文摘
本研究的主要目的是探讨强力霉素的作用hyclate (Dx)在Wistar鼠皮肤伤口愈合过程。我们调查的影响Dx炎性细胞招聘和炎症介质通过的生产在体外和在活的有机体内分析。此外,我们分析了新血管形成,细胞外基质沉积,Dx的抗氧化潜力在Wistar鼠皮肤的修复。雄性动物( )被分成三个组有5个动物每个(协议:72/2017),和三个皮肤伤口(12毫米直径)创建的动物。组织如下:C,收到蒸馏水(控制);Dx1,强力霉素hyclate(10毫克/公斤/天);Dx2,强力霉素hyclate(30毫克/公斤/天)。应用程序进行每日长达21天,和组织从不同的伤口被移除每7天。我们的在体外分析表明,n -乙酰- Dx导致巨噬细胞增殖和增加β-D-glucosaminidase(唠叨)生产,除了减少cyclooxygenase-2 (cox - 2)、前列腺素E2 (PGE2)和金属蛋白酶(MMP),这表明巨噬细胞激活和抑制cox - 2可能是由独立的监管机制。在活的有机体内,我们的研究结果提出了提高多孔性、血管和肥大细胞的数量。观察cox - 2和PGE2差别不过,对这些基因的表达,这是仅限于表皮细胞。这个途径的差别我们的结果也显示,对这些好处氧化平衡通过减少蛋白质羰基,丙二醛、一氧化氮和过氧化氢(H2O2)。此外,增加抗氧化酶(过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)Dx曝光后,这表明它的抗氧化潜力。最后,Dx的类型我胶原蛋白和弹性纤维和MMP的水平降低,从而加速皮肤创伤的关闭。我们的研究结果表明,两种剂量的Dx可以调节皮肤修复过程,但最好的接触最高剂量后观察效果。
1。介绍
皮肤是一个复杂的器官,作为屏障可以保护人体免受外部环境(1]。然而,不同的激进的代理,如创伤和微生物,会影响这个器官的结构和功能。在病变的情况下,有一个暴露的皮下组织,它提供了一个潮湿和有营养的环境微生物增殖和殖民2]。受感染的皮肤伤口chronification的风险增加,降低了生活质量,并导致高死亡率的患者(3]。皮肤伤口是一个严重的健康问题,经常与高成本和低效率的效率(有限的治疗4]。今天可用的治疗方法旨在改善伤口愈合的促进他们快速关闭。然而,控制感染通常是被忽视的5]。作为一个结果,它是可取的开发治疗性干预,控制感染,增加皮肤的修复。
皮肤创伤的修复是一个过程,涉及到一个复杂的细胞间相互作用,细胞外基质,血管,和组织生长因子。此外,炎症的过程分阶段,扩散(造粒),和组织重构(6]。在炎症阶段,有一种白细胞迁移到受伤的网站,与细胞介质的释放。在增殖阶段,有一个乘法的角化细胞,成纤维细胞,内皮细胞,导致肉芽组织的形成,也富含血管和胶原蛋白类型III (7]。下一阶段的特点是组织重构和成熟,胶原蛋白III是我取代了胶原蛋白,从而使疤痕强度及抗机械力(8,9]。
皮肤愈合过程被称为急性或慢性,根据它的持续时间和性质(7]。chronification过程期间,有持续激活的考克斯和中性粒细胞和巨噬细胞释放细胞因子和趋化因子,吸引更多的细胞炎症的位置和促进修复组织的氧化应激(10,11]。促炎介质的过度增加的过氧化氢(H2O2)和氧化氮含量,加快过氧化脂质和蛋白质(12]。prooxidant介质对皮肤组织造成破坏和延迟伤口愈合的过程。因此,控制炎症过程是必要的,以避免持续组织损伤通过持续行动的自由基和活性氧(ROS) (13]。与此相关,我们可以强调皮肤愈合环境通常是prooxidant和一般礼物合成和抗氧化酶的表达减少,如过氧化物、过氧化氢酶,谷胱甘肽,损害治疗环境(14]。
一般来说,一个理想的修复过程的结果从一个平衡的炎症介质的合成和降解过程和职业,因此抗氧化化合物在细胞外基质成分,尤其是胶原蛋白(15]。基质金属蛋白酶(MMP)起着关键作用的细胞外基质(ECM)周转率重构,通过降解胶原蛋白和noncollagenous元素,如粘多糖、蛋白聚糖,细胞因子,生长因子及其受体16]。然而,MMP过度可能导致不可控降解ECM和延迟伤口愈合过程的17- - - - - -19]。因此,MMP调节药物可能会导致对皮肤组织修复的一个重要影响,与特定影响组织炎症和成熟。