文摘

Discoidin domain-containing受体2 (DDR2)建议参与动脉粥样硬化的进展,但其病理作用仍然是未知的。使用免疫化学染色,我们定位和比较DDR2的表达在动脉粥样硬化斑块的人类和多种动物模型。然后,核应用于击倒DDR2的表达在血管平滑肌细胞(VSMCs)和迁移,增殖和胶原蛋白Ι全身的表达基质金属蛋白酶(MMPs)进行评估。我们发现大量的DDR2出现在人类动脉粥样硬化斑块和各种动物模型和分布在脂肪和坏死核心。孵化后氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) DDR2在VSMCs调节反应这样一个proatherosclerotic条件。接下来,我们发现,减少DDR2表达VSMCs抑制迁移,增殖和胶原蛋白Ι全身的表达基质金属蛋白酶(MMPs)。此外,我们发现DDR2密切相关的蛋白表达和活动MMP-2,表明DDR2可能发挥作用在不稳定斑块的病因。考虑到DDR2存在于人类的动脉粥样硬化斑块中,与胶原蛋白有关Ι全身MMP-2分泌,DDR2在心血管疾病的临床作用应该阐明在进一步的实验。

1。介绍

心血管疾病(CVD)是世界上导致死亡的主要原因。动脉粥样硬化被称为心血管疾病的共同病理基础(1]。动脉粥样硬化斑块破裂主要引起临床事件,如心肌梗塞,中风和血栓形成。在先前的研究中,研究人员表明,巨噬细胞和血管平滑肌细胞的平衡(VSMCs)动脉硬化斑块的稳定性是一个关键因素。简单地说,由于巨噬细胞增殖在斑块,这些炎症细胞释放许多基质金属蛋白酶(MMPs)有效地降解细胞外基质(ECM),如胶原蛋白和弹性蛋白,导致斑块不稳定或破裂;相反,VSMCs合成ECM保持稳定斑块(2]。尽管VSMCs有助于稳定斑块,这些细胞也可能通过分泌基质金属蛋白酶在表型转变促进斑块破裂的VSMCs收缩到合成状态(3]。然而,尚不清楚是什么原因导致VSMCs诱导基质金属蛋白酶的生产,而不是ECM合成。值得注意的是,ECM是胶原蛋白的主要成分,占大约60%的总蛋白在动脉粥样硬化斑块4]。这些胶原蛋白不仅构成动脉粥样硬化斑块,也影响细胞增殖,迁移,并通过胶原粘附受体(4]。在这些胶原蛋白受体,Discoidin domain-containing受体2 (DDR2)被认为是子群的酪氨酸-受体,激活的天然配体包括胶原类型,II, III, X和负责沟通和胶原蛋白和细胞之间的联系(5]。DDR2存在于各种组织,包括维管组织,参与调节细胞新陈代谢,分化,和增长。有趣的是,激活DDR2可以诱导基质金属蛋白酶的生产,因此,DDR2被公认为扮演非常重要的角色在纤维化和癌症6]。考虑到DDR2 VSMCs中发现,是一个有趣的问题出现了DDR2是否也影响斑块稳定性通过调节MMP的表达在VSMCs [7,8]。因此,我们设计了本研究来阐明DDR2在动脉粥样硬化的病理作用。

2。材料和方法

2.1。动脉粥样硬化标本和组织学染色

日本白兔被那些高胆固醇饮食含0.3%胆固醇和3%的玉米油6或16周诱导动脉粥样硬化( ,分别),然后,兔子被使用安乐死戊巴比妥钠在每个时间点。每只兔子的主动脉弓切成10横截面(4μ米)(9]。男性ApoE- / -老鼠被颈椎脱位安乐死。段的心脏组织男性ApoE升主动脉和主动脉窦- / -老鼠( )被嵌入到10月,串行部分(8μ米厚)是如前所述10]。苏木精和伊红()),油红O,马森的三色的污渍进行根据协议如前所述[11,12]。此外,部分进行免疫组织化学染色对DDR2鼠标(1:200;Abcam,剑桥,英国;春秋国旅,贝弗利,妈,美国)人类和兔(1:200;圣克鲁斯生物技术公司、达拉斯、TX,美国),RAM11巨噬细胞(1:200;美国CA Dako),α肌动蛋白的SMC (1: 200;美国热费希尔科学、CA)如前所述11]。

