小檗碱是从成都购买Mansite药业有限公司有限公司(A0151,成都,中国)。阿托伐他汀购买辉瑞制药有限公司(大连,中国)。西式饮食购买从北京HFK生物科学(中国,北京,许可数量:SCXK (Jing) 2014 - 0008)。异氟烷是购买的雅培公司(上海,中国)。氯化钠、氯化钾、MgSO₄h·7₂O, KH₂阿宝₄,CaCl₂,NaHCO₃,葡萄糖在本文中从天津Kemiou购买化学试剂有限公司,有限公司(天津)。乙腈是购买从默克公司(德国)。去甲肾上腺素(NE)、乙酰胆碱(Ach),硝普酸钠(SNP),和甲酸从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。内皮一氧化氮合酶(以挪士)抗体(RT1203)从HuaBio购买(杭州)。CD31抗体(550274)从BD(美国)购买。内皮素1 (ET-1) (ab117757) glycerol-3-phospate脱氢酶2 (GPD2) (ab188585) paraoxonase 1 (PON1) (ab24261),载脂蛋白A我(APOA1) (ab20453)抗体购自Abcam(英国剑桥)。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)抗体(CW0100A),山羊anti-mouse免疫球蛋白(CW0102)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白(CW0103)从CoWin购买生物科学(中国,北京)。胰蛋白酶是购自热费希尔科学(美国新泽西州)。

雄性野生型小鼠C57BL / 6(6到8周大)和载脂蛋白e^{- / -}老鼠(6到8周大)C57BL / 6遗传背景从北京获得至关重要的河实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京),允许数字SCXK (Jing) 2016 - 0006年和SCXK (Jing) 2016 - 0011。所有的动物都被安置在标准笼子(≤5 /老鼠笼)用干净的锯末被褥specific-pathogen-free环境条件下(20 - 25°C,相对湿度40 - 60%,12 h光/暗周期),有免费的水和食物。所有程序都是严格按照实验动物保健和使用指南发布的中国科技部和实验动物伦理委员会批准天津中医药大学(批准文号:TCM-LAEC2016014)。

在适应于一个星期的住房环境,两个ApoE五十^{- / -}一个西式饮食的老鼠含有21%的脂肪和0.15%胆固醇被随机分为四组:汽车集团(ApoE^{- / -}, n = 15 )、阿托伐他汀组(ATO 2.6 mg·公斤¹, n = 15 ),小檗碱78毫克公斤¹集团(bbr·kg - 78毫克¹, n = 7 ),小檗碱156毫克公斤¹集团(bbr·kg - 156毫克¹, n = 15 )。美联储野生型C57BL / 6小鼠正常食物的饮食被用作对照组(WT, n = 15 )。车辆和控制老鼠用生理盐水治疗。所有的老鼠注射治疗口腔填喂法为12周。

超声进行12周后2100年政府使用Vevo ultra-high-resolution小动物超声成像系统(VisualSonics,多伦多,加拿大)配备一个MS550D换能器工作在40 MHz。老鼠吸入异氟烷麻醉为1.5 -2.0% 100%的氧气。后头发是小心翼翼地从胸部和颈部,老鼠放在一个加热平台在仰卧位。首先,胸骨旁的烈度衰减视图来显示左心室和升主动脉,M-mode和PW多普勒模式图像。然后,扫描头搬到脖子,右侧颈总动脉在哪里使用,烈度视图可视化。在b型,右颈总动脉的超声图像。所有的电影循环和帧记录和存储数字图像分析使用离线工作站Vevo实验室2.1.0 (VisualSonics,多伦多,加拿大)。

在实验的最后,老鼠牺牲,其次是血液样本,肝脏,心脏主动脉,收藏。

的机关室实验进行了如前所述[ 23]。老鼠被斩首,牺牲和胸主动脉被隔离并立即沉浸在含氧冰冷的Krebs-Henseleit (k - h)解决方案(4.75 118年作文mM:氯化钠,氯化钾,MgSO₄h·7₂1.2 O, KH₂阿宝₄1.2,CaCl₂2.5,NaHCO₃25日,和葡萄糖11;pH值7.3 - -7.4)。经过仔细切除秉承血管周的组织,2 - 3毫米戒指小心翼翼地削减。主动脉环悬浮在一个器官含10毫升k - h的解决方案保持在37°C和95%都洋溢着O₂和5%的公司₂两个平行不锈钢挂钩。等长张力在实验测量和记录由计算机辅助数据采集系统(PowerLab / 4 sp;ADInstruments企业有限公司、澳大利亚)。每个环逐步延伸到基线张力为0.8 g和允许平衡实验前60分钟。平衡后,戒指最初合同60 mM氯化钾引起的收缩反应,然后,他们与k - h溶液清洗恢复紧张到基础水平的三倍。随后,NE (10⁶米)是用于订婚戒指。收缩,高原的ACh (10⁹-10年⁴米)或SNP (10⁹-10年⁵米)添加累计到器官浴诱导endothelium-dependent或endothelium-independent放松。

