文摘

背景。胃电踱步(GEP)可以恢复卡哈尔间质细胞在糖尿病大鼠。M2巨噬细胞导致卡哈尔间质细胞损伤的修复虽然分泌血红素oxygenase-1 (HO-1)。这项研究的目的是探讨胃电的效果和机制踱步M2巨噬细胞在糖尿病模型。方法。六十岁男性Sprague-Dawley老鼠随机分为控制,糖尿病(DM),糖尿病与虚假的GEP (DM + SGEP),糖尿病与GEP1马(5.5 cpm 100 ms, 4) (DM + GEP1),糖尿病与GEP2马(5.5 cpm 300 ms, 4) (DM + GEP2),和糖尿病GEP3马(5.5 cpm 550 ms, 4) (DM + GEP3)组。卡哈尔间质细胞的凋亡和巨噬细胞被免疫荧光技术检测到的表达。的表达水平Nrf2 / HO-1和NF -κB通路使用免疫印迹分析或免疫组织化学的方法进行评估。Malonaldehyde、超氧化物歧化酶和活性氧进行测试,以反映氧化应激水平。结果。卡哈尔间质细胞的细胞凋亡增加DM组但明显降低DM +实施组。巨噬细胞的总数几乎是相同的在每一个分组中。DM组,M1巨噬细胞增加,M2巨噬细胞减少。然而,M2巨噬细胞显著增加,M1巨噬细胞降低DM +实施组。胃电踱步改善Nrf2 / HO-1途径和表达下调的磷酸化NF -κDM组,malonaldehyde和活性氧水平升高,超氧化物歧化酶降低,而胃电踱步malonaldehyde和活性氧的水平降低,提高超氧化物歧化酶。结论。胃电踱步减少卡哈尔间质细胞的凋亡虽然促进M2巨噬细胞极化发挥在糖尿病大鼠抗氧化应激作用,同事的激活Nrf2 / HO-1通路和NF -的磷酸化κB通路。

1。介绍

几个世纪以来,胃肠蠕动障碍,最常发生的疾病之一,一直困惑人们的生活与几十年的糖尿病(1]。胃轻瘫,即胃排空延迟,是一个障碍,减慢或减少了食物从胃小肠没有机械阻塞。然而,有效治疗胃轻瘫仍难以捉摸的有限的角色和副作用。幸运的是,造成治疗,如电针刺激(EA)和胃电刺激(GES),正逐渐受到重视,因为它没有副作用明显功效。特别是,长脉冲充电器,因为它诱发胃电慢波也称为节奏(GEP),直接影响胃蠕动。目前,全球创业发展作为胃轻瘫的另类疗法,但其疗效机制仍不清楚。

卡哈尔间质细胞(可以作为心脏起搏器和自发产生慢波的腹部。缺陷发现的可以一直在人类和动物模型与糖尿病性胃轻瘫(2,3]。我们有报道说,长脉冲充电器可以修复受伤可以部分通过igf - 1信号通路和增强扩散可以(4,5]。然而,细胞凋亡可以也在胃胃轻瘫的证书6];实施的效果和机制在细胞凋亡可以需要进一步澄清。

M1巨噬细胞巨噬细胞有两个不同的表型:促炎和抗炎M2巨噬细胞。它们可以相互转化为在一个特定的内部环境。研究表明,胃肠蠕动障碍并不发生在糖尿病小鼠巨噬细胞的缺失,这表明巨噬细胞可能参与胃轻瘫的发展(7]。也报道,M2巨噬细胞的表型分化可能改善胃排空延迟8]。进一步的研究表明,没有明显的总数变化巨噬细胞在动物模型和患者的糖尿病胃轻瘫,当CD206 + M2巨噬细胞选择性下降,伴随着ICC删除,导致胃排空延迟(9- - - - - -11]。因此,创业计划可能促进M2巨噬细胞的表型分化改善ICC表达式和胃排空。