人类颈动脉斑块则来自于病人的动脉内膜切除术在郑州中心医院。知情同意是获得所有的病人登记在这项研究中,所有实验实现按照设定的准则和法规西安医科大学的伦理委员会(允许没有。xyjzs - 201609027 - 1)。日本白兔,SD大鼠,载脂蛋白e- / -老鼠购买从西安交通大学实验动物中心(西安,中国)。所有动物实验动物设施的基础和转化医学研究所西安医科大学。动物实验是严格遵守动物实验的指导在西安医科大学,改编自护理的指导和使用实验动物(NIH;美国马里兰州贝塞斯达;NIH出版85号- 23,2011年修订)。西安医科大学实验动物管理委员会批准所有动物实验(机构动物保健和使用委员会;允许没有。xyjzs - 201608012 - 2)。

2.2。VSMC文化

VSMCs得到雄性SD大鼠的主动脉(200 - 300 g)如前所述13]。细胞实验从段落中使用3 - 6所示。在每个实验的开始之前,一个额外的孵化24小时的无血清DMEM呈现细胞静止。然后,细胞暴露于氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) (0、25、50、100 mg / L;Yiyuan生物技术、广州、中国)24 h模拟proatherosclerotic条件。激活DDR2,细胞与胶原蛋白孵化Ι(Sigma-Aldrich) 48 h。研究抑制信号通路、细胞抑制剂治疗,疗程30分钟。SP600125 (20μmol / L;Calbiochem)是一种抑制剂对物(c-Jun n端激酶),和SB203580 (10μmol / L;p38 MAPK Calbiochem)是一种抑制剂(增殖蛋白激酶),和PD98059 (20μmol / L;Calbiochem)是一种对MEK抑制剂(MAPK / ERK激酶(extracellular-signal-regulated激酶))。剂量的抑制剂是由以前的研究[引用14,15]。然后,细胞暴露于ox-LDL (100 mg / L)。

2.3。siRNA干扰

小核RNA)被用来推倒DDR2表达VSMCs如前所述[16]。小干扰rna序列引用之前的一项研究中,由商业公司(链,合成5 - - - - - -GAUGAUAGCAACACUCGGAUU-3 ;反义链,5 - - - - - -UCCGAGUGUUGCUAUCAUCUU-3 ;RiboBio,广州,中国)17]。siN05815122147 (RiboBio、广州、中国)作为一个普遍的消极的控制。转染了小干扰rna转染试剂与X-tremeGENE(罗氏)和给予制造商的指示。简而言之,这些细胞被漂洗两次磷酸盐(PBS)减少背景干扰。ng DDR2核与不同剂量(400年和800年;大约40 - 80 pmol)转染到VSMCs 6 h,然后是处理ox-LDL (100 mg / L)。收集细胞检查DDR2表达式或执行的迁移和扩散试验。

2.4。迁移和扩散分析

VSMCs的迁移是评估使用transwell渗透支持插入(美国康宁,洛厄尔,MA)如前所述[18]。孵化后的siRNA 24小时没有的边后卫,VSMCs被播种在基底膜基质(5毫克/毫升;BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)上层舱,DMEM补充加入一定量的边后卫低舱为10%。细胞培养另一个24小时,然后被结晶紫染色。五个不同的大功率领域每拍摄。积极的彩色VSMCs被观察者数盲治疗协议。

扩散VSMCs愈合试验评估了如前所述[19]。简单地说,小干扰rna治疗24小时后,10升液管的小费用于废人造伤口在单层在盘子的底部。广泛的洗涤后,包含10%的边后卫被媒介,细胞开始迁移中适当的时候37°C孵化室有限公司为5%2。在不同的时间点,获得图像尼康TE2000倒置显微镜。与此同时,一些代表菜是由免疫荧光α肌动蛋白的SMC (1: 200;美国热费希尔科学、CA) Alexa萤石488 (1:200;热费希尔科学、钙、美国)。剩下的开放区域的伤口被使用量化ImageJ如前所述,与一些修改(20.]。