体外实验,年轮preincubated小檗碱(10⁷, 5 × 10 − 7 ,10⁶米)30分钟。然后,戒指与k - h清洗解决方案,之后ACh-induced endothelium-dependent放松和SNP-induced endothelium-independent放松是分开化验。

从血液样本血清制备。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)和游离脂肪酸(FFA)测量使用生化试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国);ox-LDL和丙二醛(MDA)和ELISA测定试剂盒(Cloud-Clone Corp .),武汉,中国);和il - 6决心ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。所有的程序都是按照制造商的指示执行。

拍照后,体重,一块肝脏中立的福尔马林固定在10%,剩下的部分在液态氮冷冻,保存在-80°C。肝组织浸泡在福尔马林溶液与梯度脱水乙醇和嵌入石蜡。石蜡包埋标本被切成4 μ米厚的串行部分,沾haematoxylin-eosin(圆)、武汉Servicebio生物科技有限公司,有限公司,武汉,中国)按照标准协议。观察肝脏中脂质积累,被冻结的组织是嵌入在最佳切削温度复合,切成6 μ米厚cryosections。部分是沾油红O (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。图像的所有部分都获得光学显微镜(Eclipse CI,尼康公司,东京,日本)。

小鼠灌注0.9%冰冷的盐水通过血液采集后左心室。包含主动脉根的心被删除,而在中性10%福尔马林固定石蜡切片或冷冻cryosectioning液氮。)、油红O和Verhoeff-Van Gieson (VVG、武汉Servicebio生物科技有限公司,有限公司,武汉,中国)染色进行。所有的图片都是用光学显微镜捕获。量化的油红O染色进行使用Image-Pro + 6.0软件(美国媒体控制论Inc .)。

评价血管内皮功能,以挪士和ET-1主动脉根的表达是由免疫荧光染色。CD31和终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)双重免疫荧光染色法进行测量内皮细胞凋亡。主动脉窦的cryosections permeabilized 0.2 -0.5% Triton x - 100 10分钟。主要的抗体anti-eNOS, anti-ET-1, anti-CD31稀释(1:200)和孵化一夜之间在4°C部分。在PBS(洗涤后 3 × 3 最小值 ),与二次孵化的部分抗体(驴anti-rat免疫球蛋白(ab150154 Abcam)和驴anti-rabbit免疫球蛋白(ab150073 Abcam,剑桥,英国),1:200稀释)在室温下1 h。此后,TUNEL costaining执行使用一个原位细胞死亡检测设备(11684795910,罗氏,德国)按照制造商的协议双荧光染色,和细胞核复染色与4 ′ 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (H1200向量实验室、钙、美国)的所有部分。荧光显微镜下荧光染色是可视化(DFC500徕卡,位于德国)。

冰冻的横截面的主动脉根孵化了10 μM dihydroethidium(她)(S0063 Beyotime生物技术研究所、江苏、中国)在一个黑暗的调湿室在37°C为30分钟。 原位活性氧(ROS)生成标签与红色荧光可视化,并使用荧光显微镜拍照。

所有的实验数据都表示为 的意思是 ± 扫描电镜 。与SPSS统计分析软件(版本17.0,SPSS Inc .)、芝加哥,美国)。单向方差分析与图基的事后测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的多重比较用于多个组之间的比较。学生的 t 以及用于比较两组。差异与 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)是用于图形化的工作。

ApoE^{- / -}一个西式饮食的老鼠为12周作为动脉粥样硬化模型,和小檗碱是由口腔填喂法。在整个实验过程中,老鼠的身体重量记录每周(图 1(一)),所有的老鼠的体重增加与之前的实验。经过12周的政府,ApoE的重量^{- / -}小鼠显著增加,156 mg·公斤¹小檗碱显著抑制体重增加(图 1 (b))。体重增加,ApoE的头发^{- / -}老鼠出现暗淡,脱毛,这可能提高小檗碱(图 1 (c))。确认hypolipidaemic小檗碱的影响,血清血脂水平测定。与野生型小鼠相比,载脂蛋白e^{- / -}老鼠、FFA、TG、TC和血清低密度脂蛋白胆固醇水平显著增加,高密度脂蛋白胆固醇水平显著下降了西式饮食。小檗碱(156 mg·公斤¹降低FFA(图) 1 (d))和TG(图 1 (e))水平对TC(图但没有显著影响 1 (f)),高密度脂蛋白胆固醇(图 1 (g)),和低密度(图 1 (h))。