在这种背景下,强力霉素(Dx)已被描述为一种抑制剂的MMP的活动(20.),它的使用已被证明的调制组织水平的胶原蛋白在皮肤的修复21),刺激胶原蛋白沉积。此外,Dx被证明是一个重要的工具来抑制促炎细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、il - 6和引发(22]。因此,我们认为Dx会影响皮肤的愈合过程。尽管Dx是有效治疗各种疾病(23- - - - - -25),对Dx皮肤组织修复的作用。因此,本研究评估Dx巨噬细胞的生存能力的影响,监测炎症变化在体外,使用一个实验模型理解Dx对炎症的影响,氧化状态,血管增生,纤维发生的反应在大鼠伤口愈合。
2。材料和方法
2.1。在体外化验
2.1.1。细胞生存能力
对RAW264.7细胞生存能力评估了巨噬细胞3 - 4 5-dimethylthiazol-2yl 2, 5-diphenyl溴化四唑(MTT)试验如前所述26,27]。细胞在DMEM培养补充10%胎牛血清和100 U /毫升的青霉素和链霉素湿润有限公司5%237°C孵化器。Dx细胞生存能力的影响,评价RAW264.7巨噬细胞被播种到96孔板的密度 细胞/在200μL媒介。24小时后,不同浓度的Dx(10、30、100和300μg / mL)被添加到媒体,和孵化未来24小时持续37°C和5%的公司2。控制(增长100%)进行了细胞培养介质。MTT的解决方案是添加到每个好,细胞进一步孵化2 h,在37°C。MTT甲瓒在孵化在DMSO溶液溶解,生成和吸光度测量在570海里。对于每一个样本,其结果是表示为吸光度比例与对照组。
2.1.2。巨噬细胞的挑战与有限合伙人
RAW264.7巨噬细胞培养在相同条件下被播种在24-well聚苯乙烯板, 细胞,1毫升的培养基/。24小时后,培养基代替,和RAW264.7细胞培养24小时新鲜中含有10%的边后卫,没有与100 ng / mL或有限合伙人(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)和不同浓度Dx(10、30、100和300μg / mL)。控制细胞治疗新鲜培养基。孵化24小时后,巨噬细胞收获;细胞数量是由细胞计数量化和调整纽鲍尔室。细胞与100毫米生理盐水溶解/ 50 mM Tris-HCl缓冲区和离心机(15分钟在4°C)。文化的上层清液收集测量前列腺素生产酶分析MMP cyclooxygenase-2, N-acetylglucosaminidase。
(1)Metalloprotease活动。矩阵metalloproteases酶活性的巨噬细胞匀浆测定使用荧光酶装备,根据制造商的说明(ABCAM、剑桥、马、美国)。MMP的活动为490 nm / 525海里(激发/发射),如前所报道(28]。
(2)Cyclooxygenase-2活动。一个整除(100μL)巨噬细胞匀浆的应用于测量cyclooxygenase-2 (cox - 2)的活动,使用生化比色分析工具,在制造商的指令(开曼化工、安阿伯市MI,美国)。酶反应的环氧酶是基于过氧化物酶的组成部分,中过氧化物酶活性spectrophotometrically衡量监控生产氧化N, N, N ,N - - - - - -tetramethyl-p-phenylenediamine 590海里。
(3)前列腺素的生产。前列腺素E2 (PGE2)含量的巨噬细胞匀浆被具体量化的酶联免疫吸附试验(ELISA)装备,根据制造商的说明(开曼化学,安阿伯市,美国)。简单地说,10μL匀浆被添加到96孔酶标之前与特定的抗体PGE2敏化。分光光度法测定前列腺素水平在412纳米29日]。
(4)N-Acetylglucosaminidase活动。RAW264.7细胞的激活基于n -乙酰-的量化测定β-D-glucosaminidase(唠叨)活动,这是一种溶酶体酶产生的强烈激活单核细胞/巨噬细胞(30.]。n -乙酰-β-D-glucosaminidase通过商业活动以皮肤匀浆生化比色装备,根据制造商的说明(Abcam,剑桥,英国)。本试验使用合成p-nitrophenol导数(R -pNP)作为一个唠叨衬底和释放pNP,以分光光度法来衡量,在400海里。
2.2。在活的有机体内化验
2.2.1。动物和道德
