文摘
糖尿病肾病是糖尿病引起的微血管并发症,以及甲基乙二醛(分别)是一种活性羰基物种造成氧化应激,导致炎症反应的诱导肾细胞。Cudrania tricuspidata种植在东北亚(CT),被用作传统医学治疗各种疾病,包括神经炎、肝损伤和癌症。在这项研究中,我们确定是否CT根提取物(CTRE)可以防止MGO-induced活性氧(ROS)生产和炎症和评估潜在机制使用肾上皮细胞系,HK-2。我们发现CTRE抑制MGO-induced ROS生产。此外,CTRE改善MGO-induced炎症信号通路的激活等p38增殖蛋白激酶(MAPK),细胞外signal-regulated激酶(ERK)和c-JUN n端激酶(物)。与这些结果一致,表达p-nuclear factor-kappa B (NFκB)和炎性细胞因子,肿瘤坏死因子-α白介素- 1 (IL)β和il - 6与MGO-only相比减少暴露HK-2细胞。CTRE缓解MGO-induced减少核因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)和抗氧化酶mRNA表达。采用NADPH氧化酶的表达诱导4 (NOX4);CTRE预处理抑制这种感应。进一步的研究发现,NOX4表达式是抑制由于抑制MGO-induced蛋白激酶C (PKC)的激活后CTRE治疗。总的来说,我们的数据表明,CTRE变弱MGO-induced炎症和氧化应激通过抑制PKC激活和NOX4表达式,以及移植Nrf2-antioxidant HK-2细胞酶途径。
1。介绍
糖尿病肾病(DN)是最重要和最常见的糖尿病并发症之一(1]。肾小球肥大、基质蛋白积累和管状损伤是主要病理特征,最终,肾脏功能的丧失。(2,3]。慢性高血糖是导致和加速肾脏受损。高血糖促进形成先进的糖化终端产品(年龄),扮演着一个重要的角色在DN的发展。
甲基乙二醛(分别)年龄和能引起细胞损伤的主要前体通过增加活性氧(ROS),线粒体损伤和炎症。因此,分别以积累已经与血管并发症的糖尿病和慢性炎性疾病,包括心血管疾病、癌症、认知功能障碍、和骨质流失4- - - - - -10]。
Cudrania tricuspidata局(CT),这属于桑科家族,广泛分布在整个东北亚,包括韩国、中国和日本。它已经被用于传统医学肿瘤,肝损伤,黄疸,挫伤,慢性胃炎,风湿,神经炎,炎症在东亚(11,12]。根,茎,叶,果实CT据说含有大量的酚类化合物,包括类黄酮、氧杂蒽酮,二萜生物碱、萜类化合物,12- - - - - -14]。特别是,CT的根和茎具有最高的总酚和总黄酮含量与树叶和水果相比,以及一个强大的抗氧化和还原能力13]。Cudratricusxanthone和cudraflavanone报告作为活性成分的CT (15,16据报道),cudratricusxanthone变弱在脓毒性小鼠肾损伤(17]。在这项研究中,我们调查的影响CT根提取物(CTRE) MGO-induced ROS生产和HK-2细胞中炎性细胞因子的表达,一个人肾小管上皮细胞系,并评估潜在的分子机制。
2。材料和方法
2.1。制备提取物CT根(CTRE)
在这项研究中,我们使用了70% ( )ethanolic提取CT干根(CTRE)。干CT根(CTR)购买从Miryang Kkujippong农场合作(Gyeongsangnam-do、韩国)和使用机械粉碎机粉。干CTR粉(1.0千克)受到在70%乙醇提取3 h使用回流提取系统KOC生物技术(韩国大田市)。CTRE是溶解在二甲亚砜(DMSO溶液;Duchefa对帐面价值,Haarlem, Netherlands) at a concentration of 100 mg/mL and then further diluted with a culture medium for the experiment to reach the required concentration.