血红素oxygenase-1 (HO-1)是一种广泛存在的抗氧化剂防御酶,不表达或低表达在正常组织,但在压力调节发挥抗炎,抗氧化,抗凋亡作用。在胃肠道,HO-1所表达的主要是生产和居民M2巨噬细胞(12]。最近,在糖尿病胃轻瘫的研究模型中,已经发现的差别,对这些HO-1无法抵抗氧化应激损伤,从而导致的破坏可以网络和胃排空延迟,但upregulation HO-1可以修复损伤可以和改善胃排空延迟13,14]。同样,田LG等人报道,糖尿病胃轻瘫的表达式在胃窦HO-1老鼠明显减少,和EA可以改善HO-1和胃蠕动的表达15]。因此,我们推测,创业计划可能发挥关键作用在改善胃蠕动障碍通过上调HO-1修复ICC受伤。

此外,研究表明,HO-1可以保护和反向氧化应激损害可以(13]。干细胞因子(也称为自洽场,c - kit配体)是至关重要的生存和维护可以,但很少有报道关于HO-1之间的相关性和自洽场。最近的研究(16表明NF -κB信号通路激活在糖尿病胃肠蠕动障碍和自洽场/ c - kit的减少表现原因ICC细胞凋亡的增加,表明NF -的激活κB信号可能ICC细胞凋亡的一个重要因素。也报道称,核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)防御炎症中扮演着一个关键的角色在不同的组织通过激活的二期酶HO-1和抑制NF -κB信号通路(17]。其他的研究(18)表明,HO-1可以抑制NF -的磷酸化κB p65,促进抗凋亡基因的绑定NF -κB,促进基因转录发挥抗凋亡作用。此外,在人类肺成纤维细胞的研究表明核转录因子NF -κB结合现金流量表自洽场基因的增强子和促进转录(19]。我们假设HO-1发挥抗凋亡作用可能通过抑制NF -的磷酸化κB p65。

在这项研究中,我们旨在探索《刑事法庭细胞凋亡和全球经济展望》的影响表型的两极分化的巨噬细胞,探讨改造刑事法庭在糖尿病大鼠损伤的可能机制。

2。材料和方法

2.1。动物

男性Sprague-Dawley老鼠(重160 - 200克, )从济南Pengyue购买实验动物育种有限公司(山东、中国),并保存在合适的实验室条件下(22日至23日°C, h光暗周期12/12)提供食物和水吗随意。后,实现了实验过程的伦理指导方针从动物保健和使用委员会滨州医科大学医院实验动物伦理委员会。老鼠被随机分为正常控制,糖尿病(DM)、糖尿病+假GEP (DM + SGEP),和糖尿病+ GEP (DM + GEP)组(图1)。

2.2。外科手术

快速一夜后,老鼠与戊巴比妥钠麻醉(37.5毫克/公斤,ip)。植入刺激电极,一个2厘米的下腹正中切口和胃是形象化。一对电极是嵌入2厘米以上幽门浆膜的曲率越大。电极导线的两端插入穿过腹壁,隧道皮下注射的脖子,仔细和固定。在刺激中,电线被连接到一个程序电刺激器(YC-2、成都仪器厂、中国)。

2.3。糖尿病模型

手术后2周的康复,糖尿病模型建立了用链脲霉素(STZ 60毫克/公斤,ip,亚历克西斯生化,美国)。对照组动物被给予相同体积的溶剂。一周后,尾静脉测量血糖和糖尿病是确认两次血 更易与L。

2.4。试验协议

根据我们之前的研究中使用的参数都是有效的刑事法院变更(4,5DM + GEP集团]进一步分为三个子组(每个 ):DM + GEP1马(5.5 cpm 100 ms, 4), DM + GEP2马(5.5 cpm 300 ms, 4),和DM + GEP3马(5.5 cpm 550 ms, 4)。DM + GEP组大鼠胃电刺激治疗30分钟每天从9:00点,当老鼠在DM + SGEP组接受虚假的胃电刺激(刺激电极连接到没有电流刺激器)。为了避免压力的影响,老鼠放在一个安静和黑暗的地方刺激。刺激一段6周后,所有老鼠都牺牲获得胃窦组织免疫印迹和免疫染色。