15健康三个月大的雄性Wistar鼠(鼠形)( )从中央得到健康和生物科学中心,联邦Vicosa大学。这些动物被随机分配在单独的笼子里,每天打扫,保持在控制环境条件下(温度: ,湿度:60 - 70%,光/暗周期:12/12 h)。商业提供了食物和水随意。所有的实验都通过维索萨联邦大学宽敞的动物伦理委员会(登记号72/2017)。
2.2.2。手术伤口的过程
老鼠与戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(70毫克/公斤)。麻醉后,背外侧剃须的动物表演,该地区与70%的酒精清洗。三个圆形皮肤伤口12毫米直径的背外侧区域中创建每个老鼠次要目的,手术切除的皮肤和皮下组织细胞利用手术剪刀。伤口的面积上有紫水晶和测量与模拟卡尺(三丰公司南美国Ltda®,圣保罗,巴西)(31日]。以来没有管理手术后镇痛药物的应用可以改变细胞迁移和增殖和妥协的皮肤修复过程。组织样本来自不同的伤口在7日14日和21天,组织学和生化分析,呈现在图1。
2.2.3。实验设计
动物被随机分为三组,每组五个动物:C(蒸馏水、控制);Dx1(强力霉素10毫克/公斤/天),和Dx2(强力霉素30毫克/公斤/天)。由填喂法21天治疗。这一时期后,动物安乐死通过心脏穿刺放血,麻醉后过程。提供的剂量是根据研究口服Dx用于角膜reepithelialization兔模型(32],Dx是由填喂法抑制MMP-mediated血管变化在高血压大鼠(33]。他们发现许多动物死后每天100毫克/公斤,因此建议对强力霉素治疗窗口可能是相当狭窄的。因此,我们决定研究的影响与10和30毫克/公斤剂量,因为研究没有报道对动物有害的影响。
2.2.4。计算区域和伤口收缩
的面积和速度第三伤口收缩每7天进行评估,使用图像扫描 像素(24位/像素)通过一个华硕Zenfone 2 ZE551ML智能手机(华硕、台北、台湾)。伤口面积的计算公式 ,在哪里是半径。伤口收缩指数(组织)的比例计算: (34,35]。
2.3。组织学和Stereological分析
样品收集到的伤口,在病变的中心组织,在组织固定剂浸泡24小时,在乙醇脱水,二甲苯diaphanized,沉浸在石蜡。组织学部分(4μ米厚)得到旋转切片机(2045年徕卡Multicut Reichert-Jung产品,德国)。我们使用每20的第1部分,以避免重复相同的分析组织区域。部分被苏木精和伊红染色(他)成纤维细胞和血管的分析(31日]。此外,样本与天狼星红染色胶原纤维类型的分析我和III (36]。甲苯胺蓝是用来确定肥大细胞(37],Verhoeff被用来区分弹性纤维(14]。幻灯片是可视化和捕获BX601光学显微镜(奥林匹斯,圣保罗,巴西)加上QColor-31数码相机(奥林匹斯,圣保罗,巴西)。5图像被随机选择使用20 x物镜。对于这个分析,包含256分在一个标准的测试区域的网格(在) 在每个图像叠加。体积密度的stereological参数( )计算通过计算点发生在细胞,血管,类型I和III胶原蛋白和弹性纤维,使用比例: ,页在哪里发生结构的兴趣点的数量和PT的总数是点在测试系统上(31日,38]。胶原纤维根据不同的双折射特性,分析了厚度胶原纤维(I型)出现在明亮的颜色从红色到黄色的阴影,而细网状纤维(III型胶原)出现明亮的绿色在极化(31日,39]。分析了肥大细胞使用40 x物镜。十个显微镜领域被随机在每个组织切片进行分析,以获得一个总面积(TA) 1.96毫米2。单位组织的肥大细胞数量面积计算根据关系 (40]。
2.4。cox - 2免疫组织化学
组织学部分(4μ米厚)与二甲苯脱蜡、水化蒸馏水。抗原复苏与柠檬酸缓冲(pH值6)执行高压锅4分钟。10分钟的部分被孵化3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,其次是15分钟在5%脱脂牛奶准备pH值7.6 TBST (1 x Tris-buffered盐水渐变20)为0.05%。然后,部分被孵化12 h,在4°C,其主要兔子anti-COX-2抗体(ab15191 Abcam,剑桥,英国),1:1000稀释。幻灯片是TBST清洗和孵化2 h在室温下,用现成的二级山羊anti-rabbit IgG抗体共轭与辣根过氧化物酶(Dako设想™+双链接System-HRP,安捷伦,圣克拉拉,CA,美国)。幻灯片与TBST洗,cox - 2标记了3,0.5% 3 - - - - - -diaminobenzidine为5分钟。最后,幻灯片被释放在乙醇、二甲苯,处理和安装盖玻片。
