改善内皮功能障碍的小檗碱通过TMT-Based蛋白质组学在动脉粥样硬化小鼠和机制探索

文摘

动脉粥样硬化是一种多因子的血管疾病引发的脂质代谢紊乱,表现为慢性炎症损伤,并由内皮功能障碍。小檗碱是中药的主要活性生物碱Coptidis根茎(黄连)。值得注意的是,小檗碱已被证明对动脉粥样硬化有有利影响。然而,小檗碱在预防动脉粥样硬化的机制仍不清楚。本研究旨在调查的效果和机制在保护主动脉和小檗碱在载脂蛋白E-deficient (ApoE改善动脉粥样硬化^{- / -}老鼠)。在这里,我们表明,小檗碱降低血清脂质水平,肯定得罪了肝脂质积累,改善内膜中层增厚,减轻动脉粥样硬化病变的载脂蛋白e^{- / -}一个西式饮食的老鼠为12周。与此同时,小檗碱降低主动脉活性氧(ROS)生成和血清丙二醛(MDA)水平降低,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)和白细胞介素- 6 (il - 6)。在主动脉环试验,小檗碱恢复主动脉endothelium-dependent血管舒张体内和体外。此外,4956蛋白质被确定通过蛋白质组学分析,和199个差异表达蛋白质由小檗碱被发现参与许多生物学途径,线粒体功能障碍,如脂肪酸β氧化我和FXR / RXR激活。概要地,这些数据表明,小檗碱改善内皮功能障碍和防止动脉粥样硬化,因此可能是一种有前途的治疗动脉粥样硬化候选人。

1。介绍

动脉粥样硬化,逐渐由脂质沉积为特征的慢性炎性疾病,平滑肌细胞增殖,单核细胞浸润,钙化,斑块形成,通常发生在大中型动脉,是心血管疾病的主要原因和病理基础,这是人类死亡的主要原因,占全世界所有死亡的31.5% (1- - - - - -3]。许多影响动脉粥样硬化的风险因素,包括性别、吸烟、肥胖、糖尿病、高血压,多个风险因素相互作用导致动脉粥样硬化的发生和发展4]。虽然动脉粥样硬化的发病机制还不完全清楚,它是涉及脂质代谢紊乱,内皮功能障碍、炎症和氧化应激。内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期发展的关键一步,启动动脉粥样硬化的进展,参与了斑块的形成。此外,内皮功能的状态可以反映动脉粥样硬化发生的倾向(5,6]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是一个主要因素在动脉粥样硬化内皮功能障碍;它的格式是由增强的血脂水平和氧化应激,并沉积在血管内皮7]。炎症也参与内皮功能障碍、炎症细胞的活化和分子,包括粘附分子和趋化因子(8]。当内皮受伤时,它刺激炎症介质的表达,包括血管细胞粘附molecule-1 (VCAM-1)、细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1)、白介素6 (il - 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α),激活氧化应激和炎症反应,诱导血管平滑肌细胞增殖和泡沫细胞的形成,最终导致斑块形成和动脉粥样硬化病变(9,10]。

小檗碱、异喹啉生物碱是中药的主要有效成分Coptidis根茎(黄连),传统上被用于治疗腹泻在中国和其他亚洲国家。最近,增加体外和体内研究发现,小檗碱在心血管系统具有显著的药理作用,包括降低血清血脂水平(11),降低血糖(12),保护血管内皮细胞(13),和抗炎14和抗氧化剂15)的影响。值得注意的是,显示小檗碱对动脉粥样硬化有利影响。发现小檗碱抑制动脉粥样化形成通过激活AMPK-dependent UCP2表达(16)和稳定动脉粥样硬化斑块的通过激活半胱氨酸老鼠过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγγ)[17]。此外,小檗碱的atheroprotective活动可能与抑制巨噬细胞的胆固醇积累(18]。尽管如此,仍然有一个缺乏理解底层机制的小檗碱保护主动脉和改善动脉粥样硬化。

与质谱(MS)技术的最新进展,MS-based蛋白质组学可以快速准确地识别和量化各种样品的蛋白质组在一个实验中,被广泛用于目标识别和机械的研究(19,20.]。作为一个蛋白质组学方法,串联质量标签——(TMT)基础液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)分析可以识别和量化蛋白质同时10生物样品(21]。这种方法在定量蛋白质组学和必不可少的工具可以提供治疗机制的概述。

在这里,我们探讨小檗碱在动脉粥样硬化的保护作用和潜在机制主动脉体内和体外使用载脂蛋白E-deficient (ApoE^{- / -}老鼠)。ApoE^{- / -}老鼠是一种广泛使用的动脉粥样硬化小鼠模型22]。我们调查了脂质,主动脉组织学,内皮功能,氧化应激和炎症标记物的载脂蛋白e^{- / -}老鼠喂食高脂肪的饮食。此外,TMT-based质/ MS技术和生物信息学分析被应用于分析小檗碱如何预防动脉粥样硬化改变主动脉蛋白质组。