与野生型小鼠相比,肝脏载脂蛋白e指数^{- / -}老鼠增加(图 1(我)减少(图)和肝脏颜色 1 (j)),这意味着肝脂质积累。小檗碱(78和156 mg·公斤¹)阻止肝脏颜色变化和降低肝脏指数。在图 1 (k))染色法显示,轻微炎性细胞浸润,肝细胞的液泡ApoE^{- / -}老鼠,表明肝脏脂肪变性;油红O染色显示显著增加脂肪滴在载脂蛋白e^{- / -}老鼠。然而,小檗碱治疗或阿托伐他汀显著降低脂滴和减轻肝脂肪变性的大小,表明小檗碱对抗肝脂质积累。

在实验结束时,超声被用于评估心脏功能(补充图 1(图)和颈动脉功能的老鼠 2(一个))。颈动脉内中膜厚度(IMT)的载脂蛋白e^{- / -}小鼠显著增加,156 mg·公斤¹小檗碱治疗12周改善了IMT增厚,但没有差别在每组的小鼠颈动脉内径(图 2 (b))。为了进一步确定antiatherosclerotic小檗碱的影响,我们进行了油红O,他走时,VVG主动脉根的染色。如图 2 (c)(油红O染色),明显脂质积累和斑块形成主动脉根的ApoE在座^{- / -}西式饮食的老鼠,而没有脂质斑块积聚在野生型老鼠被发现。小檗碱、阿托伐他汀显示管理倾向于减少斑块面积。如图 2 (d)(圆)染色),与野生型小鼠相比,主动脉内膜的增生,脂质沉积,斑块形成ApoE的观察^{- / -}老鼠,伴有炎性细胞浸润。鼻窦病变在berberine-treated ApoE改进^{- / -}老鼠,展示了antiatherosclerotic小檗碱的影响。图 2 (e)在载脂蛋白e (VVG染色)显示动脉病变^{- / -}老鼠,显示一个明显的中断,降低,甚至丧失弹性蛋白纤维。然而,小檗碱预防这些疾病和动脉壁的弹性蛋白含量增加。

胸主动脉环孤立研究小檗碱是否可以防止在ApoE内皮功能障碍^{- / -}老鼠喂食高脂肪的饮食。内皮功能决定通过测量endothelium-dependent血管舒张,以应对课时。如图 3(一个)经过12周的政府,endothelium-dependent乙酰胆碱引起的血管舒张是ApoE大大受损^{- / -}小鼠与野生型小鼠相比。重要的是,ACh-induced损伤的血管舒张恢复了小檗碱。然而,在没有区别SNP-induced endothelial-independent组(图之间的血管舒张 3 (b)),证明小檗碱在主动脉的保护作用包括维持内皮功能。同样,在体外实验表明,主动脉endothelium-dependent放松由小檗碱在ApoE惊人地保存^{- / -}老鼠(图 3 (c)),endothelium-independent血管舒张不改变在任何团体(图 3 (d)),表示由小檗碱显著改善血管内皮功能。

为了进一步评价血管内皮功能,主动脉根以挪士,ET-1免疫荧光法和TUNEL染色进行。代表图像数据所示 3 (e)和 3 (f)。表达下调表达以挪士(绿色)和超表达ET-1(红色)在主动脉根ApoE的观察^{- / -}老鼠,小檗碱治疗逆转以挪士的表达和ET-1部分(图 3 (e))。图 3 (f)显示增加凋亡细胞(绿色)在ApoE鼻窦病变区域^{- / -}小鼠与野生型小鼠相比,但小檗碱政府TUNEL-positive细胞的数量减少。总之,这些数据显示小檗碱的保护作用的载脂蛋白e的主动脉^{- / -}老鼠。

她染色检测内皮细胞活性氧生成执行评估小檗碱对氧化应激的影响。与野生型小鼠相比,她在ApoE荧光强度增加^{- / -}老鼠,这表明总主动脉ROS生成增加,而小檗碱治疗减少内皮荧光(图 4(一))。血清MDA水平的氧化应激的产品和ox-LDL ApoE非常高^{- / -}比野生型老鼠老鼠。小檗碱、阿托伐他汀治疗后,改变在MDA和ox-LDL水平显著地抑制(数字 4 (b)和 4 (c))。此外,政府小檗碱降低ApoE的炎性细胞因子il - 6的水平^{- / -}老鼠(图 4 (d))。