2.2。细胞培养
人类肾近端小管细胞线,HK-2,来自美国类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)。HK-2细胞被维护在RPMI 1640 (Welgene、大邱、韩国)含10%胎牛血清(美国纽约的边后卫,Gibco大岛),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(Welgene) 37°C的氛围中5%的股份有限公司2在95%的空气。
2.3。细胞生存能力分析
细胞生存能力估计使用d +™CCK细胞生存能力分析工具包(Dongin LS,首尔,韩国)按照制造商的协议。HK-2细胞( 细胞/ 96 -孔板)被播种。文化的24 h后,细胞治疗与CTRE或采用。评估毒性CTRE治疗后,不同浓度的细胞治疗CTRE(有些人μg / mL)在不同的时期,介于3和24小时。测量细胞生存能力分别处理后,细胞治疗与不同浓度分别为24小时(0.125 - -1.0毫米)或0.5毫米分别以不同时期,介于3和24小时。孵化后,CTRE——或者MGO-treated介质在100年取代μL (CCK工作的解决方案,和细胞进一步孵化4 h。光密度(OD)为450 nm使用VersaMax标(分子器件、LLC桑尼维尔,美国)。控制细胞的OD值被认为是代表100%生存能力18]。用于后续研究中,我们选择了分别以浓度的0.5毫米,显示细胞生存能力50%,CTRE剂量的20倍μg / mL,展示了最高的抑制效果。
2.4。测量细胞内活性氧(ROS)水平
检查时间和剂量依赖性分别对活性氧的影响生产,HK-2细胞( 细胞/)被播种在6-well盘子和培养24小时。然后,细胞治疗与0.5毫米分别以不同时期(-12 - 0.5 h)或不同浓度的分别为2 h(0.125 - -1.0毫米)。确定CTRE MGO-induced ROS生产的抑制作用,细胞被孵化与车辆(DMSO)或20μg / mL CTRE 1 h,然后进一步孵化2 h,有或没有采用0.5毫米。通过流式细胞仪测定细胞内ROS水平使用2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA表达载体,圣地亚哥,美国),我们以前的报告中描述(19]。
对荧光图像,HK-2细胞( 细胞/)在一夜之间被孵化Nunc™Lab-Tek™II室幻灯片™系统(热科学、罗切斯特,纽约,美国)。这些细胞被使用车辆或20μg / mL CTRE 1 h,然后进一步处理或没有0.5毫米分别以2 h。细胞治疗10μM DCFH-DA为30分钟37°C。这些细胞被固定在5%中性缓冲福尔马林(NBF,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)20分钟在4°C。细胞核是沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;英杰公司)稀释DPBS(1: 1000)在25°C 5分钟。然后,与荧光细胞被安装安装介质(Dako北美,Inc .)和共焦显微镜下观察(LSM700;德国卡尔蔡司公司从)。
2.5。西方墨点法
HK-2细胞( 细胞)在90毫米孵化菜肴24 h。然后,细胞使用车辆或20μg / mL CTRE 1 h,然后进一步处理0.5毫米分别以1 h (p-PKC评价β)或2 h。为抑制p-PKCβ信号,细胞治疗1μM GF 109203 x 2 h CTRE治疗前。细胞总蛋白提取和西方墨点法进行描述在我们以前的报告(20.]。主要抗体用于补充表中列出了本研究1。化学发光信号是由治疗ECL试剂的污点,Immobilon-Western化学发光合衬底(微孔Corp . Billerica,妈,美国),并使用LAS4000可视化成像系统(富士胶片集团;日本东京)。蛋白质乐队使用ImageJ量化软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。
2.6。RNA分离和定量实时PCR (RT-qPCR)
HK-2细胞( 细胞)孵化24小时60毫米的菜肴。这些细胞被使用车辆或20μg / mL CTRE 1 h,然后处理或没有0.5毫米分别以2 h。总RNA进行了隔离和RT-qPCR描述在我们以前的报告(21]。总之,总RNA提取使用RNAiso +试剂(豆类生物有限公司、志贺、日本)和2μ克总RNA reverse-transcribed使用PrimeScript™1 st-strand互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类生物Inc .)。RT-qPCR执行使用反应混合物组成SYBR绿色主人混合(豆类生物Inc .)。结果计算使用2−ΔΔCT相对量化方法和归一化的表达水平还有b .一对引物序列补充表所示2。
