文摘
底层机制的脑缺血/再灌注(I / R)损伤尚不清楚。在这项研究中,我们旨在探讨p53是否抑制产生保护作用通过p53 / PRAS40 mTOR通路后中风和其潜在的机制。一个体外oxygen-glucose剥夺(OGD)模型与主要神经元文化和体内中风模型(dMCAO或MCAO)。我们发现梗塞大小、神经细胞凋亡和自噬在p53 KO小鼠和p53 KO那么严重脑I / R后神经元或OGD / R损伤。通过激活mTOR通路,p53击倒缓解脑I / R损伤体外和体内。PRAS40淘汰时,p53的监管影响过度或可拆卸的中风消失了。PRAS40击倒可以抑制mTOR通路的活动;此外,神经细胞自噬和细胞凋亡加剧了PRAS40击倒。总之,在这项研究中,我们发现p53抑制防止卒中后神经I / R损伤通过p53 / PRAS40 / mTOR途径,这是一个小说,关键脑缺血性损伤信号通路。神经细胞自噬和细胞凋亡的诱导p53 / PRAS40 / mTOR通路可能是这种保护作用的潜在机制。
1。介绍
脑缺血/再灌注(I / R)损伤是一个病理生理过程,损害神经元生存卒中后(1),但它的潜在机制仍不清楚。p53,一个关键的肿瘤抑制,也被认为会加剧脑I / R损伤(2),虽然有些争议仍然存在。以前,我们发现抑制p53保护作用对氧气和葡萄糖剥夺(OGD)损伤神经元在体外通过激活的哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)途径3]。mTOR通路参与多种生理过程,包括细胞代谢、生长、分化、发展、和细胞生存4]。此外,它参与保护脑缺血(5]。在先前的研究中,我们表明,mTOR缓解中风相关的神经元损伤的激活(6][7]。然而,具体的监管机制连接p53和mTOR通路需要进一步探索8]。
脯氨酸Akt 40 kDa的基质蛋白(PRAS40)位于下游的Akt通路和也是一个重要组成部分mTOR复杂1 (mTORC1) [9]。据报道,磷酸化PRAS40 (pPRAS40)激活mTOR通路(10]。同样,王等人还指出,pPRAS40之间的比率和PRAS40决定mTOR的激活11]。我们证明PRAS40基因敲除小鼠遭受更严重的脑I / R损伤比野生型老鼠,和超表达pPRAS40缓解脑I / R损伤和自噬通过激活mTOR [12]。此外,哈维尔等人报道负面反馈p53和PRAS40之间的关系,表明p53可以抑制其下游因子PRAS40 [13]。因此,p53、PRAS40 mTOR本质上可能是相关和卒中后扮演至关重要的角色。
在这项研究中,我们提出了一个潜在的机制中p53, PRAS40, mTOR防止神经元I / R损伤。我们设计了体内和体外实验来证实我们的假设,探讨p53抑制产生保护作用是否通过潜在p53 / PRAS40 / mTOR通路。
2。材料和方法
2.1。道德声明
动物实验都是复旦大学华山医院的伦理委员会批准,并严格根据到达协议进行。
2.2。局灶性脑缺血大鼠和老鼠
动物被安置在12:12小时光/暗周期可以随意提供食物和水。男性Sprague-Dawley老鼠(280 - 320 g),生成焦脑缺血30分钟闭塞的双边颈总动脉(cca)和永久闭塞远端中脑动脉如前所述[6]。在雄性C57BL / 6小鼠(25 - 30 g),瞬态MCA缝合阻塞模型,由大脑中动脉阻塞(MCAO) 60分钟,也使用(12]。核心体温监测直肠探头和保持在37°C在整个实验过程。血气、心率、呼吸率和温度监控整个手术和保持在生理范围。
2.3。梗塞尺寸测量
梗死是衡量2 3 5-triphenyl-2H-tetrazolium氯(TTC)或甲苯基紫(CV)染色后48小时中风发作如前所述[14][15]。梗塞的皮质的面积是衡量一个人瞎了动物的条件、规范化侧或双边皮层,表示为一个百分比。
2.4。Hematoxylin-Eosin(他)和TdT-Mediated dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色