2.5。RNA提取和实时PCR

从主动脉和VSMCs总RNA提取。如前所述(执行实时聚合酶链反应21,22]。引物的序列表中列出1。

表1
实时PCR引物被用于。
2.6。蛋白分离和免疫印迹分析

总蛋白提取主动脉的兔子和VSMCs如前所述[22]。主要的抗体对兔子的DDR2 (1: 500;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)的老鼠的DDR2 (1: 500;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA;春秋国旅,贝弗利,妈,美国),MMP-2 (1: 500;Abcam、剑桥、马),TIMP-1 (1: 500;Abcam、剑桥、马),TIMP-2 (1: 500;Abcam、剑桥、马),p-ERK1/2 (1: 1000;春秋国旅,贝弗利,妈,美国),GAPDH (1: 1000;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。 Western blotting analysis was applied as previously described, and relative protein expression was measured by ImageJ with gel analysis [22]。

2.7。Zymography

上层清液和血清总蛋白提取培养VSMCs。nonreducing条件下,等量的样品蛋白质sds - page分析的gelatin-containing丙烯酰胺凝胶(2毫克/毫升聚丙烯酰胺凝胶和7.5%)如前所述[23]。

2.8。统计分析

所有数据都表示为 。两组比较被学生的使用 - - - - - -测试。多个组的比较与Bonferroni用单向方差分析进行测试。 被认为是具有统计学意义。通过使用SPSS 19.0软件进行统计计算(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。

3所示。结果

3.1。ddr存在在人类动脉粥样硬化病变

检查DDR2是否出现在动脉粥样硬化病变,我们使用从人体组织的免疫组织化学染色法鉴别DDR2各种动物物种。有趣的是,我们发现DDR2的表达在人类的颈动脉粥样硬化斑块(图1)。结合MST的部分,我们发现DDR2分布密集的脂肪核人类颈动脉粥样硬化斑块,这些积极的污渍也相邻纤维帽和中间膜(图1)。


图1
DDR2人类颈动脉粥样硬化斑块。苏木精和伊红(圆);10倍);马森的三色的染色(MTS;10倍);免疫组织化学染色对DDR2(10倍);兔免疫球蛋白同形像控制(10倍)。盒子里的区域显示为大功率领域(b) (40 x)。NC:坏死核心;FC:脂肪的核心; F: fibrous cap; M: middle membrane.
3.2。ddr存在动脉粥样硬化病变的动物模型

通过使用一个兔模型,我们试图调查DDR2表达和动脉粥样硬化进展之间的关系。我们发现DDR2提出和中等动脉粥样硬化早期病变的兔子,这个受体是位于一个类似的位置(图2(一个))。的早期病变,多数的DDR2低沉积在病变(图的边缘2(一个))。在中间阶段病变,DDR2是广泛地分布在损伤和沉积表面的病变(图2(一个))。DDR2显然重叠与巨噬细胞的细胞质和与VSMCs完全重叠(图2(一个))。比较的MTS和DDR2染色,表明DDR2表达和分布可能倾向于本地化周围胶原纤维(图2(一个))。为了进一步证实上述结果,我们还利用免疫组织化学染色法确定DDR2 ApoE的动脉粥样硬化病变- / -老鼠(图2 (b))。如图2 (b)所示,DDR2还发现在小鼠动脉粥样硬化病变。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
动脉粥样硬化斑块的DDR2动物模型。比较DDR2表达式和胶原蛋白HCD-induced兔动脉粥样硬化斑块的分布模型(a)。主动脉病变的连续石蜡切片染色与马森的三色的染色和免疫组织化学染色(MTS)α光滑的肌肉肌动蛋白(SMC)、巨噬细胞(Mϕ)和DDR2 (a) ( μ米)。动脉粥样硬化斑块的载脂蛋白e基因敲除小鼠模型和免疫组织化学染色对DDR2 (b) ( μ米)。该地区在框显示为大功率领域(右边 μ米)。
3.3。ox-LDL上调DDR2 VSMCs通过MAPK通路