2。材料和方法

2.1。材料

小檗碱是从成都购买Mansite药业有限公司有限公司(A0151,成都,中国)。阿托伐他汀购买辉瑞制药有限公司(大连,中国)。西式饮食购买从北京HFK生物科学(中国,北京,许可数量:SCXK (Jing) 2014 - 0008)。异氟烷是购买的雅培公司(上海,中国)。氯化钠、氯化钾、MgSO₄h·7₂O, KH₂阿宝₄,CaCl₂,NaHCO₃,葡萄糖在本文中从天津Kemiou购买化学试剂有限公司,有限公司(天津)。乙腈是购买从默克公司(德国)。去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Ach),硝普酸钠(SNP),和甲酸从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。内皮一氧化氮合酶(以挪士)抗体(RT1203)从HuaBio购买(杭州)。CD31抗体(550274)从BD(美国)购买。内皮素1 (ET-1) (ab117757) glycerol-3-phospate脱氢酶2 (GPD2) (ab188585) paraoxonase 1 (PON1) (ab24261),载脂蛋白A我(APOA1) (ab20453)抗体购自Abcam(英国剑桥)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)抗体(CW0100A),山羊anti-mouse免疫球蛋白(CW0102)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白(CW0103)从CoWin购买生物科学(中国,北京)。胰蛋白酶是购自热费希尔科学(美国新泽西州)。

2.2。动物和治疗

雄性野生型小鼠C57BL / 6(6到8周大)和载脂蛋白e^{- / -}老鼠(6到8周大)C57BL / 6遗传背景从北京获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京),允许数字SCXK (Jing) 2016 - 0006年和SCXK (Jing) 2016 - 0011。所有的动物都被安置在标准笼子(≤5 /老鼠笼)用干净的锯末被褥specific-pathogen-free环境条件下(20 - 25°C,相对湿度40 - 60%,12 h光/暗周期),有免费的水和食物。所有程序都是严格按照实验动物保健和使用指南发布的中国科技部和实验动物伦理委员会批准天津中医药大学(批准文号:TCM-LAEC2016014)。

在适应于一个星期的住房环境,两个ApoE五十^{- / -}一个西式饮食的老鼠含有21%的脂肪和0.15%胆固醇被随机分为四组:汽车集团(ApoE^{- / -}, ),阿托伐他汀组(ATO, 2.6 mg·公斤¹, ),小檗碱78 mg·kg¹集团(bbr·kg - 78毫克¹, ),和156 mg·公斤小檗碱¹集团(bbr·kg - 156毫克¹, )。美联储野生型C57BL / 6小鼠正常食物的饮食被用作对照组(WT, )。车辆和控制老鼠用生理盐水治疗。所有的老鼠注射治疗口腔填喂法为12周。

2.3。超声分析

超声进行12周后2100年政府使用Vevo ultra-high-resolution小动物超声成像系统(VisualSonics,多伦多,加拿大)配备一个MS550D换能器工作在40 MHz。老鼠吸入异氟烷麻醉为1.5 -2.0% 100%的氧气。后头发是小心翼翼地从胸部和颈部,老鼠放在一个加热平台在仰卧位。首先,胸骨旁的烈度衰减视图来显示左心室和升主动脉,M-mode和PW多普勒模式图像。然后,扫描头搬到脖子,右侧颈总动脉在哪里使用,烈度视图可视化。在b型,右颈总动脉的超声图像。所有的电影循环和帧记录和存储数字图像分析使用离线工作站Vevo实验室2.1.0 (VisualSonics,多伦多,加拿大)。

在实验的最后,老鼠牺牲,其次是血液样本,肝脏,心脏主动脉,收藏。

2.4。机关室

的机关室实验进行了如前所述[23]。老鼠被斩首,牺牲和胸主动脉被隔离并立即沉浸在含氧冰冷的Krebs-Henseleit (k - h)解决方案(4.75 118年作文mM:氯化钠,氯化钾,MgSO₄h·7₂1.2 O, KH₂阿宝₄1.2,CaCl₂2.5,NaHCO₃25日,和葡萄糖11;pH值7.3 - -7.4)。经过仔细切除秉承血管周的组织,2 - 3毫米戒指小心翼翼地削减。主动脉环悬浮在一个器官含10毫升k - h的解决方案保持在37°C和95%都洋溢着O₂和5%的公司₂两个平行不锈钢挂钩。等长张力在实验测量和记录由计算机辅助数据采集系统(PowerLab / 4 sp;ADInstruments企业有限公司、澳大利亚)。每个环逐步延伸到基线张力为0.8 g和允许平衡实验前60分钟。平衡后,戒指最初合同60 mM氯化钾引起的收缩反应,然后,他们与k - h溶液清洗恢复紧张到基础水平的三倍。随后,NE (10⁶米)是用于订婚戒指。收缩,高原的ACh (10⁹-10年⁴米)或SNP (10⁹-10年⁵米)添加累计到器官浴诱导endothelium-dependent或endothelium-independent放松。

