只有__arg1 upregulation统计学意义在大脑和脊髓(数字4 (g)- - - - - -4(左))。这些结果表明,antidemyelination BSYS效应可能是意识到通过抑制M1小胶质极化和扭转对M2表型小胶质极化。

接下来,小胶质极化在中枢神经系统的免疫荧光进一步调查。大脑和脊髓的部分被double-stained Iba1(小胶质标记)/伊诺(M1标记)或Iba1 / __arg1 (M2)标志。运算单元诱导显著upregulation M1小胶质细胞的比例。然而,BSYS和FTY720治疗减少活化的小胶质细胞的数量(Iba1⁺细胞)(图5(一个),5 (b),5 (d),5 (e))和M1小胶质细胞(Iba1⁺/伊诺⁺细胞)(图5(一个),5 (c),5 (d),5 (f))和增加的比例平方米小胶质细胞在治疗组与组的实验性自身免疫性脑脊髓炎(数字6(一)- - - - - -6 (d))。接下来,免疫印迹分析表明,伊诺表达式组显著增加在实验性自身免疫性脑脊髓炎的价格相比数控组。然而,BSYS和FTY720逆转upregulation伊诺(数字5 (g)- - - - - -5(我)的差别),对这些__arg1(诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的数字6 (e)- - - - - -6 (g))。这些结果与免疫荧光染色的结果一致。

M1和M2小胶质细胞分泌pro和抗炎细胞因子,分别和ELISA用于进一步评估的有效性BSYS调节小胶质极化。ELISA显示炎性细胞因子il - 1的表达水平β、il - 6和TNF -α组在实验性自身免疫性脑脊髓炎高于数控组。FTY720管理,BSYS抑制促炎细胞因子的增加在中枢神经系统(诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎的数字7(一)- - - - - -7 (f))。然而,与运算单元组相比,只有降低il - 6在统计学上显著在大脑和脊髓BSYS治疗组。此外,il - 10的水平(数字7 (g)- - - - - -7 (h))由M2表现型小胶质细胞分泌明显增加BSYS组与组的实验性自身免疫性脑脊髓炎。

3.5。BSYS调节mir - 124和mir - 155在中枢神经系统

许多研究表明,mir - 124和mir - 155中发挥抗炎和促炎效应存在,小胶质极化的关键调控基因。Upregulation mir - 155的差别mir - 124和对这些促进M2极化,从而减少神经损伤和神经保护功能。模型中存在表明实验性自身免疫性脑脊髓炎的mir - 155表达显著增加大脑和脊髓的价格相比NC组(数字8 (c)和8 (f)),mir - 124水平表达下调(数字9 (c)和9 (f))。小鼠治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎BSYS或FTY720导致显著降低相对mir - 155表达在大脑和脊髓。此外,BSYS mir - 124表达增加。我们也发现在SVZ大鹏展翅,勒通过荧光原位杂交,结果是一致的与存在(数字8(一个),8 (b),8 (d),8 (e);数据9(一个),9 (b),9 (d),9 (e)),这表明BSYS调节mir - 124和mir - 155在中枢神经系统中发挥潜在的作用在促进平方米小胶质细胞的极化。

3.6。BSYS增加mir - 124和抑制血清mir - 155在外围液

近年来,在末梢循环液证明可能作为神经炎症介质(43),而一些大鹏展翅的表达在等离子体中异常液疾病进展的女士/实验性自身免疫性脑脊髓炎(44,45]。因此,40岁dpi,我们使用一个exoEasy工具包收集血清液从每组小鼠和确定的形态和大小由TEM和NTA液。收集到的囊泡显示典型的杯状容器形态,粒子的直径是80 ~ 200 nm(数据10 ()和10 (c))。Exosomal标记,如CD63、HSP70和TSG101被西方墨点法,并丰富了隔离液从血清(图10 (b))。此外,我们孤立exosomal RNA和分析了mir - 124和mir - 155表达每组小鼠的血清液中存在。exosomal血清mir - 155水平相比数控老鼠,老鼠明显增加,在实验性自身免疫性脑脊髓炎,mir - 124的含量降低。BSYS治疗增加了mir - 124水平,降低血清mir - 155水平液老鼠的实验性自身免疫性脑脊髓炎(数字10 (d)和10 (e))。结果与中枢神经系统组织的变化相一致。

3.7。目标基因的mir - 124和mir - 155平方米小胶质极化被BSYS调制

C / EBPα和PU.1 mir - 124的下游靶基因,和SOCS1 mir - 155的目标基因。许多研究表明,这些基因的改变可以调节小胶质极化和影响女士的进展/运算单元。因此,我们研究了这些目标基因的存在和免疫印迹分析。C / EBP的表达水平α和PU.1调节大脑和脊髓的运算单元组与NC组40 dpi。然而,与运算单元组的水平相比,这些蛋白质BSYS治疗后明显下调。相比之下,SOCS1的表达水平降低运算单元组的价格相比数控组和治疗和FTY720 BSYS诱导其表达的价格相比运算单元组40 dpi(数字(11日)- - - - - -11 (n))。