2.5。疣状

整个染色山是用来测试可以的细胞凋亡。组织被正常兔血清,然后主要抗体C - kit(表达载体1:100年,美国)在4°C。的细胞凋亡可以与TUNEL试剂盒检测( ,罗氏公司、德国)1 h。与荧光标记二次孵化后抗体,DAPI用于标签细胞核。然后,凋亡可以将荧光显微镜下观察。

部分染色,胃窦在4%多聚甲醛固定的组织24 h和嵌入到石蜡块和6片μm。部分逐渐deparaffinized在二甲苯和水分梯度乙醇的解决方案。抑制内源性过氧化物酶活动后通过添加0.3%的过氧化氢,部分是微波(750 W)暴露抗原。通过非特异性反应被正常兔血清,NF -主要抗体κProteintech B(1: 100年,美国),CD68 (Abcam 1: 100年,美国),CD86(罗福斯1:100年,美国),CD206 (Proteintech 1: 100年,美国),和HO-1 (Proteintech 1: 100年,美国)被添加到显示不同的蛋白质。

与辣根peroxidase-linked孵化链霉亲和素标记二次抗体室温1 h,部分被用来测试NF -的表达κB免疫组织化学技术。然后一个新的3 3 - - - - - -diaminobenzidine解决方案是用来反映了积极的蛋白质。复染色和脱水后,玻璃盖安装到幻灯片。

测试CD68免疫反应性,CD86、CD206 HO-1,使二次抗体被用于在室温下1 h。DAPI被添加到细胞核染色。部分都是密封的antifluorescence猝灭剂和荧光显微镜下观察。

2.6。免疫印迹

用来进行远端胃样品被磨成细胞悬液在冰上使用均质器和均质里帕缓冲区中蛋白酶抑制剂。在12000转离心5分钟后在4°C,上层清液作为总蛋白。加载缓冲区之前与蛋白质比例混合十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。总蛋白10% sds - page分离,然后转移到PVDF膜。根据分子量,这些膜与初级孵化抗体c - kit(美国表达载体1:200),自洽场(1:1000年,研发系统、美国),NF -κProteintech B(1: 2000年,美国),p-NF -κ中科B(1: 1000年,德国)、IKK (Proteintech 1: 600年,美国),HO-1 (Proteintech 1: 1000年,美国),Nrf2 (Proteintech 1: 5000年,美国),和GAPDH (Beyotime 1: 1000年,中国)一夜之间在4°C。然后,增加了二次抗体为2 h 37°C。信号检测是使用一个可视化增强化学发光代理,污点是现在和检测到放射自显影法。

2.7。测量Malonaldehyde (MDA)活动

氧化应激的标记,MDA是由硫代巴比土酸方法后,装备指令(南京建成生物工程研究所、中国)。简单,组织均质在Tris-HCl缓冲的比率1:10在冰浴条件下(毫克/毫升)。离心后的上层清液被送往被测量在2500转10分钟。2.5毫升硫代巴比土酸添加到上层清液,然后,解决方案是在95°C的环境了40分钟。之后,样本冷却用流动水和在4000转离心10分钟。MDA浓度(nmol / g)测量spectrophotometrically 532海里。

2.8。测定超氧化物歧化酶(SOD)活性

SOD是一个关键酶超氧化物自由基的歧化作用,提供细胞防御活性氧。SOD活性最终决定使用测定试剂盒(南京建成生物工程研究所、中国)。远端胃样本均质Tris-HCl缓冲区在冰浴条件下(1:10)然后在2500转离心10分钟。上层清液的收集和混合解决方案工作,酝酿在37°C为20分钟。的吸光度由enzyme-labeled仪器在450海里。抑制水平的测量,SOD水平U / g因此确定。

2.9。检测活性氧(ROS)

ROS水平,许多活性分子和自由基分子氧,与oxidant-sensitive探测器检测到标签2,7-dichlorofluorescein二乙酸(DCF-DA)根据指令的活性氧测定工具包(Beyotime,中国)。在1500 rpm新鲜组织是均质和离心机后5分钟在4°C, ROS的收集上清液测定。简单,细胞被孵化DCFH-DA最终浓度为10μ米20分钟37°C。取消免费DCFH-DA之后,立即ROS水平进行了分析与流式细胞仪(美国贝克曼库尔特CytoFLEX)。