体外实验,年轮preincubated小檗碱(10⁷, ,10⁶米)30分钟。然后,戒指与k - h清洗解决方案,之后ACh-induced endothelium-dependent放松和SNP-induced endothelium-independent放松是分开化验。

2.5。测定血清脂质、Ox-LDL、MDA和il - 6的分泌

从血液样本血清制备。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)和游离脂肪酸(FFA)测量使用生化试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国);ox-LDL和丙二醛(MDA)和ELISA测定试剂盒(Cloud-Clone Corp .),武汉,中国);和il - 6决心ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。所有的程序都是按照制造商的指示执行。

2.6。肝组织学

拍照后,体重,一块肝脏中立的福尔马林固定在10%,剩下的部分在液态氮冷冻,保存在-80°C。肝组织浸泡在福尔马林溶液与梯度脱水乙醇和嵌入石蜡。石蜡包埋标本被切成4μ米厚的串行部分,沾haematoxylin-eosin(圆)、武汉Servicebio生物科技有限公司,有限公司,武汉,中国)按照标准协议。观察肝脏中脂质积累,被冻结的组织是嵌入在最佳切削温度复合,切成6μ米厚cryosections。部分是沾油红O (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。图像的所有部分都获得光学显微镜(Eclipse CI,尼康公司,东京,日本)。

2.7。评估主动脉动脉粥样硬化

小鼠灌注0.9%冰冷的盐水通过血液采集后左心室。包含主动脉根的心被删除,而在中性10%福尔马林固定石蜡切片或冷冻cryosectioning液氮。)、油红O和Verhoeff-Van Gieson (VVG、武汉Servicebio生物科技有限公司,有限公司,武汉,中国)染色进行。所有的图片都是用光学显微镜捕获。量化的油红O染色进行使用Image-Pro + 6.0软件(美国媒体控制论Inc .)。

2.8。免疫荧光法和TUNEL染色

评价血管内皮功能,以挪士和ET-1主动脉根的表达是由免疫荧光染色。CD31和终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)双重免疫荧光染色法进行测量内皮细胞凋亡。主动脉窦的cryosections permeabilized 0.2 -0.5% Triton x - 100 10分钟。主要的抗体anti-eNOS, anti-ET-1, anti-CD31稀释(1:200)和孵化一夜之间在4°C部分。在PBS(洗涤后 ),与二次孵化的部分抗体(驴anti-rat免疫球蛋白(ab150154 Abcam)和驴anti-rabbit免疫球蛋白(ab150073 Abcam,剑桥,英国),1:200稀释)在室温下1 h。此后,TUNEL costaining执行使用一个原位细胞死亡检测设备(11684795910,罗氏,德国)按照制造商的协议双荧光染色,和细胞核复染色与4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国H1200,向量实验室,CA)的所有部分。荧光显微镜下荧光染色是可视化(DFC500徕卡,位于德国)。

2.9。检测主动脉ROS生产

冰冻的横截面的主动脉根孵化了10μM dihydroethidium(她)(S0063 Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)在一个黑暗的调湿室在37°C为30分钟。原位活性氧(ROS)生成标签与红色荧光可视化,并使用荧光显微镜拍照。

2.10。TMT-Based蛋白质组学分析

2.10.1。蛋白质制备和TMT标签

主动脉组织细胞溶解在120年代在70 Hz裂解缓冲。细胞溶解组织样本离心机,上层的收集。蛋白质浓度是量化使用布拉德福德的方法(24]。量化后,从每个样本中提取的蛋白质被消化为0.5μg·μl¹胰蛋白酶溶液(美国新泽西热费希尔科学)。然后,TMT标签进行10-plex TMT工具包(美国新泽西热费希尔科学)。每组肽与不同的TMT标签:标签三个生物学重复的野生型小鼠组标签TMT - 127 n, TMT - 127 c和TMT - 128 n;ApoE的三个生物学重复^{- / -}组标签tmt - 128 c, tmt - 129 n, tmt - 129 c;和三个生物学重复的小檗碱156毫克公斤¹组标签tmt - 130 n, tmt - 130 c, tmt - 131。所有的标签样本混合、真空干燥、和存储在-20°C进行进一步分析。

2.10.2。高pH值反相分离和质/ MS分析

100年TMT-labelled多肽的溶解μL缓冲区(98%重蒸馏的水,2%乙腈,pH值10)和分离通过高pH值反相分离色谱普源精电L - 3000高效液相色谱系统(北京普源精电科技有限公司、北京、中国)。分数收集每1.75分钟45管然后干组合成10管进行进一步的质/ MS分析。