4所示。讨论

女士是中枢神经系统的自身免疫性疾病,其特征是炎症细胞浸润和脱髓鞘与全球超过二百万例(46]。目前,免疫抑制剂(如糖皮质激素)和免疫调制剂(如FTY720)女士的主要药物治疗;然而,他们有重大风险的安全性和副作用(47,48]。许多研究都集中在开发新药物,抑制髓鞘脱失。协助功能和病理复苏实验性自身免疫性脑脊髓炎在我们的研究中,我们评估一个中医称为BSYS,公式表明治疗效果和女士/实验性自身免疫性脑脊髓炎决定其神经保护作用的潜在机制。体重和临床分数表明BSYS治疗显著改善神经复苏。在实验性自身免疫性脑脊髓炎此外,他走时和局部反馈染色显示BSYS预防炎症浸润,在大脑和脊髓脱髓鞘。此外,髓鞘的结构BSYS治疗后病变部位的保护。此外,CC-1细胞的数量⁺/ Olig2⁺成熟的少突胶质细胞标记,增加了BSYS治疗。是最丰富的蛋白质中中枢神经系统的髓鞘。革新劳工党内容是一个定量指标髓磷脂膜的完整性,和髓鞘也取决于其特定的脂质含量。因此,我们推测BSYS影响的形成减少破坏髓鞘,支持的表达水平的大脑和脊髓的观察中。这些结果表明,BSYS改善小鼠通过促进神经复苏实验性自身免疫性脑脊髓炎少突细胞成熟。

先前的研究清楚地表明,小胶质细胞的微环境调节中枢神经系统,影响remyelination[的过程49]。在女士,小胶质细胞被激活和表达信号分子和细胞因子,导致继发性神经损伤。因此,抑制小胶质细胞的overactivation和减少神经毒性细胞因子的分泌代表MS治疗的新方法。越来越多的证据表明小胶质M1 / M2极化发展神经炎症在实验性自身免疫性脑脊髓炎(中扮演着重要的角色50]。M1小胶质细胞防止成熟少突细胞(51),而M2小胶质细胞驱动少突胶质细胞的分化神经退行性疾病(52]。具体来说,M1小胶质细胞产生高水平的氧化代谢产物,导致中枢神经系统功能障碍。在神经炎症,许多相关受体和酶M1表型是中枢神经系统的调节增加串扰和调节免疫微环境,和mhc ii,进气阀打开,CD86被认为是至关重要的标记(53]。这些M1的mRNA水平表型标记(mhc ii,进气阀打开,CD86)增加小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎。然而,他们BSYS组中表达降低的价格相比运算单元组。然而,M2表型分泌细胞因子和受体表达与抗炎引起中枢神经系统的组织修复,证明对骨髓细胞触发受体表达的表达2 (Trem2), __arg1, CD206 [54]。在我们的研究中,这些基因的mRNA表达BSYS治疗后增加。__arg1伊诺共享相同的底物;因此,里面只有一份礼物是优先在小胶质细胞合成,使进气阀打开/ __arg1适合小胶质极化的标志。的确,符合我们的研究中,存在最重要的差异表明,M1和M2极化标记和治疗组之间的实验性自身免疫性脑脊髓炎伊诺和__arg1分别。因此,我们使用伊诺和__arg1标记来识别M1——M2-polarized小胶质细胞在中枢神经系统免疫荧光。此外,Iba1小胶质细胞/ macrophage-specific钙结合蛋白与actin-bundling活动被广泛用于识别活化的小胶质细胞。FTY720 BSYS治疗导致显著增加表达__arg1 Iba1 (M2)标志⁺细胞,而间接宾语(M1)标志表达小鼠显著降低实验性自身免疫性脑脊髓炎。此外,M1小胶质细胞分泌促炎细胞因子,而M2小胶质细胞分泌细胞因子,减少炎症55]。小胶质细胞激活组在实验性自身免疫性脑脊髓炎转向M1防止remyelination表现型和产生更多的促炎细胞因子。然而,治疗BSYS降低il - 1的表达β、il - 6和TNF -α和增加il - 10的表达,突出BSYS的神经保护作用。

大鹏小non-protein-coding RNA分子长度的核苷酸,年龄在18岁至25岁之间发挥着重要的作用在调节基因表达和调控不同生物事件(56]。在过去的几年中,大鹏一直被视为潜在的监管机构小胶质极化发展/女士在实验性自身免疫性脑脊髓炎(18,57]。许多研究表明,大鹏改变小胶质极化的方向,而大鹏表达水平M1和M2表型之间的不同。特别是,mir - 155和mir - 124 pro -和抗炎大鹏展翅的代表,分别,这被认为是至关重要的平衡M1和M2的极化小胶质细胞(58]。

