实验性自身免疫性脑脊髓炎咖啡酸苯乙基酯预防通过调节T细胞的活动

文摘

多发性硬化(MS)是一种自身免疫性炎症疾病的中枢神经系统(CNS)的特点是进步的髓鞘脱失和禁用的结果。CD4⁺T细胞复发的最关键的驱动因素是女士,但小改进已经指出在删除整个T细胞群。咖啡酸苯乙基酯(角)、蜂胶的主要活性物质之一,有力的抗肿瘤,抗炎,抗氧化性能通过抑制核转录因子-κB (NF -κB) transactivation。调查在女士披肩的治疗潜力,我们研究了角对细胞因子水平的影响,T细胞和NF -κB的活动和实验动物模型。结果表明,从复发患者脑脊液(CSF)的特点是女士优先的促炎细胞因子/趋化因子含量增加,斜向辅助T细胞因子1 (Th1)。在体外研究表明,角不仅抑制T细胞增殖和活化,而且有效地调节T细胞的子集。在Th0和Th1-polarizing条件下,CD4细胞的比例⁺干扰素-γ⁺细胞表达下调,而CD4细胞⁺Foxp3⁺细胞增加。此外,核易位NF -κB p65被斗篷抑制。在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中,预防性治疗角明显降低发病率和严重程度。汽车组相比,小鼠使用角显示减少炎性细胞浸润,小胶质细胞/巨噬细胞激活和髓鞘脱失受伤。此外,预处理降低的水平角Th1细胞在脾脏和中枢神经系统,增加了调节性T细胞亚群)的中枢神经系统。总之,我们的研究结果强调的潜在价值角抑制T细胞活动主要通过针对致病性Th1血统,这可能是对多发性硬化症的治疗有益。

1。介绍

多发性硬化(MS)是一种炎性脱髓鞘疾病的中枢神经系统(CNS)反复复发和进步的障碍。尽管女士的确切机制尚不清楚,外围autoreactive T细胞被公认的主要驱动女士复发,而B细胞和CNS-resident细胞有助于进步[女士1)然而,在临床试验中,使用选择性地消除CD4单克隆anti-CD4抗体⁺T细胞不能降低活动[女士2),这可能是部分相关事实,除了辅助T 1 (Th1)和辅助T 17 Th17细胞,调节性T细胞亚群)也在MS发病机理中发挥核心作用发挥强有力的抗炎活动。因此,调节T细胞的活动而不是消耗整个细胞群会更合适。最近,急性复发患者的女士被报道与异常有关核因子-κB (NF -κB)基因表达的T细胞(1]。自NF -κB信号级联是必不可少的细胞增殖、细胞凋亡、免疫反应,阻止这一途径可以帮助防止恶化女士和进展。

蜂胶被广泛的作为一个潜在的免疫调节代理。越来越多的证据表明,许多生物活性化合物的生产蜂胶可以抑制细胞因子和免疫细胞迁移主要是通过阻断NF -κB通路(3,4]。咖啡酸苯乙基酯(角)是蜂胶的主要活性成分之一,据报道,已减轻许多炎症性疾病,如过敏性哮喘、实验性自身免疫性uveoretinitis,脓毒症作为一种特定的NF -κB抑制剂(5]。角的化学结构中提供了补充材料(可用在这里)。在目前的研究中,我们旨在调查角对T细胞的影响在体外并评估其潜在治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎基于(运算单元),这对于女士是一个典型的动物模型。

2。材料和方法

2.1。材料

角(纯度≥98%)从自然获得标准(上海,中国)。伴刀豆球蛋白IV型(ConA),脂多糖(LPS), Percoll,特里同x - 100,二甲亚砜(DMSO)从Sigma-Aldrich购买。重组小鼠白介素(rIL-12;p70);抗体纯化Ultra-LEAF™anti-mouse il - 4;purifiedLEAF™anti-mouse CD3抗体;纯化叶™anti-mouse CD28抗体;抗体对小鼠CD4、IL-17A干扰素-γ,Foxp3 CD25和CD69;细胞激活鸡尾酒;brefeldin解决方案;固定/细胞内染色透化作用洗缓冲区;和Foxp3固定/透化作用从BioLegend缓冲了。RPMI 1640中,胎牛血清(的边后卫)和GlutaMAX从Gibco获得。主要抗体Iba-1和光纯化学是购自kouichi产业。抗体NF -κB p65来自圣克鲁斯,髓鞘碱性蛋白(MBP)从Proteintech购买。Alexa萤石546 -共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L)和Alexa萤石488 -共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)抗体从英杰公司购买。haematoxylin-eosin(他)染色设备和细胞计数设备(CCK) 8从Beyotime购买生物技术(上海,中国)。人类XL细胞因子得到数组工具研发。