质/ MS分析EASY-nLC 1000系统(纳米高效液相色谱、热费希尔科学、美国)耦合在线Q与EASY-Spray Exactive质谱仪离子源(美国热费希尔科学)。样品被加载到一个好评PepMap 100 precolumn ( ,5μ美国热费希尔科学,使用C18)。肽的分离进行了使用一个EASY-Spray列( ,3μ美国热费希尔科学,使用C18)与缓冲甲酸超纯水(100%和0.1%)和缓冲B(100%的乙腈和0.1%的甲酸)350 nL·分钟的流量¹。筛选了多肽进行分析使用Q Exactive在线系统。执行数据采集使用视女士排名前20位的方法。

2.10.3。蛋白质鉴定和定量分析

质/女士原始数据从UniProt对鼠标FASTA数据库搜索(Uniprot_mouse_54106_20170101.fasta)使用蛋白质组发现者2.1版(美国热费希尔科学)。错误发现率(罗斯福)被设置为< 0.01。检测至少一个独特的多肽/蛋白质作为蛋白质鉴定的要求。蛋白质的定量分析是基于记者离子峰强度。差异表达蛋白质通过ratio-fold变化以及被确定值计算的 - - - - - -测试。阈值设定在一个差别的上升和对这些基因的平均水平 与一个值< 0.05和平均 与一个值< 0.05;收集满足阈值集的蛋白质的差异表达蛋白质进一步进行生物信息学分析。

2.10.4。生物信息学分析

差异表达的蛋白质进行功能注释通过基因本体论(去)富集分析(http://www.geneontology.org/)。此外,创造力通路分析(IPA)软件(试剂盒、钙、美国、http://www.ingenuity.com)被用来分析规范途径,疾病和功能,和生物网络与列表相关的差异表达蛋白质。数据集包含差异表达蛋白质和相应的表达式值被上载到音标,然后,IPA“核心分析”。

2.10.5。西方墨点法

从主动脉组织蛋白质提取和量化描述的部分2.10。1。等量(20μg)从每个样本分离总蛋白质的10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page),其次是转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔、马、美国)。然后,膜被封锁在37°C 5%脱脂牛奶2 h和孵化anti-GPD2(稀释1:1000),anti-PON1(稀释1:1000),anti-APOA1(稀释1:1000),和anti-GAPDH(稀释1:1000)抗体在一夜之间在4°C。膜是用0.5% Tween-20 / PBS (PBST) 和孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-mouse或山羊anti-rabbit二级抗体(1:2000)在室温下1 h。与PBST四洗后,蛋白质是可视化使用ECL免疫印迹基质(美国新泽西州32106,热费希尔科学)和暴露在x射线胶片(6535876,伊士曼柯达公司,纽约,美国)。蛋白表达水平定义为灰度值量化与ImageJ软件(美国国立卫生研究院)和规范化GAPDH表达式。

2.11。统计分析

所有的实验数据都表示为 。与SPSS统计分析软件(版本17.0,SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。单向方差分析与图基的事后测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较用于多个组之间的比较。学生的 - - - - - -测试是用于比较两组。差异与 被认为是具有统计学意义。GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)是用于图形化的工作。

3所示。结果

3.1。引起小檗碱降低血清FFA和TG水平和肝脏脂质积累

ApoE^{- / -}一个西式饮食的老鼠为12周作为动脉粥样硬化模型,和小檗碱是由口腔填喂法。在整个实验过程中,老鼠的身体重量记录每周(图1(一)),所有的老鼠的体重增加与之前的实验。经过12周的政府,ApoE的重量^{- / -}小鼠显著增加,156 mg·公斤¹小檗碱显著抑制体重增加(图1 (b))。体重增加,ApoE的头发^{- / -}老鼠出现暗淡,脱毛,这可能提高小檗碱(图1 (c))。确认hypolipidaemic小檗碱的影响,血清血脂水平测定。与野生型小鼠相比,载脂蛋白e^{- / -}老鼠、FFA、TG、TC和血清低密度脂蛋白胆固醇水平显著增加,高密度脂蛋白胆固醇水平显著下降了西式饮食。小檗碱(156 mg·公斤¹降低FFA(图)1 (d))和TG(图1 (e))水平对TC(图但没有显著影响1 (f)),高密度脂蛋白胆固醇(图1 (g)),和低密度(图1 (h))。

与野生型小鼠相比,肝脏载脂蛋白e指数^{- / -}老鼠增加(图1(我)减少(图)和肝脏颜色1 (j)),这意味着肝脂质积累。小檗碱(78和156 mg·公斤¹)阻止肝脏颜色变化和降低肝脏指数。在图1 (k))染色法显示,轻微炎性细胞浸润,肝细胞的液泡ApoE^{- / -}老鼠,表明肝脏脂肪变性;油红O染色显示显著增加脂肪滴在载脂蛋白e^{- / -}老鼠。然而,小檗碱治疗或阿托伐他汀显著降低脂滴和减轻肝脂肪变性的大小,表明小檗碱对抗肝脂质积累。