考虑到DDR2在动脉粥样硬化病变,丰富我们的质疑DDR2表达式与动脉粥样硬化的发展。比较DDR2的蛋白表达,我们发现没有显著区别早期和中期病变(图3(一个))。接下来,我们还质疑什么导致了upregulation DDR2的动脉粥样硬化病变。考虑ox-LDL关键硬化的因素,我们培养各种浓度的ox-LDL VSMCs 48 h。我们发现100毫克/毫升的ox-LDL显著增加DDR2表达式在VSMCs(图3 (b))。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
图3
蛋白表达的DDR2主动脉和VSMCs。免疫印迹分析和量化的DDR2 HCD-induced动脉粥样硬化兔主动脉((一个); )和VSMCs孵化与不同浓度的0、25、50、100 mg / L ox-LDL (b),数据表示为 。 和 与0 mg组;# # 100毫克和25 mg组。MAPK抑制剂对ox-LDL-induced DDR2表达式(c)。VSMCs与抑制剂preincubated 30分钟,然后处理100 ng / mL ox-LDL 24 h的抑制剂(SP600125 SB203580, PD98059对物,MEK, p38 MAPK,分别)。数据表示为 。 和 与ox-LDL组。

接下来,我们也调查的途径可能参与ox-LDL-induced DDR2表达式。通过对MAPK通路抑制剂,我们发现阻塞物,p48,和ERK1/2 VSMCs可以中和ox-LDL-induced DDR2表达式,表明MAPK通路可能负责ox-LDL-induced upregulation DDR2(图3 (c))。

3.4。DDR2影响VSMCs的迁移

报道在此前的一项研究中,一个特定的核对抗DDR2应用于抑制DDR2蛋白表达。首先,我们使用不同剂量的siRNA VSMCs击倒DDR2表达式。我们发现800 ng的核可以有效地抑制ox-LDL-induced DDR2表达式,量化和实时PCR(图确认4(一))。接下来,测试是否抑制smc影响其迁移的DDR2的siRNA transwell试验后进行孵化VSMCs 48 h(0, 200, 400,和800 ng核,分别)。我们发现,400年和800年ng siRNA减少细胞的迁移,表明VSMCs的迁移活动的抑制了DDR2减少(图4 (b))。确认这个结果,我们也使用了伤口愈合化验检查VSMCs的迁移。如图4 (c)的显示,我们发现,减少DDR2表达式实际上抑制了VSMCs的迁移。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
图4
击倒效果的DDR2 VSMCs的迁移和扩散。的小干扰rna治疗,经过400年和800年ng的DDR2表达VSMCs被西方墨点法进行量化分析和实时PCR (a)。迁移和扩散被transwell评估分析(b)和伤口愈合试验(c),数据表示为 。 和 与RNA-treated集团的争夺。
3.5。DDR2影响VSMCs mRNA的表达基质金属蛋白酶

入侵VSMCs是由胶原酶分泌;因此,我们研究MMP的表达是否减少了DDR2不足。首先,我们孵化胶原蛋白我和VSMCs 48 h,和MMP (MMP-2、MMP-3 MMP-8, MMP-9, MMP-12, MMP-13,和MMP-14)表达式被实时PCR量化。有趣的是,我们发现,胶原蛋白可以上调MMP-2 MMP-3 MMP-9, MMP-14(图5(一个))。接下来,我们使用800 ng siRNA胶原蛋白我孵化前的击倒DDR2表达式。由于信使rna定量实时PCR,抑制DDR2逆转胶原的影响我对基质金属蛋白酶的表达,抑制MMP-2的mRNA表达,MMP-3 MMP-9, MMP-13(图5 (b))。此外,我们没有找到的mRNA表达MMP-12 VSMCS。