获得全球的概述蛋白质由小檗碱和更好地理解的机制保护小檗碱ApoE的主动脉^{- / -}老鼠,蛋白质组学分析基于TMT的技术进行了分析。本研究的工作流程如图 5(一个)。通过质/ MS分析,总共59751光谱得到对应于31414肽。4956年总蛋白( 独特的 肽 ≥ 1 从28957年独特的肽(图)被确定 5 (b)),4841蛋白质被成功地量化(补充表 1)。的蛋白质表现出一个 P 值< 0.05和一个 比 − 褶皱 改变 > 1。2 或< 0.83被定义为差异表达蛋白质。与野生型小鼠相比,871年调节蛋白质和385年ApoE下调蛋白质被确定^{- / -}西式饮食的老鼠,而小檗碱治疗调节132蛋白质和蛋白质表达下调222(图 5 (c))。在图 5 (d)维恩图显示,分布和重叠两个比较组中差异表达的蛋白质。其中有199常见的差异表达蛋白质组比较,包括67年调节蛋白质和132年下调的蛋白质。这些常见的差异表达蛋白的表达是通过分层集群的集群(图 5 (e)前20名),如表所示 1。

澄清199个差异表达蛋白的生物学意义,我们首先进行富集分析去注释根据蜂窝组件,这些蛋白质的功能分子功能和生物过程。628年去接受 P < 0.05 明显丰富,79年细胞组件,160年的分子功能,389年的生物过程。数据的分析补充表所示 2和前20名的每个类别图所示 6。从细胞组件浓缩方面,它可以指出差异表达蛋白质很可能主要位于线粒体(图 6(一))。分子功能浓缩,高密度脂蛋白粒子绑定是最丰富,而受体结合(图包含了最多的差异表达蛋白质 6 (b))。关于生物过程,差异表达蛋白在脂肪酸机会非常丰富,这可能扮演了一个重要的角色在小檗碱保护主动脉在动脉粥样硬化(图 6 (c))。

接下来,异丙醇进行进一步调查生物功能。图 7(一)显示了前15名正则路径根据 P 价值。其中,线粒体功能障碍的最重要途径,与氧化应激和代谢疾病有关。的脂肪酸 β氧化我(前2, − 日志 P 价值 = 8.14 ),FXR / RXR激活(前三, − 日志 P 价值 = 6.96 ),和glutaryl-CoA退化(前4, − 日志 P 价值 = 6.8 )通路都参与脂质代谢的调节。整个详细的规范路径列表中提供了补充表 3。此外,网络分析确定之间复杂的相互作用(直接或间接)这些蛋白质。前3的所有网络15网络(补充表 4)根据分数所示的数据 7 (b)- - - - - - 7 (d)。网络1(图 7 (b)),NDUFA4 (NDUFA4线粒体复杂关联)和线粒体复杂1是核心的蛋白质,主要是参与代谢疾病、发育障碍、遗传障碍。网络2(图 7 (c))介导的生物过程,如能源生产、脂质代谢,和小分子生物化学和ACOX1(酰CoA氧化酶1),CD36, EHHADH (enoyl-CoA水合酶和3-hydroxyacyl辅酶a脱氢酶)是核心的蛋白质。在网络3(图 7 (d)),APOA1可能发挥关键作用。这个网络主要是脂质代谢有关,小分子生物化学,维生素和矿物质代谢。异丙醇也采用分组差异表达蛋白质分为三个类别:“疾病和障碍,”“分子和细胞功能,”和“生理系统的开发和功能”(补充图 2)。在疾病和失调,代谢疾病被发现排名最靠前,和心血管疾病的相关疾病(补充图 2)。分子的代谢性疾病和心血管疾病的前4类补充图所示 3。

三种蛋白质,包括PON1 APOA1、GPD2,参与动脉粥样硬化、心血管疾病、选择和脂质代谢,通过西方墨点法进行验证。PON1的表达水平和APOA1被发现是ApoE显著下调^{- / -}小鼠与野生型小鼠相比,而GPD2 upregulation显示重要。小檗碱治疗调节PON1 APOA1和的表达下调的表达GPD2(图 7 (e))。这些结果与观察到的结果一致TMT-based蛋白质组学分析。