2.7。统计分析
统计分析是由单向方差分析(方差分析)与图基的多重比较检验使用GraphPad棱镜版本5 (GraphPad软件公司,圣地亚哥、钙、美国)。给出的数据 。统计学意义是 。
3所示。结果
3.1。CTRE并不影响HK-2细胞生存能力和形态
确定CTRE HK-2细胞细胞毒性影响,我们检查的可行性HK-2与不同浓度的细胞治疗后CTRE使用CCK试验不同的潜伏期。与有些人治疗HK-2细胞μg / mL CTRE 3-24 h,没有观察到细胞生存能力的差异之间的控制和CTRE-treated细胞在任何条件调查(图1(一))。如图1 (b)、细胞形态控制,有些人之间没有差别μg / mL CTRE-treated细胞(图1 (b))。这些结果表明,CTRE浓度用于这项研究没有证明任何细胞毒性HK-2细胞。
(一)
(b)
3.2。CTRE抑制活性氧产量MGO-Treated HK-2细胞
确定分别引起的细胞损伤,HK-2细胞治疗0.125 - -1.0毫米分别以24 h,紧随其后的是测量细胞的可行性。细胞生存能力从0.5毫米分别以降低剂量依赖性的方式相比,控制细胞(图2(一个))。接下来,HK-2细胞0.5毫米分别处理,显示50%的细胞生存能力;当评估3-24 h,细胞生存能力明显下降(图12 h后治疗2 (b))。分别以诱导细胞毒性的ROS各细胞株(生产过剩22- - - - - -25),我们的流式细胞仪测量细胞内ROS水平MGO-treated HK-2细胞。如图2 (c)活性氧产量显著增加,HK-2细胞治疗0.5毫米分别以2 h相比,在控制细胞。治疗HK-2细胞与不同浓度分别为2 h(0.125 - -1.0毫米),活性氧产量显著增加,当处理相比0.25和0.5毫米分别与控制细胞(图2 (d))。然后我们调查CTRE MGO-induced ROS生产的影响,发现预处理与CTRE显著降低ROS生产相比,细胞治疗0.5毫米分别以2 h(图2 (e))。共焦图像分析证实,分别以大大增加活性氧的生产,这是强烈减毒CTRE预处理(图2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。CTRE降低激活MAPK和NFκB和炎性细胞因子的表达在MGO-Treated HK-2细胞
作为MGO-induced氧化应激激活增殖蛋白激酶(MAPK) /核factor-kappa B (NFκB)信号和诱发炎症反应26- - - - - -28),我们检查HK-2细胞中炎性细胞因子的表达对0.5毫米分别以CTRE的存在与否。分别以显著增加的表达白介素- 1 (IL)β白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α相比,在控制细胞;然而,CTRE预处理相比大大降低了这些基因的表达与观察MGO-only暴露的细胞(图3(一个))。我们调查是否MGO-induced细胞因子表达的抑制CTRE介导通过MAPK / NF的规定κB激活。因此,我们研究了MAPKs和NF的磷酸化κB在HK-2细胞0.5毫米分别对待,有或没有CTRE预处理。如图3 (b),分别以显著增加P38的磷酸化细胞外signal-regulated激酶(ERK)和c-JUN n端激酶(物)相比,在控制细胞(图3 (b))。然而,CTRE预处理相比显著降低这些蛋白质的磷酸化与MGO-treated细胞(图3 (b))。此外,MGO-induced NF的磷酸化κB显著减少CTRE预处理(图3 (c))。这些结果表明,CTRE可能抑制炎性细胞因子的表达下调MAPK / NFκB激活。
(一)
(b)
(c)
3.4。CTRE复苏MGO-Induced Nrf2下降和mRNA表达的抗氧化酶
转录因子核因子(erythroid-derived 2)——2 (Nrf2)充当主调节器cytoprotective反应,包括抗氧化,消炎,解毒(29日,30.]。调查是否CTRE影响Nrf2和抗氧化酶的表达,我们检查了mRNA的表达Nrf2和Nrf2目标抗氧化酶在MGO-treated HK-2细胞,有或没有CTRE预处理。乙二醛酶等抗氧化基因的信使rna表达水平1 (GLO1)、过氧化氢酶(CAT)、glutamate-cysteine连接酶催化亚基(GCLC)、血红素oxygenase-1 (HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和NAD (P) H醌脱氢酶(NQO) 1分别治疗后显著降低,和所有,除了猫以外,其余均显著增加了CTRE预处理相比MGO-only暴露的细胞(图4(一))。与这些结果一致,Nrf2 mRNA表达也显著增加的价格相比MGO-only暴露的细胞(图4 (b))。这些结果表明,CTRE可能改善MGO-induced抗氧化酶基因表达减少,导致活性氧降低产量。