协议对他(16]和TUNEL [17)描述了染色之前(见补充方法)。与他染色组织学评估进行评估的神经损伤。TUNEL-positive细胞的数量由无偏stereological计算方法(18]。
2.5。创建p53 KO小鼠和PRAS40 KO小鼠和基因分型
p53异质结合体(+ /−)和(−−)起源于C57BL / 6小鼠商业上海生物模型,构建和培育的中国,聚合酶链反应(PCR)是用于分析宽类型(WT, p53的基因分型+ / +),p53杂合子(p53+ /−)和p53纯合子(p53−−/老鼠)。PCR的过程简要描述的补充方法。
PRAS40 KO小鼠请由理查德·罗斯博士提供化学和系统生物学,斯坦福大学,使用标准的同源重组方法生成作为我们以前研究[12]。证实了C57BL / 6小鼠PRAS40 KO执行免疫印迹分析。
2.6。行为测试
神经分数是评价局部脑缺血损伤后48小时显示诱导神经评分分数,从0(没有可观察到的神经赤字)到4(不能行走自发和沮丧的意识水平)(19]。基因型和实验治疗的评估者被蒙蔽。
2.7。慢病毒载体建设、生成和滴定
我们商业构建慢病毒载体包含PRAS40成分(Addgene PRAS40成分:15672年,剑桥,MA)抑制PRAS40和p53的表达成分(Addgene p53成分:12089年,剑桥,MA)抑制p53表达,和炒shRNA (Addgene争夺成分:1864年,剑桥,MA)被用作控制。p53过度,p53 cDNA克隆的质粒(Addgene p53: 12136年,剑桥,妈,美国)到慢病毒骨干pHR 'tripCMV-IRES-eGFP,其中包含CMV启动子和IRES序列之间的多个克隆站点(MCS)和eGFP如前所述[7][14]。IRES序列使独立自主的目标基因和表达eGFP同时进行。一个慢病毒质粒骨架只包含eGFP被用作控制向量。
我们使用3-plasmid系统慢病毒或adenoviral包装详细在我们之前的研究3][7]:慢病毒传递向量(pHR 'tripCMV-IRES-eGFP),其中包含各种目标基因的编码区如上所述;包装质粒(pδ)提供所有向量蛋白质由CMV启动子,除了包膜蛋白;和envelope-encoding质粒(p-VSVG)编码不同的水泡性口炎病毒包膜蛋白(VSVG) [20.]。过程简要描述的补充方法。
2.8。体内药物和慢病毒载体注射
药物和病毒载体被编码的盲外科医生执行病毒注射和中风模型作为研究[7]。雷帕霉素(美国马Calbiochem, Billerica)溶解在PBS的最终浓度0.1毫米。10μl(雷帕霉素被注入到心室空间侧缺血使用微量调节注射器泵控制器缺血(前1小时14]。慢病毒注入了10μl针进入左皮质缺血前5天(6]。
2.9。主要神经文化
主要神经文化准备使用timed-pregnant Sprague-Dawley老鼠(E18,查尔斯河实验室国际,威明顿,MA)如前所报道(12]。这个过程中描述的补充方法。
2.10。体外Oxygen-Glucose剥夺和再灌注(OGD / R)模型,基因转移、细胞生存能力分析
主要混合神经文化从老鼠胎儿大脑和准备实验进行天9到11后准备。OGD在缺氧诱导6小时室如前所述[6]。OGD和再灌注治疗的方法简要描述的补充方法。细胞生存能力量化通过测量乳酸脱氢酶(LDH)释放后6小时OGD恢复使用先前描述的比色测定(21(补充方法)。
2.11。蛋白质制剂体内和体外免疫印迹的过程
缺血性脑收获相应的缺血性核心在中风发病后48小时,和大脑组织接受虚假的手术没有缺血也为西方墨点法。全细胞蛋白质提取新鲜的大脑组织。体外,细胞在基因转移后48小时,收获和均质在寒冷的细胞提取缓冲区包含1更易与l phenylmethylsulphonyl氟化物和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。匀浆离心机在10392 g (13000 rpm) 20分钟在4°C,和浮在表面的蛋白质被检测。体内和体外蛋白质浓度测定用布拉德福德分析西方程序之前,和西方墨点法进行描述与修改(22(补充方法)。制造商和目录的数量补充表中列出了所有主要的抗体使用S1。