2.5。生化检测
组织收集碎片从每个伤口,立即冻结在液态氮(-196°C),并存储在一个冰箱−80°C。样品(200毫克)均质磷酸盐(PBS)和2毫升离心5分钟,享年10000岁 ,在5°C(制冷、14]。上层清液和组织颗粒分别收集并用于生化分析下面描述。
2.5.1。Cyclooxygenase-2、N-Acetylglucosaminidase活动和前列腺素的生产
Cyclooxygenase-2、N-acetylglucosaminidase活动和前列腺素E2生产援助的疤痕组织测量相同的商业工具用来量化这些参数在体外模型。所有措施进行完整的皮肤(0)和疤痕组织收集在7天,14日和21的伤口愈合。酶活性和前列腺素水平测定在组织匀浆上清液。
2.5.2。过氧化氢和一氧化氮产量
过氧化氢(H2O2)生产测量组织匀浆上清液。50μL的上层清液与50孵化μL (α-苯二胺盐酸盐(门诊部当)和同等体积的过氧化物酶II型15更易/ L。吸光度转换成微摩尔的浓度的H2O2根据标准曲线计算,使用一个已知浓度的H2O2。结果表示为μmol / L (41]。
一氧化氮(NO)是间接量化检测亚硝酸盐/硝酸盐(NO2- - - - - -/不3- - - - - -)水平的标准格里斯反应(42]。50μL上层清液的孵化与同等容积的格里斯试剂(1%磺胺,0,1% N - (1-Naftil)乙二胺和2.5% H3PO4)并保持在室温下10分钟。吸光度转换成微摩尔的浓度没有得到的亚硝酸钠标准曲线(0 - 125μ米),表示没有浓度( )。
2.5.3。测定脂质和蛋白质氧化
脂质过氧化(法律流程外包)据估计总数丙二醛(MDA)水平(43]。MDA浓度测定用已知浓度的标准曲线1,1,3,3-tetramethoxypropane (TMPO)。结果表示为 每毫克的蛋白质。
蛋白质氧化蛋白质羰基含量估计,用2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) [44),基于与DNPH羰基的反应。产生的颗粒从先前的痛苦被用于量化组织匀浆。结果表示为nmol /毫升的蛋白质。
2.5.4。超氧化物歧化酶活性
超氧化物歧化酶(SOD)的活性是由过氧化物(O2- - - - - -)和过氧化氢还原法,从而降低焦棓酸的自动氧化作用[45]。SOD活性计算每毫克的蛋白质,单位与SOD定义为一个单位(U)的抑制率焦棓酸自氧化50%。
2.5.5。过氧化氢酶活性
过氧化氢酶(CAT)活性评估根据Aebi[描述的方法46),通过测量过氧化氢的分解率。一个单位的猫活动计算使用的酶分解1更易与H2O2为1分钟。结果表示为单位的过氧化氢酶/毫克的蛋白质。
2.5.6。谷胱甘肽S-Transferase活动
谷胱甘肽S-transferase(销售税)活动用的方法测量Habig et al。47]。谷胱甘肽S-transferase活动根据glutathione-conjugated 2的形成,分析了4-dinitrochlorobenzene (CDNB)。一个单位的销售税活动被定义为催化的酶量的形成μ摩尔的产品/分钟/毫升。销售税活动表示为U /毫克的蛋白质。
2.5.7。MMP-10皮肤的活动的评价
MMP-10评估活动,200毫克的皮肤样品均质在1毫升的5毫米Tris-HCl (pH值7.4)缓冲区包含0.15 M氯化钠,CaCl 10毫米2,0.02%的南3。离心后30分钟,上层清液收集分析MMP的活动。这样的ELISA商业immunoenzymatic工具包使用根据制造商的指示(Sigma-Aldrich;默克公司,达姆施塔特,德国)。
2.6。统计分析
进行了统计分析使用GraphPad棱镜7软件系统(GraphPad软件公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。结果表示为平均值和标准偏差( )。参数数据使用单向方差分析方差分析进行比较,其次是Student-Newman-Keuls事后测试。非参数的数据使用克鲁斯卡尔-沃利斯检验进行比较。建立了统计学意义 。