(一)
(b)
3.5。CTRE抑制NOX4下调PKC表达β磷酸化在MGO-Treated HK-2细胞
肾近端小管上皮细胞的活性氧产量主要受NOX4 [31日- - - - - -34]。调查是否抑制MGO-induced ROS生产CTRE可以归因于NOX4表达式的规定,我们测量的蛋白质表达水平NOX4西方墨点法。NOX4蛋白质水平显著增加2 h后分别以治疗相比,在控制细胞和被CTRE预处理相比,显著降低,在MGO-treated细胞(图5(一个))。尤其是PCK PKCβ,AMPK途径参与NOX4感应的管状细胞(35),我们测量PCK的磷酸化β或AMPKα在没有或存在CTRE MGO-treated HK-2细胞。PKC的磷酸化β在MGO-treated显著增加细胞相比,在控制细胞和显著降低CTRE预处理相比,在MGO-treated细胞(图5 (b))。相反,分别以减少AMPK的磷酸化α相比,在控制细胞;然而,CTRE预处理没有抑制phosphorylated-AMPK MGO-induced减少α在HK-2细胞(图5 (b))。检查是否p-PKCβ调节NOX4表达式,HK-2细胞接受女朋友109203 x (PKC抑制剂)和/或CTRE然后分别对待。我们发现预处理GF 109203 x显著抑制PKCβ磷酸化和阻塞的表达NOX4分别治疗引起的数据5 (c)和5 (d))。此外,我们观察到添加剂影响抑制NOX4表达式后cotreatment CTRE和GF 109203 x(图5 (d))。这些结果表明,CTRE的抗氧化效果的差别是由对这些NOX4通过抑制PKC和活性氧的生产β磷酸化。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
DN是一个主要的并发症糖尿病和终末期肾病的常见原因。尽管DN有助于总体发病率和死亡率在糖尿病患者中,DN的病理生理机制仍不清楚(36,37]。多学科治疗方法,包括肾素-血管紧张素系统(RAS)抑制剂,长期以来一直用于治疗DN。的功效sodium-glucose转运蛋白2 (SGLT2抑制剂)最近证明,因此添加一个新的治疗方案;然而,目前的治疗方法仍然不完全抑制DN发展(38]。
在DN的恶化,肾小球系膜扩张等变化,肾小球基底膜增厚,足突细胞损失被认为是临床症状;然而,小管间质炎症和管状损害也关键特性(2,39,40]。特别是早期肾小管上皮细胞的变化被认为是一个重要因素在DN发展40,41]。从管状上皮细胞炎症会导致反渗透法、矩阵扩张,细胞凋亡导致损害肾小球细胞通过细胞因子和趋化因子等炎性介质42- - - - - -44]。穆罕默德等人报道,通过过度炎症的抑制肾小管上皮细胞的抗炎因子改善蛋白尿和DN糖尿病大鼠体外实验中44]。因此,抑制肾小管上皮细胞的炎症可能是一种有效的预防策略对DN的发展。
药用植物和具有生物活性的天然化合物被用作替代治疗肾脏疾病,包括DN (45- - - - - -49]。之前有研究表明,水果、树叶和树根的CT也有多种生物活性,包括抗氧化(50,51,抗炎52],各类典型[53],王亚南[54),和神经保护16,55)的影响。它最近报道说,CT显示antisenescence影响内皮细胞暴露于高葡萄糖,一个主要的糖尿病因素(56]。此外,肾保护作用已经报道了cudratricusxanthone, CT的活性成分,在盲肠的结扎和puncture-induced脓毒性小鼠(17];然而,CT对DN的影响还没有被研究。在这项研究中,我们调查的影响乙醇提取MGO-induced CT根的氧化应激及其HK-2的炎症细胞,一个人肾上皮细胞系。