2.12。免疫荧光染色法和共焦显微镜
Immunofluorescent染色的大脑部分(14和共焦显微镜7如前所述执行)。这个信息是在提供补充的方法。制造商和目录的数量补充表中列出了所有主要的抗体使用S1。
2.13。透射电子显微镜(TEM)
TEM进行中描述的补充方法。简单地说,老鼠先用PBS灌注,然后用4%多聚甲醛灌注PFA和1%戊二醛4 h,最后四氧化锇固定在1%和2%醋酸双氧铀。乙醇和丙烯氧化脱水后,组织是嵌入在纯净,新鲜quetol - 812环氧树脂。然后,部分的大脑uranylacetate沾2%和0.3%柠檬酸铅,然后分析了80千伏的范。
2.14。统计分析
数据表示为 。被认为具有统计显著性差异 。学生的 - - - - - -测试时使用两组进行比较。单向或双向方差分析是紧随其后的是费舍尔最小显著差事后测试使用棱镜7 (GraphPad软件科学,圣地亚哥,CA)。所有的评估都盲目的观察员。
3所示。结果
3.1。p53加重神经元缺血/再灌注损伤通过抑制mTOR通路在体外和体内
我们首先描述p53超表达的影响(OE)和击倒(KD)对缺血性损伤主要培养神经元和SD大鼠(数字1(一)和1 (b))。6 h (OGD后6 h后再灌注体外,LDH释放增加在p53 OE细胞减少的p53 KD细胞(图1(一))。p53基因的体内,管理或成分,梗塞大小明显增加或减少,分别在dMCAO 48 h后(图1 (b))。然后我们测量了水平的磷酸化mTOR S6K1后氧葡萄糖剥夺和再灌注损伤体外(OGD / R)。结果表明,p-mTOR和p-S6K水平下降了p53 OE(图1 (c)),但增加了p53 KD(图1 (d)后OGD / R损伤。mTOR的总蛋白质含量和S6K1相对稳定。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
下一个评估是否抑制p53缓解hypoxia-related受伤,我们构造的纯合子p53基因敲除小鼠(KO) (p53- / -),取得了杂合的(p53+ /−)小鼠(p53与WT小鼠交配+ / +)(图1 (e))。在体外,p53 KO (p53- / -)或p53杂合性(p53+ /−)减少LDH释放主要培养神经元受到OGD / R损伤(图1 (f)),但是使用慢病毒保护作用已经被废止p53 OE p53向量(图1 (g))。
同样,OGD / R损伤的主要培养神经元WT p53 OE后老鼠而加剧。然而,当PA (mTOR受体激动剂)是管理,缺血性损伤是缓解(图1 (h))。此外,当主WT与p53 shRNA转染小鼠神经元,LDH水平下降。当雷帕霉素,mTOR抑制剂,同时管理,OGD / R损伤恶化。此外,应用雷帕霉素恶化OGD / R损伤主要p53 KO小鼠神经元(图1 (h))。
此外,一个体内研究证实,p53 KO和杂合性改善神经行为赤字(图2(一个)),减轻梗死大小在MCAO后48小时,但p53 KO显示比p53杂合性(图更强的保护作用2 (b))。此外,他和TUNEL染色表明p53 KO和杂合的老鼠比p53 WT MCAO后轻微的缺血性损伤小鼠(数字2 (c)和2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
p53 KO的影响或杂合性的蛋白质含量p-Akt, p-PRAS40, p-mTOR, p-S6K缺血性脑组织MCAO后48 h检查并使用免疫印迹(数据量化3(一个)和3 (b))。p53 KO增加这些MCAO后磷酸化蛋白质的水平。此外,p53+ /−老鼠表现出显著的调节蛋白水平的p-Akt p-PRAS40, p-mTOR, p-S6K MCAO后与p53 WT老鼠。然而,p53 KO和p53杂合的老鼠显示改变总蛋白质含量与p53 WT虚假手术或MCAO后小鼠。