3.2。小檗碱治疗抑制动脉粥样硬化的发展

在实验结束时,超声被用于评估心脏功能(补充图1(图)和颈动脉功能的老鼠2(一个))。颈动脉内中膜厚度(IMT)的载脂蛋白e^{- / -}小鼠显著增加,156 mg·公斤¹小檗碱治疗12周改善了IMT增厚,但没有差别在每组的小鼠颈动脉内径(图2 (b))。为了进一步确定antiatherosclerotic小檗碱的影响,我们进行了油红O,他走时,VVG主动脉根的染色。如图2 (c)(油红O染色),明显脂质积累和斑块形成主动脉根的ApoE在座^{- / -}西式饮食的老鼠,而没有脂质斑块积聚在野生型老鼠被发现。小檗碱、阿托伐他汀显示管理倾向于减少斑块面积。如图2 (d)(圆)染色),与野生型小鼠相比,主动脉内膜的增生,脂质沉积,斑块形成ApoE的观察^{- / -}老鼠,伴有炎性细胞浸润。鼻窦病变在berberine-treated ApoE改进^{- / -}老鼠,展示了antiatherosclerotic小檗碱的影响。图2 (e)在载脂蛋白e (VVG染色)显示动脉病变^{- / -}老鼠,显示一个明显的中断,降低,甚至丧失弹性蛋白纤维。然而,小檗碱预防这些疾病和动脉壁的弹性蛋白含量增加。

3.3。小檗碱在ApoE改善内皮功能障碍^{- / -}老鼠

胸主动脉环孤立研究小檗碱是否可以防止在ApoE内皮功能障碍^{- / -}老鼠喂食高脂肪的饮食。内皮功能决定通过测量endothelium-dependent血管舒张,以应对课时。如图3(一个)经过12周的政府,endothelium-dependent乙酰胆碱引起的血管舒张是ApoE大大受损^{- / -}小鼠与野生型小鼠相比。重要的是,ACh-induced损伤的血管舒张恢复了小檗碱。然而,在没有区别SNP-induced endothelial-independent组(图之间的血管舒张3 (b)),证明小檗碱在主动脉的保护作用包括维持内皮功能。同样,在体外实验表明,主动脉endothelium-dependent放松由小檗碱在ApoE惊人地保存^{- / -}老鼠(图3 (c)),endothelium-independent血管舒张不改变在任何团体(图3 (d)),表示由小檗碱显著改善血管内皮功能。

为了进一步评价血管内皮功能,主动脉根以挪士,ET-1免疫荧光法和TUNEL染色进行。代表图像数据所示3 (e)和3 (f)。表达下调表达以挪士(绿色)和超表达ET-1(红色)在主动脉根ApoE的观察^{- / -}老鼠,小檗碱治疗逆转以挪士的表达和ET-1部分(图3 (e))。图3 (f)显示增加凋亡细胞(绿色)在ApoE鼻窦病变区域^{- / -}小鼠与野生型小鼠相比,但小檗碱政府TUNEL-positive细胞的数量减少。总之,这些数据显示小檗碱的保护作用的载脂蛋白e的主动脉^{- / -}老鼠。

3.4。小檗碱的主动脉ApoE的氧化应激^{- / -}老鼠

她染色检测内皮细胞活性氧生成执行评估小檗碱对氧化应激的影响。与野生型小鼠相比,她在ApoE荧光强度增加^{- / -}老鼠,这表明总主动脉ROS生成增加,而小檗碱治疗减少内皮荧光(图4(一))。血清MDA水平的氧化应激的产品和ox-LDL ApoE非常高^{- / -}比野生型老鼠老鼠。小檗碱、阿托伐他汀治疗后,改变在MDA和ox-LDL水平显著地抑制(数字4 (b)和4 (c))。此外,政府小檗碱降低ApoE的炎性细胞因子il - 6的水平^{- / -}老鼠(图4 (d))。

3.5。TMT蛋白分析

获得全球的概述蛋白质由小檗碱和更好地理解的机制保护小檗碱ApoE的主动脉^{- / -}老鼠,蛋白质组学分析基于TMT的技术进行了分析。本研究的工作流程如图5(一个)。通过质/ MS分析,总共59751光谱得到对应于31414肽。4956年总蛋白( )确定了从28957年独特的肽(图5 (b)),4841蛋白质被成功地量化(补充表1)。的蛋白质表现出一个值< 0.05和一个 或< 0.83被定义为差异表达蛋白质。与野生型小鼠相比,871年调节蛋白质和385年ApoE下调蛋白质被确定^{- / -}西式饮食的老鼠,而小檗碱治疗调节132蛋白质和蛋白质表达下调222(图5 (c))。在图5 (d)维恩图显示,分布和重叠两个比较组中差异表达的蛋白质。其中有199常见的差异表达蛋白质组比较,包括67年调节蛋白质和132年下调的蛋白质。这些常见的差异表达蛋白的表达是通过分层集群的集群(图5 (e)前20名),如表所示1。