3所示。结果
3.1。Dx对巨噬细胞生存能力的影响,前列腺素生产,和cox - 2、MMP和唠叨的活动
Dx的影响巨噬细胞生存能力呈现在图2。没有观察到的细胞毒性暴露后Dx的巨噬细胞。此外,最高的巨噬细胞与100年孵化后观察细胞增殖μ克/毫升( )和300年μ克/毫升( )Dx,这表明一个明确的剂量依赖性效应(数字2(一个)和2 (b))。
(一)
(b)
在在体外分析,Dx也减少了糖蛋白cyclooxygenase-2 Dx100组(cox - 2)厘米,相比Dx10, Dx30。Dx300集团提出减少COX2、数控、厘米,Dx10, Dx30, Dx100。在CM中前列腺素E2水平更高,Dx(10、30和100),相比数控组。Dx100提出减少与厘米,Dx10, Dx30。Dx300提出了一个减少相比,数控,厘米,Dx(10、30和100)。金属蛋白酶(MMP)提出了一个减少厘米,Dx10, Dx30和Dx100组相比,数控组。Dx100组值较低,相比厘米,Dx10, Dx30组。Dx300集团提出了降低值相比,数控,厘米,Dx(10、30和100)。在所有组NAG值增加(厘米,Dx10, Dx30 Dx100, Dx300)相比,NC组(图3)。
3.2。伤口面积和收缩指数
伤口面积较小的7天,14日和21 Dx1组与对照组相比,以及14天,Dx2组与对照组。伤口收缩的速度高于Dx1 Dx2组,与对照组相比,在21天(图4)。
(一)
(b)
3.3。组织病理学结果
7天,总细胞组织的比例更高Dx2组与其他组。同日,Dx1显示更高比例的细胞,与对照组相比。14天,Dx2提出了更高比例的细胞与对照组(图5(一个))。相对于血管,Dx1和Dx2组显示血管的比例增加时,与对照组相比,在7天。然而,14天,船只的比例降低Dx1组相比,控制动物。21天,Dx1提出减少血管相比,控制和Dx2组(图5(一个))。细胞和血管的分布不同群体的疤痕组织图所示5 (b)。
(一)
(b)
肥大细胞的数量,7天,高Dx2组与其他组相比。此外,Dx1集团提出了更多的细胞与对照组相比(图6(一))。瘢痕组织中肥大细胞的分布Dx2集团7天,如图6 (b)。
(一)
(b)
更高比例的I型胶原纤维中观察到治疗组和Dx1 Dx2, 21天,相比对照组。III型胶原纤维减少Dx1 Dx2, 21天,对照组相比(图7(一))。我型和III型分布的纤维疤痕组织的不同群体和I型胶原纤维的优势治疗后与Dx如图7 (b)。在14天、21日高弹性纤维的数量Dx2集团相比其他组(图7 (c))。弹性纤维疤痕组织的代表分布Dx2组,21天,如图7 (d)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。生化结果
3.4.1。免疫组织化学和cox - 2、PGE2和唠叨的活动
数据8(一个)和8 (b)显示cox - 2的结果分析,提出了降低值Dx2组控制和Dx1相比,7天。这些结果证实了分析的显微照片,显示减少Dx2 cox - 2的表达情况,主要在上皮细胞。Dx2集团与PGE2显示较低价值与其他组相比,在7天(图8 (c))。巨噬细胞积累/激活Dx1中的NAG值增加,证明Dx2组相比,控制(图8 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4.2。氧化应激的标记
7天,H2O2水平更高的Dx1 Dx2组与对照组。14天,Dx2显示降低H2O2水平的控制和Dx1组。21天,Dx2显示低水平的H2O2相比,对照组(图9(一个))。亚硝酸盐和硝酸盐含量降低Dx1 Dx2组,与对照组相比,在14天(图9 (b))。关于丙二醛,水平低的Dx1 Dx2组,7天,相比控制(图9 (c))。另一方面,减少集团Dx1羰基蛋白含量确定,与对照组相比,在21天(图9 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4.3。抗氧化酶和Metalloproteinase-10