2.10。统计分析

所有的值被表示为 ,并采用单向方差分析分析多个组之间的差异。 采用统计上的显著差异。统计分析都是通过使用SPSS 24.0 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。实施对细胞凋亡的影响可以和自洽场/ c - kit途径

可以在每个组的细胞凋亡图所示2。在对照组,很多可以用几个TUNEL +细胞腔中观察到。然而,很多TUNEL +细胞被认为在DM组,显著降低c - kit +细胞。之间没有显著差异的凋亡可以DM + SGEP组和糖尿病组。从图1的可以,我们可以看到很多稀有TUNEL +细胞分布于胃腔的DM +实施组。

图3展示了c - kit和自洽场蛋白质的表达。DM组,c - kit表达与对照组相比显著降低( )。c - kit DM + SGEP组的表达没有明显改变相比,DM组( )。然而,c - kit表达显著提高DM + GEP组较糖尿病组( , ,和 ,分别)。SCF蛋白的表达,它显然是降低DM组与对照组相比 )。没有显著差异DM + SGEP组相比,DM组( )。然而,自洽场表达明显增加DM + GEP组较糖尿病组( , ,和 ,分别)。

3.2。实施对巨噬细胞的影响

我们用免疫荧光技术显示巨噬细胞(图4)。在图4(一),它表明,巨噬细胞标记和CD68位于黏膜下层,肠肌,肌肉层。CD68 +细胞的表达几乎是相同的在每一个分组中。

M1巨噬细胞被CD86标志(图4 (b))。几乎没有M1巨噬细胞分布在黏膜下层,对照组肠肌层和肌层。DM组,很多CD86 +细胞中观察到胃。与此同时,这种情况下仍然可以看到DM + SGEP组。因此,只有极少数CD86-positive细胞可以发现DM +实施组。

Co-expression CD206和HO-1展出M2巨噬细胞在胃墙(图4 (c))。有一个丰富的CD206 + / HO-1 +细胞对照组。不少CD206-positive HO-1-positive细胞中观察到DM和DM + SGEP组,但数量急剧增加的CD206 + / HO-1 +细胞被显示在DM +实施组。

3.3。GEP Nrf2 / HO-1通路的影响

如图5DM组,Nrf2蛋白的表达明显减少的价格相比对照组( ),但是HO-1没有改变( )。与DM组相比,无显著差异表达的Nrf2 HO-1蛋白质可以发现DM + SGEP集团( , )。然而,他们极大地提高了DM +实施组与DM组(Nrf2: , ,和 ;HO-1:所有 )。

3.4。《磷酸化的NF -全球经济展望》的影响κB

免疫组织化学技术是用来评估NF -κB表达(图6(一))。有一个NF -的一部分κB +核在每一层的对照组。DM和DM + SGEP组,很多NF -κB +细胞核和细胞质被证明在胃里。然而,NF -的表达κB +核DM + GEP2和DM + GEP3组显著减少的价格相比DM组。

进一步揭示NF的磷酸化κB,应用免疫印迹分析检测NF -κB, p-NF -κB, IKK表达式在胃里墙(图6 (b))。与对照组相比,NF -的表达κB显然是调节DM组( )。没有明显差异表达的NF -κB在DM, DM + SGEP, DM + GEP1组( ,0.180)。DM组相比,蛋白表达水平的NF -κB在DM + GEP2和DM + GEP3组明显减少( 和 )。

P-NF -κB (p-p65)的磷酸化形式NF -κB (p65)。尽管p-NF——的表达κDM组(B蛋白增加 )和DM + SGEP集团( ),他们仍然没有意义与对照组相比。与DM组相比,p-NF -κB蛋白表达有显著差异DM + GEP集团( ,0.001和0.000)。

NF -κB激活依赖于我κB激酶(IKK)复杂。DM组IKK的表达与对照组相比显著下调( )。然而,DM组之间没有显著差异和DM + SGEP集团( )。很大程度上,当与DM组相比,IKK表达明显调节在DM + GEP组( ,< 0.001,< 0.001)。