3.6。差异表达蛋白的生物信息学分析和免疫印迹验证

澄清199个差异表达蛋白的生物学意义,我们首先进行富集分析去注释根据蜂窝组件,这些蛋白质的功能分子功能和生物过程。628年去接受 明显丰富,79年细胞组件,160年的分子功能,389年的生物过程。数据的分析补充表所示2和前20名的每个类别图所示6。从细胞组件浓缩方面,它可以指出差异表达蛋白质很可能主要位于线粒体(图6(一))。分子功能浓缩,高密度脂蛋白粒子绑定是最丰富,而受体结合(图包含了最多的差异表达蛋白质6 (b))。关于生物过程,差异表达蛋白在脂肪酸机会非常丰富,这可能扮演了一个重要的角色在小檗碱保护主动脉在动脉粥样硬化(图6 (c))。

接下来,异丙醇进行进一步调查生物功能。图7(一)显示了前15名正则路径根据价值。其中,线粒体功能障碍的最重要途径,与氧化应激和代谢疾病有关。的脂肪酸β氧化我(前2, ),FXR / RXR激活(前三, ),和glutaryl-CoA退化(前4, )通路都参与脂质代谢的调节。整个详细的规范路径列表中提供了补充表3。此外,网络分析确定之间复杂的相互作用(直接或间接)这些蛋白质。前3的所有网络15网络(补充表4)根据分数所示的数据7 (b)- - - - - -7 (d)。网络1(图7 (b)),NDUFA4 (NDUFA4线粒体复杂关联)和线粒体复杂1是核心的蛋白质,主要是参与代谢疾病、发育障碍、遗传障碍。网络2(图7 (c))介导的生物过程,如能源生产、脂质代谢,和小分子生物化学和ACOX1(酰CoA氧化酶1),CD36, EHHADH (enoyl-CoA水合酶和3-hydroxyacyl辅酶a脱氢酶)是核心的蛋白质。在网络3(图7 (d)),APOA1可能发挥关键作用。这个网络主要是脂质代谢有关,小分子生物化学,维生素和矿物质代谢。异丙醇也采用分组差异表达蛋白质分为三个类别:“疾病和障碍,”“分子和细胞功能,”和“生理系统的开发和功能”(补充图2)。在疾病和失调,代谢疾病被发现排名最靠前,和心血管疾病的相关疾病(补充图2)。分子的代谢性疾病和心血管疾病的前4类补充图所示3。

三种蛋白质,包括PON1 APOA1、GPD2,参与动脉粥样硬化、心血管疾病、选择和脂质代谢,通过西方墨点法进行验证。PON1的表达水平和APOA1被发现是ApoE显著下调^{- / -}小鼠与野生型小鼠相比,而GPD2 upregulation显示重要。小檗碱治疗调节PON1 APOA1和的表达下调的表达GPD2(图7 (e))。这些结果与观察到的结果一致TMT-based蛋白质组学分析。

4所示。讨论

Hyperlipidaemia dyslipidaemia的特征,包括血液水平升高的TG、TC、低密度和高密度脂蛋白胆固醇水平下降,是动脉粥样硬化的主要危险因素(25]。调节脂质代谢障碍的一个方法用来控制动脉粥样硬化的发展。我们的研究结果表明,小檗碱治疗显著降低西式食源性ApoE的TG、FFA水平^{- / -}老鼠,说明小檗碱的降脂效果。此外,肝脏是脂质代谢的重要器官,负责维持体内平衡胆固醇和低密度脂蛋白(26]。我们观察到肝脂质积累。如数据所示1(我)- - - - - -1 (k),缓解肝脂肪变性和小檗碱降低肝脏脂质积累,这表明,小檗碱可能有潜在疗效脂肪肝,进一步的调查是必要的。综上所述,这些数据表明,主动脉的保护作用和小檗碱的antiatherosclerotic效果可能部分由于其调节脂类代谢。