最初,miR - 124被认为是一种抗炎米尔(59],有助于抑制小胶质激活因为mir - 124的最高水平在小胶质细胞释放居民发现,mir - 124水平与干扰素刺激——后显著降低γ有限合伙人,加强M1表型。然而,mir - 124转染小胶质细胞的研究表明,mir - 124与M1表型相关的蛋白质的表达降低,同时增加M2-associated标记物的表达。这个结果表明,mir - 124不仅会让小胶质细胞都失活,还歪曲了M2的极化M1表型表型(18]。,此外,在急性期的实验性自身免疫性脑脊髓炎M1在小胶质细胞标志物水平的增加发生的同时减少mir - 124表达在中枢神经系统。相比之下,高mir - 124的表达和低表达的M1标记同时观察在正常小鼠的中枢神经系统(或复苏阶段的小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎13,60]。C / EBPα和PU.1下游mir - 124的目标,和C / EBPα是一个C / EBP转录因子家族成员广泛表达和调节各种细胞和生理过程,包括能量代谢、免疫和炎症61年]。PU.1作为免疫系统的关键调节器。这产生一个重要影响调节基因与专业相关的小胶质细胞的功能(62年,63年]。mir - 124控制的多个标记小胶质极化通过直接抑制C / EBP -α及其下游转录因子PU.1 [64年]。miR - 155,一般认为是促炎米尔,有助于microglia-mediated神经毒性,这在很大程度上是与M1表型(65年]。mir - 155所示是显著增加大脑和脊髓MS /实验性自身免疫性脑脊髓炎(66年]。它针对的是小胶质细胞产生抗炎蛋白,如SOCS1,导致伊诺的表达水平升高,il - 6和TNF -α。此外,SOCS1诱导分化从M1, M2状态和增加SOCS1 M2表型,扮演着一个重要的角色在维持抗炎作用[67年]。此外,mir - 155可以目标M2-associated基因,抑制mir - 155促进M2标记的表达(68年),如__arg1、Ym1, Fizz1。以上证据表明,mir - 124的规定和mir - 155具有重要影响的实验性自身免疫性脑脊髓炎小胶质细胞的极化,极化的M1 / M2也可能伴随着mir - 124的变化和mir - 155。在我们的研究中,mir - 155的表达小鼠大脑和脊髓的实验性自身免疫性脑脊髓炎显著增加,因为自身免疫性炎症损伤,而mir - 124的表达显著降低的价格相比数控老鼠。然而,BSYS治疗后,荧光原位杂交和存在表明,mir - 124水平和mir - 155正好相反。这些结果表明小胶质极化BSYS造成M2与米尔表达的变化。

液分泌各种细胞和携带货物,包括蛋白质、脂类和非编码rna (69年]。释放后,液转移到特定的靶细胞起到多种作用[70年]。最近的一项研究表明,外周循环液导致存在系统性炎症条件下(43]。增加炎症大鹏展翅的表达式serum-derived液可能发挥作用在调节中枢神经系统免疫反应。此外,大鹏展翅的表达在血清液特异表达的发病和峰值(女士/实验性自身免疫性脑脊髓炎71年]。因此,循环exosomal大鹏女士代表有前途的候选人生物标志物,可能反映了/实验性自身免疫性脑脊髓炎状态和疾病的治疗效果44]。我们的研究发现,血清exosomal mir - 124的表达和mir - 155小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎是类似于大脑和脊髓的组织;前者表达下调,后者是调节。此外,BSYS治疗逆转这一趋势,也是符合的差异在每组小鼠的中枢神经系统组织。因此,我们证实BSYS的作用在调节大鹏在中枢神经系统和外围的水平。此外,我们分析了下游靶基因C / EBPαPU.1, SOCS1 mir - 124和mir - 155在中枢神经系统免疫印迹和存在。BSYS治疗后,M1 phenotype-related SOCS1明显抑制,而转录因子C / EBPα促进M2极化,PU.1被激活。这些发现进一步表明BSYS的潜在机制是通过促进M2极化小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎,这可能与mir - 124的变化和mir - 155体内。然而,我们所有的结果都是来自体内研究。mir - 124的作用和mir - 155 BSYS-mediated小胶质细胞M2极化尚未完全阐明,需要进一步探索。在未来的研究中,我们将抑制过度表现mir - 124和mir - 155小鼠进一步研究在实验性自身免疫性脑脊髓炎BSYS-mediated神经保护机制。此外,M2极化的具体机制受BSYS还必须证明在细胞实验中,我们将进一步验证这些结论体外。

总之,我们的研究表明,BSYS减轻炎症反应,促进M2极化抑制髓鞘脱失的小胶质细胞调节pro /抗炎因子的分泌和改善神经功能。在扭曲BSYS M2极化的影响可能与mir - 124的变化和mir - 155体内。因此,BSYS是一种很有前途的治疗和改善remyelination剂抑制神经炎症。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究在经济上支持中国的国家自然科学基金(81873252)和北京自然科学基金(7182020)。