超氧化物歧化酶活性更高的Dx1组,21天,相比Dx2组(图10 ())。过氧化氢酶活性高天7和14日Dx1 Dx2组相比,控制。21日,天猫活动在Dx2低,关于Dx1组(图10 (b))。谷胱甘肽S-transferase值没有显著不同的在试用期(图10 (c))。14天,MMP-10水平低Dx2 Dx1相比。21天,两组治疗Dx呈现低水平的MMP-10相比对照组(图10 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
强力霉素是一大群广谱抗生素来自四环素(48]。研究表明,Dx礼物治疗活动无关其抗菌活性(49,50]。本研究使用一个集成的细胞和组织分析评价影响Dx Wistar鼠口头管理时,修复他们的皮肤。因此,我们观察到,Dx是有效完成关闭伤口和伤口收缩的速度增加。这种效应可能是与Dx抗菌和抗炎能力(49,51]。这些结果表明,Dx治疗皮肤损伤有益的行动。然而,研究调查这种药物的作用在皮肤的修复仍然稀缺和有限,主要是当与其抗氧化能力有关。在最近的一次系统的回顾,我们发现阳性结果的抗生素疗法治疗皮肤伤口。然而,有限的证据表明,Dx可以对皮肤损伤的治疗起到有益的作用在活的有机体内(52]。综述,磺酰胺类抗生素最常用,强力霉素测试只有一项研究[52]。为主要机制Dx暴露后的皮肤的修复仍然未知,研究使用免疫、生化、氧化标记是必需的。
由于其强大的抑菌性能,Dx是一种有效的抗生素来治疗疾病,如梅毒(23[],牙周疾病24)、肺炎(53),和霍乱(54]。尽管Dx皮肤修复的影响的研究还很少,但这种药物增加胶原蛋白沉积(55促进组织reepithelization [],20.),有利于消除活性氧,从而防止或减少病理组织破坏(56]。此外,Dx炎症细胞的增殖变化(57]。从这个意义上说,我们注意到,Dx增加巨噬细胞增殖在体外,发挥潜在的剂量依赖性免疫调节活动。这种效应与增加巨噬细胞的激活,这表明了upregulation唠叨活动引起的所有剂量的Dx。相反,Dx-treated巨噬细胞表现出剂量依赖性降低cox - 2和PGE2的水平,这表明巨噬细胞激活和cox - 2抑制由Dx通过潜在的独立监管机制,需要进一步调查。然而,有证据表明,不同的药物具有抗菌和抗炎的特性如nimesulide,布洛芬,阿莫西林可以不同(即调节巨噬细胞活动。内吞作用和一氧化氮产量)和细胞因子和前列腺素分泌58- - - - - -60),证实这些代谢过程的相对独立性。因此,这个特定的Dx对cox - 2和巨噬细胞活动的影响可能是在伤口愈合有关,因为它可以调节炎症反应的强度没有抑制细胞活化抗原刺激,产生一个重要保护作用对抗感染。
此外,我们的研究结果还揭示了疤痕组织细胞的总量增加,突显了大量的肥大细胞。这主要是观察当我们使用更高剂量的Dx和愈合过程的早期阶段。肥大细胞是重要的炎症阶段修复过程,促进巨噬细胞的激活和肉芽组织的形成,细胞迁移和成熟的胶原纤维(61年]。因此,我们相信,Dx可以刺激细胞迁移的过程,加快关闭伤口,从而降低感染的风险。另一方面,我们观察到,Dx刺激I型胶原蛋白的比例的增加,与III型胶原蛋白的比例很低,经过21天的治疗。这些特征是非常重要的,因为一个高比例的I型胶原纤维增加组织抵抗和力(62年]。这些胶原纤维具有共价键和完整的皮肤中更常见63年]。一般而言,开始的时候伤口愈合过程,观察高沉积III型胶原蛋白,但随着过程的进行,III型胶原纤维取代了I型胶原纤维(14),使组织更耐牵引。弹性纤维,与Dx,治疗后有所增加,这在细胞外基质纤维疤痕组织,特别是在最后阶段的组织重构。同样,Dx的作用分析了弹性纤维涌et al。64年),马凡氏综合征,Dx保存在胸主动脉弹性纤维,可能通过抑制金属蛋白酶的作用。因此,我们的研究结果显示诱导细胞的增殖能力,因此,细胞外基质的合成应用程序后的Dx。