内皮功能障碍是动脉粥样硬化的早期步骤(6和未来心血管事件的独立预测因子27]。因此,针对内皮功能障碍是一个有吸引力的药理方法(28]。endothelium-dependent受损血管舒张是内皮功能障碍的特点(29日]。改善endothelium-dependent血管舒张和恢复动脉粥样硬化患者内皮功能可以防止心血管事件(30.]。此外,防止损伤endothelium-dependent放松被发现在ApoE减弱动脉粥样硬化^{- / -}老鼠(31日]。我们的结果显示受损endothelium-dependent ApoE乙酰胆碱引起的血管舒张^{- / -}一个西式饮食的老鼠,建议在ApoE内皮功能障碍^{- / -}老鼠。然而,小檗碱干预明显恢复endothelium-dependent血管舒张体内和体外,表明保护小檗碱对内皮功能的影响。许多因素,包括dyslipidaemia、氧化应激和炎症反应,参与内皮功能障碍的进展。血浆FFA浓度增加会导致增加活性氧生成(32),而循环低密度脂蛋白升高存款在皮下基质和被氧化形成ox-LDL通过增加活性氧的生产。Ox-LDL直接损伤内皮细胞,导致内皮功能障碍通过过度lectin-like氧化低密度脂蛋白receptor-1 (LOX-1),导致细胞内ROS(进一步上升33- - - - - -35]。活性氧氧化四氢生物蝶呤,导致以挪士解偶联(36),与一氧化氮(NO)和反应形成过氧亚硝基(ONOO⁻),从而减少没有生成和生物利用度,加快内皮功能障碍(37]。另一方面,ROS能够触发激活转录因子核因子(NF -κBκB) (38),它可以激活多种促炎细胞因子,il - 6等引发,E-selectin, ICAM-1, VCAM-1 [39,40),从而激活炎症。反过来,il - 6产生氧化应激,并通过超表达内皮功能障碍的动脉粥样硬化过程中血管紧张素ⅱ1型受体(41]。之间存在恶性循环氧化应激和炎症在动脉粥样硬化(42]。在最近的研究中,减少ROS生成在主动脉根和降低血清MDA水平,ox-LDL, il - 6 berberine-treated ApoE的检测^{- / -}老鼠,展示小檗碱的抗炎和抗氧化性能,这可能是小檗碱改善内皮功能障碍的机制。

颈动脉IMT代孕是动脉粥样硬化的标志(43]。增加颈动脉IMT与内皮功能障碍相关,和他们两人分别评估动脉粥样硬化过程从解剖学和功能的不同方面44]。超声是一种非侵入性的方法基于高分辨率扫描和计算机图像分析系统是一个功能强大的工具来评估小鼠血管动脉粥样硬化。在目前的研究中,我们使用烈度衰减的观点得到超声波成像系统测量颈动脉IMT。超声检查结果表明,小檗碱显著减少颈动脉IMT,表明小檗碱能改善动脉壁病变。我们进一步研究了主动脉根ApoE的病理变化^{- / -}小鼠表现出明显的脂质积累,斑块的形成,和严重的动脉粥样硬化病变,暗示成功建立动脉粥样硬化模型。小檗碱治疗缓解鼻窦ApoE粥样硬化病变的严重程度^{- / -}老鼠。这些结果表明,小檗碱治疗可以抑制动脉粥样硬化的发展。

进一步揭示了小檗碱在改善动脉粥样硬化的机制和保护ApoE的主动脉^{- / -}老鼠,TMT-based定量蛋白质组学分析全球屏幕berberine-regulated蛋白质,其次是生物信息学分析和验证。从TMT蛋白质分析和基于数据分析,我们发现199蛋白质由小檗碱治疗动脉粥样硬化,这可能主要位于线粒体和参与脂肪酸的生物过程机会(图6),表明小檗碱可能通过调节线粒体功能和保护主动脉脂质代谢。异丙醇典型路径分析表明,线粒体功能障碍( )最重大的一个途径是相关的差异表达蛋白质(图7(一))。含有大量的线粒体氧化还原运营商和有氧呼吸的主要场所,通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP);因此,线粒体被称为细胞的“权力”。除了发电外,线粒体是参与调节许多细胞过程,如钙信号(45),细胞死亡(46),和炎症(47]。此外,线粒体ROS的重要来源,大约90%的可追溯到线粒体(48]。的刺激下的风险因素,比如高胆固醇血症,hyperlipidaemia,缺氧,可以改变,线粒体膜电位触发线粒体ROS生产过度,导致线粒体损伤和功能障碍(49]。反过来,线粒体功能障碍导致更多的活性氧产量,增强活性氧的生产诱发内皮功能障碍的解偶联以挪士,引发炎症。线粒体功能障碍存在于人类和小鼠动脉粥样硬化,促进动脉粥样硬化的发展,影响血管内皮功能,血管平滑肌细胞增殖或凋亡,和巨噬细胞极化50,51]。因此,mitochondria-targeted干预动脉粥样硬化可能提供一种新的治疗策略。人们已经发现,绿原酸可以减轻ox-LDL-induced内皮细胞氧化应激和线粒体功能障碍通过调制SIRT1 / AMPK / PGC-1通路,从而提供有利影响动脉粥样硬化(52]。我们的研究结果表明,差异表达蛋白质由小檗碱最相关的线粒体功能障碍,这表明调节线粒体功能障碍的可能机制之一的小檗碱保护主动脉粥样硬化。