(一)
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(b)
(b)
图5
击倒效果DDR2 VSMCs mRNA的表达基质金属蛋白酶。胶原蛋白我诱导MMP的表达被实时PCR (a)评估。小干扰rna治疗后,胶原蛋白我诱导MMP的表达进行实时PCR (b),数据表示为 。 , ,和 与胶原蛋白我组或胶原蛋白我结合siRNA-treated组。
3.6。DDR2 VSMCs影响MMP-2的活动和表达

考虑到胶原蛋白我诱导mRNA的表达MMP-2显著抑制DDR2不足后,我们下一个检查是否抑制DDR2 MMP-2的活性的影响。由于zymography MMP-2活动增加了胶原蛋白我孵化,但减少了800 ng的siRNA DDR2表达式,而且几乎没有MMP-2活动被发现没有胶原蛋白小干扰rna干扰(图我之前孵化6(一))。然而,我们没有发现任何在同一zymography MMP-9凝胶的乐队。研究已故MMP-2活动是否归因于MMP-2蛋白质,我们下一个检查MMP-2通过免疫印迹蛋白质表达。事实上,我们发现MMP-2生产减少对DDR2表达式(图核的存在6 (b))。接下来,TIMP-1和TIMP-2被西方墨点法和量化研究,结果显示,两组之间没有显著差异(图6 (c))。进一步研究这种现象的潜在机制,我们还检查了ERK信号根据以前的报告6]。后由核的抑制DDR2磷酸化ERK1/2减少(图6 (d))。

(一)
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(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图6
击倒效果DDR2 VSMCs MMP-2的活动和表现。MMP-2的活动被zymography评估(a)。DDR2蛋白表达进行了分析和量化免疫印迹(b), TIMP-1 TIMP-2被免疫印迹检测和量化(c)。p-ERK1/2蛋白表达分析和量化了免疫印迹(d),数据表示为 。 与RNA-treated集团的争夺。

4所示。讨论

动脉粥样硬化斑块破裂是一个严重的问题对于心血管疾病患者,往往导致不稳定性心绞痛,心肌梗塞、冠心病猝死(24]。然而,如何变得脆弱的动脉粥样硬化斑块仍然未知。问题是为什么ECM往往会降低这些不稳定的斑块。值得注意的是,ECM不仅构成动脉粥样硬化斑块,也激活胶原蛋白受体调节周围的细胞(25]。胶原蛋白受体,DDR2参与纤维化疾病等各种疾病,关节炎,癌症和动脉粥样硬化(5]。