3.5。EA对MDA水平的影响,SOD和活性氧

MDA和SOD之后发现制造商的指令(数字7(一)和7 (b))。与对照组相比,糖尿病组MDA水平明显升高( )。没有显著区别DM组和DM + SGEP集团( )。然而,MDA水平显著降低DM + GEP组(所有 )相比之下,DM组。

胃组织中的SOD水平明显降低DM组与对照组相比 )。没有发现明显的差异之间的DM组和DM + SGEP集团( )。然而,SOD水平显然是调节DM + GEP组相比,DM组(所有 )。

在胃窦细胞ROS的变化检测到DCFH-DA荧光探针(图7 (c))。与对照组相比,ROS DM组的表达明显增加,DCF的荧光信号明显增强,活性氧的主要峰值转移到右侧的基线。相同的DM + SGEP组。DM +创业计划组织的荧光信号强度逐渐减弱,ROS的主峰转移到左边的基线。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,可以通过改善的实施可以降低细胞凋亡M2巨噬细胞的表型分化,这促进了Nrf2 / HO-1通路的激活和改善NF -的磷酸化κb .创业计划是由频率决定的影响不是电刺激的脉冲宽度。这些潜在机制表明,创业计划可以减少氧化应激,从而展示可以保护作用。

先前的研究已经表明,损失和伤害可以被验证在糖尿病胃轻瘫2,3,20.- - - - - -22]。进一步研究报告称凋亡ICC在正常人类结肠癌是一个持续的过程,凋亡ICC的数量可能被发现23]。自洽场/ c - kit途径是国际刑事法庭的基本保证维持量。我们之前有报道,细胞凋亡可以可以观察到在糖尿病大鼠的胃和结肠,表达下调与自洽场/ c - kit途径[6,24,25]。王等人发现同步dual-pulse GES可以减少肠神经元的凋亡vagotomized老鼠(26]。的生存可以可以获救的长脉冲电气根据我们之前的工作4,5]。在目前的研究中,我们可以记录细胞凋亡的胃胃轻瘫的免疫荧光技术和实施干预可以减少凋亡的数量可以调节自洽场/ c - kit途径。它暗示GEP可以发挥了抗凋亡作用,进一步改善胃蠕动。

据我们所知,巨噬细胞在胃中发挥重要作用的能动性。Cipriani等人发现糖尿病Csf1^{op / op}缺乏小鼠巨噬细胞是防止胃排空延迟的发展(7]。一项研究还显示,胃排空延迟可以改善通过表型M2巨噬细胞的极化8]。蔡等人发现CD206-positive M2巨噬细胞,表达HO-1防止糖尿病胃轻瘫在老鼠9]。此外,伯纳德等人说明低CD206-positive细胞的数量与损失有关的刑事法庭在胃体的糖尿病胃轻瘫患者10]。激活的巨噬细胞与高水平的HO-1表达式防止胃排空延迟发展糖尿病动物模型,同时激活的巨噬细胞不表达HO-1与神经肌肉细胞损伤(11]。在我们的研究中,我们观察到不同亚型的巨噬细胞,发现GEP M2巨噬细胞的数量增加和M1巨噬细胞的数量减少,而巨噬细胞的总数。这个结果显示,实施提升M2巨噬细胞的表型分化。

氧化应激在糖尿病并发症的发展中起着举足轻重的作用,和抗氧化剂治疗可能是一种很有潜力的治疗过程27,28]。Nrf2 / HO-1信号通路的激活导致氧化应激的保护作用DNA损伤和细胞凋亡29日]。作为主要保护机制与氧化应激,HO-1已经找到可以保护和预防胃轻瘫。蔡等人报道,HO-1没有移植的糖尿病小鼠胃排空延迟和丢失HO-1 upregulation增加活性氧的水平。诱导HO-1保护可以从氧化应激和逆转糖尿病胃轻瘫在点头的老鼠13]。糖尿病大鼠体外实验模型,受损HO-1诱导的胃腔诱导破坏国际刑事法庭的网络;因此,调节HO-1表达式可以显著恢复以前减少ICC在胃腔14]。虽然据报道,EA可以改善糖尿病胃轻瘫大鼠(HO-1的表达15),《被调查这两个全球经济展望》的影响的干预措施有不同的机制。我们澄清不同的脉冲宽度与频率GEP可以促进Nrf2 / HO-1信号通路的表达,表明可能的机制,实施恢复ICC糖尿病胃轻瘫大鼠。