国际网络分析表明APOA1占较大比重的网络3和调节小檗碱(图7 (d))。高密度脂蛋白APOA1是蛋白质的主要组成部分,决定了血浆高密度脂蛋白的水平(53]。APOA1水平升高与降低心血管事件的风险密切相关的患者(54),和一个有害的突变APOA1授予增加动脉粥样硬化的风险(55]。动物实验也表明,APOA1抑制动脉粥样硬化的进展。体细胞基因转移的人类APOA1降低动脉粥样硬化进展在人类APOA1-transgenic老鼠和载脂蛋白e^{- / -}老鼠(56]。注入含有三聚物的合成高密度脂蛋白人类APOA1稳定动脉粥样硬化斑块在hypercholesterolemic兔子57]。郭等人发现perhexiline降低动脉粥样硬化通过调节APOA1转录和增加小鼠APOA1水平58]。因此,增加APOA1合成可能成为新方法治疗动脉粥样硬化。在此,在ApoE APOA1表达下调^{- / -}老鼠,逆转了差别表达对这些小檗碱。出来的“疾病和紊乱”的分析显示,APOA1与脂质代谢紊乱,冠状动脉疾病,急性冠脉综合征,血管闭塞(补充图3)。这些结果表明,小檗碱对APOA1监管作用,这可能是一个潜在的目标小檗碱。

5。结论

在总结(图8),我们的研究表明,小檗碱能改善内皮功能障碍预防动脉粥样硬化通过恢复endothelium-dependent血管舒张,衰减氧化应激和炎症,调节脂质代谢,减轻动脉粥样硬化病变。调节线粒体功能障碍和定位APOA1可能潜在的保护机制。的确切机制仍有待进一步的研究和特征,但在一起,这里给出的结果提供了新颖的见解小檗碱的分子antiatherosclerosis机制和证据支持的潜力小檗碱作为一种有前景的候选治疗动脉粥样硬化。

缩写

哦:	乙酰胆碱
APOA1:	载脂蛋白A我
ApoE- / -:	载脂蛋白E-deficient
ATO:	阿托伐他汀
BBR:	小檗碱
DAPI:	4 ,6-Diamidino-2-phenylindole
她:	Dihydroethidium
以挪士:	内皮细胞一氧化氮合酶
ET-1:	内皮素1
FFA:	游离脂肪酸
GAPDH:	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
走:	基因本体论
GPD2:	Glycerol-3-phospate脱氢酶2
高密度脂蛋白胆固醇:	高密度脂蛋白胆固醇
):	Haematoxylin-eosin
ICAM-1:	细胞间粘附molecule-1
il - 6:	白细胞介素- 6
IMT:	内中膜厚度
异丙醇:	创新途径分析
k - h:	Krebs-Henseleit
质/女士:	液体chromatography-tandem质谱
密度:	低密度脂蛋白胆固醇
MDA:	丙二醛
女士:	质谱分析
不:	去甲肾上腺素
没有:	一氧化氮
Ox-LDL:	氧化低密度脂蛋白
PON1:	Paraoxonase 1
ROS:	活性氧
SNP:	硝普酸钠
TC:	总胆固醇
TG:	甘油三酸酯
台湾海陆运输公司:	串联质量标签
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子α
TUNEL:	末端原位dUTP缺口末端标记
VCAM-1:	血管细胞粘附molecule-1
VVG:	Verhoeff-Van Gieson
WT:	野生型。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了中国国家重点研发项目(2018 yfc1704500)和中国国家自然科学基金(81873104,81873104)。

补充材料

补充1。补充表1:定量蛋白质的列表。

补充2。补充表2:去富集分析的数据包括细胞组件,分子功能,和生物过程。

补充3。补充表3:规范化路径的音标列表。

补充4。补充表4:网络的音标列表。

补充5。补充图1:BBR对心脏功能的影响。雄性野生型(WT) C57BL / 6小鼠与正常喂养食物的饮食,和载脂蛋白e^{- / -}老鼠与西式饮食的存在和缺乏小檗碱(BBR 78和156毫克公斤¹)或阿托伐他汀(ATO)的存在。经过12周的管理、超声心动图。(一)代表超声心动图(M-mode)显示壁运动。(b)峰值或者多普勒超声心动图对左心室流出道。(c)的超声心动图测量射血分数(EF)、部分缩短(FS),或者峰值和峰值压力不同组的左心室流出道。数据显示为 。^# 与WT, 与ApoE^{- / -}。补充图2:疾病和功能分析共同差异表达的蛋白质根据音标。差异表达的蛋白质被分成三类:疾病和障碍(a)、(b)分子和细胞功能,(c)和生理系统的开发和功能。补充图3:前4类的分子概要文件在代谢性疾病和心血管疾病的音标。(a)的分子资料障碍脂类代谢,脂肪酸氧化障碍,在代谢酶病,肝脂肪变性疾病。(b)分子的冠状动脉疾病,心脏的形态异常,急性冠脉综合征,血管闭塞的心血管疾病。

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