细胞结构和新血管形成是必不可少的,伤口愈合的过程中,尤其是在炎症阶段(6]。良好的血管化可以为细胞提供氧气和营养物质,这对受伤组织的恢复是很重要的(65年]。此外,新血管的形成有直接联系的形成一个新的矩阵,称为肉芽组织,富含血管和细胞。当流程进步,血管和细胞的数量减少,但纤维数量的增加,这是成熟的疤痕组织(66年]。因此,新的有效的治疗方法应该促进强烈neoangiogenesis的修复过程,减少血管的水平的过程。对于Altoe et al。52),四环素类由强力霉素增加胶原蛋白组织,因此,破裂的伤口。确凿的目前的证据,我们的发现表明Dx刺激的增加新船的伤口过程(7天)和细胞的数量,可能由于强烈激活炎症细胞的迁移和增加的唠叨证明,在同一时间。另一方面,减少血管和细胞被观察到,而纤维增加伤口修复的在更高级的阶段。这些变化是非常重要的对于伤口愈合的进化和提供阻力,迫使新组织。
有趣的是,Dx也有效地衰减cox - 2活动和PGE2只有在伤口愈合的初始阶段(7天),这种抑制作用发生的同时增加了细胞结构和唠叨疤痕组织的活动,cox - 2活动和PGE2的主要来源似乎不相关的免疫细胞的增加招聘,包括巨噬细胞。确凿的这个命题,我们发现,动物治疗高剂量的Dx提出了一个减少瘢痕组织中cox - 2的表达,这是仅限于表皮细胞。因此,我们的研究结果表明,角化细胞,差别Dx-induced cox - 2的主要目标是对这些代表一个效应可能局限于伤口愈合的初始阶段。从cox - 2活动,强烈的PG水平后发现皮肤损伤,这是很强的促炎效应物吸引免疫细胞,刺激纤维母细胞,内皮细胞增殖和代谢在伤口面积(11]。cox - 2发挥了中央在花生四烯酸途径和监管作用,通过调节止血和炎症(67年),直接影响伤口愈合的后续阶段的发展(68年]。因此,控制炎症的可能差别cox - 2对这些相关策略的Dx加速增殖和装修阶段,爆发刺激愈合过程的分辨率。自从PG发布由cox - 2激活触发器prooxidant机制,Dx可能变弱氧化应激,从而延长炎症阶段由于二级活性分子损伤(49]。
强烈的自由基的生产通常是在愈合过程的初始阶段。在皮肤损伤,免疫细胞吞噬产生自由基的过程称为呼吸爆发(69年]。活性氧的自由基,(ROS)和活性氮物种(RNS)促进细胞氧化应激,破坏膜,蛋白质,和遗传物质70年,71年]。在尊重ROS,重要的是要考虑存在过氧化氢(H2O2),被称为氧化还原代谢的一个重要标志,更在炎症阶段常见的愈合过程72年]。在我们的研究中,正如所料,H的水平2O2增加7天治疗组与Dx,对应于炎症阶段,但减少在以后的阶段,在14天、21日在Dx2组。在这种情况下,多余的H2O2可能发生在炎症阶段,由于细胞迁移,中性粒细胞和巨噬细胞,释放介质和活性氧在吞噬作用(73年]。同时,我们相信,在这个阶段,激活的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)发生,而产生H2O2激活细胞增殖和细胞凋亡。在我们的研究中,我们认为,一个巨噬细胞数量的增加,证明了在体外和在活的有机体内唠叨的分析,可以证明H水平的增加2O2早期的修复过程。另一方面,H2O2和一氧化氮(NO)水平下降在第14天,这表明Dx是有效抑制脂质过氧化作用和蛋白质氧化后阶段的过程。然而,没有过多可能会导致不可逆转的损伤细胞,体内平衡障碍,激活不同的信号级联,如增殖作用(地图)或c-Jun N终端激酶(物),造成细胞退化和死亡(74年]。一般来说,很难衡量组织没有因半衰期短。不,亚硝酸盐(NO2),硝酸盐(NO3)(使用的标记通常75年,76年]。由于这一点,在我们的研究中,我们测量了亚硝酸盐和硝酸盐含量Wistar鼠的疤痕组织。
氧化应激的标记是重要的工具来评估健康和受损组织的氧化还原平衡77年]。MDA是3个碳原子的化合物合成的多不饱和脂肪酸的过氧化作用,通常形成的氧化细胞膜脂质(78年]。通常在皮肤的修复,MDA的增加,主要是在炎症阶段,这表明受损组织和缓慢的伤口关闭79年]。在我们的研究中,我们观察到减少MDA水平的7天,治疗后与Dx1 Dx2,这表明强力霉素能积极调整组织的氧化还原状态恢复。也发现类似的结果Nogueira et al。80年感应后,抽搐的病变,毛果芸香碱的应用后,parasympathomimetic生物碱提取毛果芸香叶。这些作者表明,Dx减少脂质过氧化反应在大脑中,从而保护组织免受自由基的作用。活性氧的作用的另一个重要标志和RNS组织是羰基化作用的蛋白质的含量高,这表明蛋白质氧化(66年,81年]。在目前的研究中,治疗后与Dx,只使用低剂量,减少蛋白质羰基化水平的观察,表明这种药物的抗氧化二次行动。Serra et al。82年)评估强力霉素的抗氧化作用,证明了这种药物,以及其他四环素,类似于维生素E,主要是由于存在酚环与多个替换。这酚环与自由基反应,生成酚醛激进,这是相对稳定的,而不是活性细胞组件(83年]。从这个意义上说,除了作为抗菌,Dx还提出了抗氧化剂次要行动,保护恢复组织。