(一)
(b)
3.2。p53超表达的影响和可拆卸的对抗OGD / R损伤被废除主要培养PRAS40 KO小鼠神经元
证明mTOR信号通路被激活后抑制p53以及p53 KO和杂合的老鼠(图1图3),我们试图澄清的潜在机制连接p53和mTOR通路。因为我们以前的研究表明,PRAS40 mTOR(有监管的影响12),我们探讨p53和PRAS40之间的关系。首先,p53反应元素(RE)序列中确定的面积PRAS40基因启动子(图使用生物信息学分析4(一))。免疫印迹证实p53的表达明显高于PRAS40 KO小鼠脑组织的比,PRAS40 WT老鼠(图4 (b))。此外,我们研究了p53基因转移的影响引起的神经元死亡OGD / R损伤体外。我们测量LDH释放后6 h (OGD后6 h(再灌注使用主要培养PRAS40 KO和WT老鼠神经元p53 OE和KD。结果表明,当p53在主要培养神经元,神经元LDH水平显著低于从PRAS40 KO小鼠比PRAS40 WT老鼠。此外,与p53 shRNA慢病毒转染后的向量,OGD / R损伤主要培养PRAS40 WT老鼠神经元严重低于PRAS40 KO小鼠神经元(图4 (c))。这些发现表明PRAS40基因敲除消除的p53 OE-induced恶化OGD / R损伤和减轻p53 KD-induced OGD / R损伤主要培养的神经元。因此,PRAS40可能是一个潜在的目标规范mTOR的p53通路。
(一)
(b)
(c)
3.3。PRAS40 KD阻塞p53 KO对脑缺血性损伤的保护作用,增加神经元细胞凋亡和自噬抑制mTOR通路
我们使用TUNEL染色证实PRAS40 shRNA转染MCAO后神经细胞凋亡显著增加p53 KO小鼠相比,争夺shRNA转染或没有转染(图5)。然后,我们发现mTOR-related蛋白表达后OGD / R损伤用免疫染色和免疫印迹在初级培养p53 KO小鼠神经元有或没有PRAS40 shRNA转染(图6)。后OGD / R损伤,PRAS40的蛋白质含量,p-mTOR,和p-S6K仍然类似于p53 KO小鼠神经元和神经元pretransfected争夺成分但减少p53 KO小鼠神经元pretransfected PRAS40成分,建议PRAS40 KD屏蔽保护作用的p53 KO对抗OGD / R损伤和神经元细胞凋亡增加体外抑制mTOR通路。
(一)
(b)
(c)
此外,电子显微镜(图7(一))和免疫印迹(图7 (b))表明p53 KO和杂合的老鼠,LC3 II的表达显著低于p53 WT MCAO后小鼠。此外,免疫染色和免疫印迹证明LC3 II级显著增加当PRAS40撞倒在p53 KO小鼠MCAO后(数字7 (c)和7 (d)在神经元)和p53 KO小鼠后OGD / R损伤(图7 (e))。这些结果表明PRAS40击倒独立加剧了神经元自噬脑缺血性损伤后体外和体内即使p53被淘汰出局。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
这项研究提供了第一个证据,抑制p53减轻神经元I / R损伤体内和体外通过关键p53 / PRAS40 / mTOR通路。
4.1。PRAS40连接p53和mTOR通路来防止神经元I / R损伤
mTOR通路参与了缺血引起的脑损伤。尽管一些研究已经表明,mTOR的活动是有害的23),有证据表明upregulation Akt / mTOR的活动是对缺血性脑损伤神经保护24),这是按照我们之前的研究(6][14]。因此,一个适当的调节机制通过mTOR通路诱导神经元保护作用是必需的。