在当前的研究中,我们发现DDR2出现在各种动物模型的动脉粥样硬化斑块,但DDR2免疫反应性并没有完全与巨噬细胞和VSMCs重叠。如前所述,DDR2 VSMCs中高度表达,还发现激活内皮细胞(26]。根据我们的观察,DDR2表达式是倾向于本地化胶原蛋白和纤维帽。更重要的是,第一次,我们的报道,DDR2高度表达了人类和颈动脉粥样硬化斑块的分布在脂肪的核心动脉粥样硬化与胶原纤维和重叠。结合这些研究结果,DDR2表达特定区域的动脉粥样硬化斑块可能会以某种方式调节胶原蛋白或其他proatherosclerotic因素,和底层机制需要进一步的研究来解决。鉴于ox-LDL主要proatherosclerotic因素和丰富的脂肪的核心,一个问题出现ox-LDL能否诱导DDR2的表达。有趣的是,目前的研究证明ox-LDL能引起upregulation DDR2剂量依赖性的方式,而这种upregulation中和的抑制物,MAPK48,兵,表明MAPK途径可能参与ox-LDL-induced DDR2表达式。脉管系统,smc不仅负责分泌的胶原纤维,也表达胶原蛋白受体与ECM,调节自己的增殖,分化和迁移27]。因此,我们推测,DDR2可能影响VSMCs的生理功能,尤其是当这些细胞被proatherosclerotic刺激因素。如结果所示,VSMCs DDR2的差别,对这些显示减少分化和迁移。考虑到VSMC渗透在内膜动脉粥样化形成的重要过程,DDR2可能是中介调节动脉粥样硬化进展(3]。值得注意的是,因为这取决于基质金属蛋白酶的分泌,另一个问题也已提高了DDR2是否调节基质金属蛋白酶(28]。的确,基质金属蛋白酶几乎可以确定动脉粥样硬化斑块的命运因为MMP-mediated ECM的分解是一个典型的不稳定斑块的特征(29日]。在病理条件下,过度ECM也刺激VSMCs降解ECM负反馈调节。作为一种天然配体对ddr,胶原蛋白可以在VSMCs产生基质金属蛋白酶的激活DDR2 ECM的降解30.]。我们观察到胶原蛋白我的确促进VSMCs产生各种类型的基质金属蛋白酶,尤其是MMP-2和MMP-3。然而,胶原蛋白就可以完全中和我诱导基质金属蛋白酶的表达到DDR2击倒,这表明DDR2在ECM的降解中起着举足轻重的作用。值得注意的是,由于MMP-2表达式是显著影响DDR2的击倒,DDR2之间的因果关系和MMP-2显示在当前的研究中。基质金属蛋白酶不一定增加酶活性基质金属蛋白酶不仅因为最初合成非活动状态的发酵菌但也被特定的内源性抑制剂如金属蛋白酶(31日]。因此,只有DDR2调节基质金属蛋白酶的活性这个胶原蛋白受体可以确保参与脆弱的斑块。有趣的是,减少了DDR2确实还能抑制MMP-2的蛋白表达和活动,表明的影响通过胶原蛋白我启动DDR2 VSMCs MMP-2可能继续。机制是对前面的研究表明,胶原蛋白的我原因表达和磷酸化的DDR2最后移植MMP-2表达式通过ERK1/2信号(6,32]。因此,我们已经证实的磷酸化ERK1/2被抑制VSMCs DDR2的抑制,表明ERK1/2可能参与MMP-2表达和活动。值得注意的是,这个结果需要更多的实验证明。pro-MMP-9,此外,我们没有发现pro-MMP-2和zymography MMP-9没有排除其他基质金属蛋白酶的激活DDR2的可能的监管。

总之,我们发现DDR2的高表达在动脉粥样硬化斑块的人类和多种动物模型,并在VSMCs DDR2 MMP-2参与胶原蛋白我诱导分泌,这表明DDR2在心血管疾病的临床作用应该阐明在进一步的实验。由于proatherosclerotic条件,丰富的DDR2存在动脉粥样硬化斑块的人类和各种动物模型;而且,过度的ECM如胶原蛋白的我也可以激活DDR2生产MMP-2 ECM的降解,最终参与动脉粥样硬化不稳定斑块的行为学。一旦澄清了这个机制,DDR2可能成为一种新颖的目标发展新的治疗策略的控制不稳定的动脉粥样硬化斑块。

缩写

DDR2: Discoidin domain-containing受体2
VSMCs: 平滑肌细胞
基质金属蛋白酶: 金属蛋白酶
心血管疾病: 心血管疾病
ECM: 细胞外基质
载脂蛋白e: 载脂蛋白E
核: 小干扰RNA
MAPK: 增殖蛋白激酶
物: C-Jun n端激酶
MEK: Extracellular-signal-regulated激酶。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

我们提出了我们的数据作为预印(33]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

齐豫和Cangbao徐本研究设计的。齐豫,Ruihai Liu Ting丽安,华关进行细胞实验。齐豫,胡安·杨,圆圆崔、张Guangwei进行动物实验和组织学染色。刘富强Ruihai刘和收集临床标本。艾哈迈德Bilal Waqar图像分析和解释执行。齐豫,艾哈迈德Bilal Waqar,陈应写这手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

本研究得到了国家自然科学基金(81400328和81400328),中国陕西省创新支持计划(2020 pt - 003),和西安医科大学研究基金会(2018 xnrc02和2018 pt23)。