维持体内氧化还原平衡在一个受伤的组织抗氧化防御系统的行动是必要的,哪些展品组件,如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽S -转移酶(GST) [84年,85年]。SOD消除超氧化物自由基,这是非常危险的和破坏性的细胞(86年]。CAT酶加速电子的流逝,降低H的住所2O2在细胞内部,从而避免了这种化合物的危害组织(87年]。这意味着,对于一个药物被认为是有效治疗病变引起的自由基,它是非常可取的刺激这些抗氧化酶的转录和翻译。我们的研究结果表明,Dx增加SOD和CAT的活动组织。增加猫主要是发现在炎症阶段,这印证了我们的研究结果与H的水平2O2。我们相信增加SOD和CAT减少过氧化物离子(O2- - - - - -)和H2O2,从而保护组织。
胶原合成与降解之间的不平衡是一个共同特点,就是皮肤病变,主要在感染伤口88年]。这种不平衡的一个常见后果就是肥厚性疤痕和瘢痕疙瘩的形成,导致纤维化和组织功能的损失(8]。基质金属蛋白酶酶在急性或慢性的皮肤伤口,调节胶原的沉积和降解细胞外基质,这是必不可少的伤口reepithelization [19]。多余的上皮细胞,这些酶可能会导致混乱的变化和信息联系,成纤维细胞和角质细胞凋亡增加89年]。在我们的研究中,我们观察到的水平下降MMP的在在活的有机体内分析,治疗后与Dx1 Dx2,印证了我们的发现伤口面积减少和增加伤口收缩的速度在这些组。愈合过程平稳、有效地发生,胶原蛋白的合成和降解之间的平衡是必需的。如果有优势的MMP组织,加剧了细胞外基质的降解可能发生,而妥协伤口关闭(19]。其他研究表明,Dx加速关闭管理皮肤伤口通过抑制MMP-9 [82年)和加速胃伤口的恢复通过抑制MMP-2和H2O2(90年]。平衡这种酶的合成需要有效的皮肤修复,可以促进细胞迁移和加快复苏的组织。
5。结论
综上所述,我们的研究结果表明,这两种剂量的Dx可以调节大鼠皮肤创伤的修复。然而,一般来说,最好的结果在多孔性,肥大细胞,弹性纤维,过氧化氢水平,metalloproteinase-10接触后被观察到的最高剂量的强力霉素hyclate(30毫克/公斤)。在体外,我们的研究结果表明,Dx增加巨噬细胞增殖,但降低cox - 2和PGE-2水平。这表明巨噬细胞激活和抑制cox - 2可能是由独立的监管机制。我们的研究结果表明,在体外,尽管增加细胞的数量在伤口愈合的初始阶段,降低cox - 2的表达,这是仅限于表皮细胞。因此,我们的结果表明,角化细胞,差别Dx-induced cox - 2的主要目标是对这些基因的能力调节炎症反应的强度没有抑制细胞的激活可以发挥重要作用的有利的进化愈合过程。此外,cox - 2参与prooxidant机制以来,这个途径Dx的监管也青睐氧化平衡进入细胞和保护分子对抗自由基的作用,显示出一种抗氧化剂皮肤伤口修复的潜能。这些信息可能是有关治疗的选择,主要在皮肤伤口愈合的急性期。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关出版的手稿。
确认
作者感谢支持企业管理学院做基金会提供的“尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(FAPEMIG、流程apq - 01895 - 16, ppm - 00687 - 17日和ppm - 00077 - 18),慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq、流程303972/2017-3,423594/2018-4、305093/2017-7 MCTIC 408503/2018-1),和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量优越,巴西(斗篷、财务代码001)。