I / R损伤,包括在心肌、肾脏,和大脑,可以影响p53的活动,但p53的作用仍有争议。p53了缺血性肾损伤后神经保护和抗炎作用[25][26),但也加剧脑I / R损伤(27]。因此,p53可能对I / R损伤起到相反的作用因其参与各种信号通路。我们最好的知识,研究关于p53和mTOR脑缺血性损伤的影响很少。心肌I / R损伤可能与p53的表达和活动mTOR的途径(28]。同样的,我们之前发现抑制p53防止脑I / R损伤体外通过mTOR [3),由本研究还证实和其他作品29日]。p53 / mTOR可能是一个潜在的监管途径对脑I / R损伤。由于生物信息学分析和文献综述表明,没有直接监管的p53检测位点mTOR序列,我们认为可能存在p53和mTOR之间的连接。以前,我们发现PRAS40联系Akt mTOR通路和发挥了关键作用在防止中风12];此外,它是由生物信息学分析p53再保险PRAS40基因启动子的序列被确定。因此,我们假设PRAS40可能p53和mTOR通路之间的联系。
4.2。p53 / PRAS40 mTOR可能是小说和关键脑缺血性损伤信号通路
p53 / PRAS40 / mTOR途径第一次被提出和验证了我们的研究,我们也明确脑卒中后缺血性损伤的保护机制。如图5(c), OGD / R损伤不严重PRAS40 KO小鼠神经元即使p53是过表达。p53撞倒时,PRAS40 KO也没有加剧OGD / R损伤神经元。这些结果表明,PRAS40充当了p53的核心分子位于下游,和脑I / R或OGD / R损伤是由通过PRAS40 p53的活动。此外,我们还发现,mTOR通路时灭活PRAS40成分是p53的管理- / -老鼠神经元。这些结果与我们之前的研究(12),进一步证实了mTOR途径可以通过PRAS40监管。因此,我们假设的存在p53 / PRAS40 / mTOR通路。
PRAS40扮演关键的角色mTOR的监管由p53通路。在这项研究中,我们发现PRAS40撞倒时,mTOR信号通路无法激活或灭活,p53和脑I / R损伤保持相对稳定(与p53 PRAS40 KO超表达与p53 PRAS40 KO击倒,人物5(c))。因此,我们得出结论,PRAS40可能作为“桥梁”连接p53和mTOR通路。
4.3。p53 / PRAS40 / mTOR通路调节神经细胞自噬和细胞凋亡:一个潜在的脑卒中后缺血性损伤机制
各种各样的疾病和病理生理过程,包括癌症(30.)和I / R损伤(31日),可以促进自噬和凋亡。p53是参与了自噬过程(32]。之间的交互p53和自噬是复杂的。自噬抑制p53, p53激活自噬(32]。在脑缺血性损伤,p53诱导自噬可能促进神经元死亡和加剧大脑缺氧损伤(33),但这些角色仍有争议。各种p53信号通路,包括NF -κB / p53 [33],p53-TIGAR [34],TAF9b / p53 [35),参与细胞自噬,但具体的分子机制仍不清楚。据报道,自噬是由p53 / AMPK / mTOR信号在人类神经胶质瘤U251细胞(36]。因此,p53 / mTOR通路可能加重神经元自噬在脑卒中后缺血性损伤。
此外,p53缺血性中风后参与细胞凋亡的过程(37]。之前报道,脑I / R损伤与神经细胞凋亡,可由p53 [38]。在各种中风模型、p53缺陷或应用p53抑制剂显著减毒脑损伤(39]。神经细胞凋亡等可以通过信号通路由p53 p53 /等级(40]和DAPK1 / p53 [41];然而,p53诱导细胞凋亡的具体分子机制脑缺血性损伤后还不清楚。也发现,神经细胞凋亡可以由一种蛋白激酶/ mTOR途径[5]。在我们之前的研究报道,p53抑制有重要的保护作用对脑I / R损伤通过mTOR信号(3),这表明脑缺血性损伤后神经细胞凋亡可能是由通过mTOR p53通路。