NF -κB信号通路被认为是反和prooxidant角色设置的氧化应激(30.]。NF -κ糖尿病胃轻瘫B通路被激活,产生氧化应激,导致自洽场/ c - kit的减少表现和ICC细胞凋亡的增加(17]。同时,HO-1可以抑制NF -的磷酸化κB p65,促进抗凋亡基因的绑定NF -κB,促进基因转录发挥抗凋亡作用[19]。我们的研究结果表明,NF -的表达κB和磷酸化NF -κ在糖尿病大鼠B p65增加,IKK的表达(NF -中央监管机构κB激活)下降。然而,实施可以显著抑制NF -的磷酸化κB p65,表明HO-1发挥抗凋亡作用可能通过抑制NF -的磷酸化κB p65。

氧化应激,失衡的生产活性氧(ROS)和抗氧化防御系统,被认为是严重的生产组织损伤在糖尿病31日]。MDA已经作为一种间接氧化应激的标记(32]。在我们的实验中,MDA在糖尿病大鼠明显增加,这与之前报道的发现是一致的(15,实施可以降低MDA的水平。主要的抗氧化酶SOD,超氧化物自由基的破坏作用和块免费radical-induced损伤(33]。糖尿病大鼠SOD活性明显降低,而实施可以提高SOD的活性。目前的研究表明,创业计划可以改善ROS的平衡生产和抗氧化防御系统。活性氧自由基的不稳定分子,包含了氧气,可能造成损伤和细胞死亡(34]。先前的研究表明,氧化应激导致高血糖通过丰富的ROS生成,导致糖尿病并发症(35,36]。在附加中,我们发现了ROS通过流式细胞术和发现实施可以降低ROS的表达,表明细胞凋亡可以降低了创业计划的基础上降低ROS。这一点正好与前面的研究(37]。

5。结论

细胞凋亡与干扰可以被验证在糖尿病大鼠体内的氧化应激,是与M2巨噬细胞数量的减少和表达下调Nrf2 / HO-1通路。的进步促进了NF -激活κB通路产生刑事法庭细胞凋亡。然而,实施不同的脉冲宽度但同样的频率可以减少细胞凋亡可以通过抗氧化压力,促进M2巨噬细胞表型分化影响糖尿病老鼠,也优化Nrf2 / HO-1和NF -κB通路。这些结果表明,实施针对抗氧化应激的保护作用可能是一种潜在的治疗糖尿病蠕动障碍的策略。

缩写

创业计划:	胃电踱来踱去
可以:	卡哈尔间质细胞的
HO-1:	血红素oxygenase-1
DM组:	糖尿病组
DM + SGEP组:	糖尿病与虚假的GEP集团
DM + GEP1组:	糖尿病与GEP1集团
DM + GEP2组:	糖尿病与GEP2集团
DM + GEP3组:	糖尿病与GEP3集团
EA:	电针刺激
电气:	胃电刺激
自洽场:	干细胞因子
Nrf2:	核转录因子2红细胞两个相关因素
MDA:	Malonaldehyde
ROS:	活性氧
SOD:	超氧化物歧化酶。

数据可用性

用来支持研究的数据可用。

伦理批准

所有动物保健和使用符合道德准则的动物保健和使用委员会。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

HC W,残雪L, YC的构思和设计研究。HC W、Z KL和YB进行实验。HC W和YC收集和分析数据。TG、NS和QN解释数据。YC起草了手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Hongcai小王和赵恺乐了同样的工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81700472),医疗卫生山东省科技发展计划(2016号ws0021)和研究计划和研究滨州医科大学(没有启动资金。BY2015KYQD30)。