高活性二羰基化合物,分别被称为先进的糖化结束产品的主要前体(年龄)和生成的对象来自糖酵解(57]。分别以和MGO-mediated DN患者的年龄在增加,他们在DN发展重要因素58- - - - - -60]。完善,分别以增加氧化应激和细胞在内皮细胞损伤或死亡(61年)和几个肾细胞包括间质细胞(62年,63年),足细胞(64年),肾小管上皮细胞(26,27,65年]。根据一些研究[26- - - - - -28,35),包括目前的研究中,MGO-induced氧化应激激活MAPK / NFκB信号和诱导肾小管上皮细胞的炎症反应。我们的结果表明,CTRE预处理抑制MGO-induced ROS生产过剩,以及MAPK和NFκB激活和炎症细胞因子的生产,说明CTRE的抗氧化和抗炎作用。先前的研究已经确定了cudraxanthone B, cudratricusxanthone cudratricusxanthone O, cudraflavanone, cudraflavanone B, isogentisin 8-prenylxanthone作为活性成分,有抗炎作用在CT根(12,16,66年- - - - - -68年]。因此,这些活性成分可能减少MGO-induced HK-2细胞的炎症反应。
通过Nrf2-Keap1增加抗氧化酶途径是主要的抗氧化反应(69年]。Cudraflavanone,隔绝CT根树皮,显示抗炎作用Nrf2激活的小胶质细胞(16据说,CT叶提取通过Nrf2活化肝细胞具有抗氧化的影响(70年]。Cudratricusxanthone隔绝CT根显示肾保护作用诱导抗氧化酶(17]。类似于这些先前的报道16,17,70年),CTRE也增加Nrf2和抗氧化酶的表达,表明MGO-induced ROS生产过剩可能会减弱CTRE通过增加Nrf2-mediated抗氧化酶的表达。
NADPH氧化酶类(nox)在糖尿病肾脏和活性氧的主要来源是氧化还原信号的重要介质阻力指标细胞在糖尿病条件下(也许可以在肾小球和35]。氮氧化物家庭有7个亚型,肾系统主要表达NOX1 NOX2,和NOX4亚型,其中NOX4是最丰富的同种型(35,71年,72年]。NOX1 NOX2位于质膜和isoform-specific组装需要激活的不同的子单元;然而,NOX4位于呃,没有调节亚基,由表达[观察71年,73年]。因此,NOX4被称为“持续活跃”的酶,和整体ROS生产NOX4不同刺激条件下可能是直接由其表达水平(35]。NOX4肾皮质中高度表达,主要由管状上皮细胞(74年]。此外,NOX4的表达增加肾近端小管上皮细胞在高葡萄糖条件下;然而,NOX2或NOX1表达式是没有改变31日]。NOX4表达的差别,对这些基因在糖尿病条件下可以使用作为一个策略来抑制管炎症。在这项研究中,CTRE预处理显著降低MGO-induced NOX4 HK-2细胞中表达,这表明由CTRE差别NOX4对这些有助于减少活性氧的生产。
众所周知,PKCβ/ NOX4和AMPKα/ NOX4途径是主要的监管途径在肾小管细胞ROS生产糖尿病条件下(31日,35,75年]。根据以前的报告(76年),抑制PKCβ信号变弱diabetes-induced NOX4表达式和氧化应激,符合我们的研究结果显示,CTRE抑制MGO-induced PKCβ随后激活,抑制NOX4 HK-2细胞中表达。同时,失活的AMPK糖尿病刺激增加NOX4表达式和随后的系膜细胞中活性氧的生产(35,77年]。使用AMPK AMPK活化催化剂,如二甲双胍或爱卡(5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-d-riboruranoside)变弱高glucose-induced NOX4表达在肾小管上皮细胞(78年,79年]。类似于之前的研究(77年),的表达phosphorylated-AMPK分别治疗后显著降低;然而,没有改变CTRE预处理后观察。这些结果表明,抑制MGO-induced NOX4 CTRE表达式的HK-2细胞PKC的差别可以归因于对这些β激活,但不是upregulation的AMPK激活。
总之,我们的研究显示,CTRE防止MGO-induced炎症通过衰减PKC-NOX4通过抑制氧化应激的途径,以及通过增加Nrf2-antioxidant HK-2细胞酶通路(图6)。考虑到多因子的和系统性的DN和属性在HK-2 CTRE细胞的影响,我们建议CTRE或其组件对衰减可能候选药物联合治疗慢性炎症和氧化应激基本DN发展。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Donghee金正日和郑Jayeon同样这项工作。
确认
本研究支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(2019 r1a2b5b02070355)和由韩国卫生技术研发项目通过卫生部和福利(HI14C1135)。
补充材料
表S1:抗体用于本研究。用于RT-qPCR表S2:引物序列。(补充材料)