在这项研究中,我们假设神经元自噬和凋亡通过p53 / PRAS40 mTOR通路可能是一个潜在的机制,卒中后加重缺血性损伤。的I / R-injured神经元自噬的作用,我们相信,它的重要性是相当大的和不可忽视的,基于以下证据:卒中后(1)模型建立体内或体外,水平的自噬相关蛋白(LC3-II,由西方墨点法)改变,由p53基因敲除,逆转和击倒PRAS40至少部分废除这个效果;(2)immune-fluorescence试验不仅揭示了蛋白质水平改变LC3-II也自噬小体的形成。我们认为这是直接证据来支持自噬的作用在神经元I / R损伤的病理机制;(3)电子显微镜的结果也表明,淘汰赛MCAO p53抑制自噬小体的形成的损伤大脑的体内。
同样,如图所示,TUNEL染色神经元细胞凋亡在p53 MCAO后缓解- / -老鼠,但当PRAS40成分是p53的管理- / -老鼠,凋亡神经元MCAO后观察。这些发现符合我们的假设,脑缺血性损伤后神经元自噬和凋亡调节通过p53 / mTOR通路,需要PRAS40自噬和凋亡调控。但具体的潜在机制仍不完全清楚,需要进一步的研究。
4.4。限制
首先,临床缺血性脑样品需要证实我们的结论。此外,更详细的机械的研究和生物信息学分析将确定进行p53 / PRAS40 / mTOR通路。第三,p53 / PRAS40 mTOR之间的交互和其他信号通路应探索清楚地阐明卒中后神经缺血性损伤的机制。
5。结论
p53抑制预防卒中后神经I / R损伤通过p53 / PRAS40 / mTOR途径,这是一个小说和关键脑缺血性损伤信号通路。神经细胞自噬和细胞凋亡的诱导p53 / PRAS40 / mTOR通路可能是这种保护作用的潜在机制。
缩写
| cca: | 颈总动脉 |
| 简历: | 甲苯基紫 |
| dMCAO: | 大脑中动脉闭塞远端 |
| 他: | Hematoxylin-eosin |
| 我/ R: | 缺血/再灌注 |
| 柯: | 基因敲除 |
| KD: | 可拆卸的 |
| LDH: | 乳酸脱氢酶 |
| mTOR: | 哺乳动物雷帕霉素靶 |
| mTORC1: | mTOR复杂1 |
| MCAO: | 大脑中动脉闭塞 |
| OE: | 超表达 |
| OGD / R: | 氧气和葡萄糖剥夺/再灌注 |
| PRAS40: | 脯氨酸Akt衬底40 kDa的蛋白质 |
| pPRAS40: | 磷酸化PRAS40 |
| 透射电镜: | 透射电子显微镜法 |
| TTC): | 2、3、5-Triphenyl-2H-tetrazolium氯 |
| TUNEL: | TdT-mediated dUTP缺口末端标记。 |
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者,荣谢,以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突与这篇文章的内容。
作者的贡献
Jianlan赵导致了研究设计,实验执行,数据收集,手稿写作。董Yinhui导致实验执行和数据收集。兴宇陈导致实验执行和数据收集。肖小导致实验执行和数据收集。Bo Tan导致实验执行和数据收集。陈龚导致实验执行和数据收集。金胡锦涛导致了数据的过程和验证。鱼汤气导致数据机和手稿修改。茶几李导致了研究设计、数据机和验证,手稿修改,最终批准。荣谢了研究设计、数据机和验证,手稿修改,并最终批准。 Jianlan Zhao and Yinhui Dong contributed equally to this work. Rong Xie is the leading author.
确认
我们感谢大家的神经外科,复旦大学华山医院。这项研究得到了国家重点研发项目(2018 aaa0100300和2018 aaa0100302)和中国国家自然科学基金(国家自然科学基金委)(81571111,81571111,81571111,81870968,81870909,81970695,,82071315)。
补充材料
补充实验材料和方法。(补充材料)