2.2。研究人口和细胞因子/趋化因子分析

7 MS患者完成2017麦当劳标准招募了2018年1月至2018年3月(6]。脑脊液(CSF)在两周内得到急性发作的急性治疗前就开始了。检测不到发炎七患者迹象疾病作为控件(焦虑症, ;紧张性头痛, ;和颅内静脉窦血栓形成, )。患者感染或其他自身免疫性疾病(如哮喘)被排除在研究之外。脑脊液样本立即离心机并保持在-80°C到分析。本研究经伦理委员会批准的中山大学第三附属医院(广州)从所有参与者获得的书面知情同意。细胞因子/趋化因子水平分析了使用人类蛋白质组分析器XL细胞因子数组工具包。简而言之,每个膜放置在一个4 multidish含2.0毫升的数组缓冲区6在每个和阻塞1 h。然后,数组缓冲区6从井吸气,准备样本添加根据协议和孵化瓶一夜之间在4°C。洗涤缓冲的膜清洗三次,增加了检测抗体稀释鸡尾酒和孵化1 h在室温下。三洗之后,一个HRP-conjugated二级抗体被添加到每个好,在室温下培养30分钟。最后,化学试剂混合添加到洗膜,然后,细胞膜受到Tanon 5200。

2.3。细胞准备和有丝分裂原刺激

女性C57BL / 6小鼠(6 - 8周大)和戊巴比妥麻醉和灌注transcardially冷PBS。脾脏被切除,通过70 -轻轻按压μ尼龙网。在300×g离心5分钟后,细胞治疗红细胞裂解缓冲(Solarbio,北京)3分钟在冰上。与冷PBS洗两次后,这些细胞被悬浮在完成RPMI 1640中补充10%的边后卫和1% GlutaMAX浓度和培养 每在24-well盘子或细胞/毫升 细胞/毫升/在96 -孔板在37°C和5%的公司₂。诱导淋巴细胞增殖,细胞被刺激ConA (5μ克/毫升)或有限合伙人(1μg / ml)。动物伦理委员会批准的这项研究是中山大学第三附属医院([2019]02-342-01)。

2.4。细胞生存和增殖化验

脾细胞培养在96孔板的密度 细胞/毫升每口井和孵化与角的表示浓度对有丝分裂原刺激前2 h。经过48小时的刺激通过ConA或有限合伙人,10μl CCK-8的解决方案是添加到中、孵化为4 h在37°C和5%的公司₂。450纳米的吸光度是评估标(Biotek)。

2.5。T细胞培养和分化

T细胞净化,prewarmed (37°C) PBS和RPMI 1640中(包含5%的边后卫)被用来洗羊毛尼龙注射器(美国Polysciences) 4 - 5次。T细胞的纯度是~ 85%。然后,2.0毫升的温暖完整的RPMI 1640中包含 淋巴细胞悬浮是添加到列,媒体被允许流失。额外的1.0毫升的温暖完整RPMI 1640中添加封面顶部的羊毛和孵化1 h在37°C。最后,媒体被允许流失,细胞慢慢筛选了与温暖的RPMI 1640年完成媒介。纯化T细胞( 细胞/毫升)刺激了plate-coated anti-CD3 (2μg / ml)和可溶性anti-CD28 (1μg / ml)单克隆抗体(mab) 72 h的存在与否角在96 -圆底板块在200的总量μl (RPMI 1640年完成介质在37°C和5%的公司₂。rIL-12 (10 ng / ml)和一个anti-IL-4马伯(5μg / ml)添加随着anti-CD28马伯T细胞分化成Th1细胞。

2.6。运算单元感应、治疗角和髓鞘脱失的分数

女性C57BL / 6小鼠(6 - 8周大)购买的重要河流实验动物科技(中国,北京)和维护陕西师范大学动物设施在无菌条件下(12 h / 12 h光/暗周期,提供食物和水随意)。小鼠皮下注射免疫(南)与100年μ克髓少突细胞糖蛋白肽- 55(撤走_{- 55})在完全弗氏佐剂乳化包含2毫克/毫升结核分枝杆菌H37 RA 0天,和100 ng百日咳毒素(PT)腹腔内接种(i.p。)每天0和2。临床评分和身体重量记录每日从免疫的开始。老鼠住按照指南的陕西师范大学动物保健和使用委员会和被允许适应使用前至少7天。

根据公园et al .,在淋巴细胞显著变化活动观察小鼠接受20毫克/公斤角为14天(7]。因此,在我们的研究中,在角剂量20毫克/公斤或40毫克/公斤。老鼠接受每日腹腔内注射角被进一步分为两组:预防组的感应,治疗开始的第一天实验性自身免疫性脑脊髓炎和治疗组的治疗开始出现症状的第一天。车辆组每日腹腔注射诱导PBS的第一天开始实验性自身免疫性脑脊髓炎。每组包含10个老鼠。在研究结束时,单核细胞收集从脾脏和中枢神经系统后红细胞溶解或Percoll分离进行流式细胞术分析。

临床分数范围从0到5如下:0,没有迹象;0.5,僵硬的尾巴;1,柔软的尾巴;2、柔软的尾巴步态不协调;2.5,一个后肢麻痹;3,两后肢瘫痪;3.5,后肢瘫痪和软弱的前翼;4,奄奄一息;,5日死亡。三个地区的每个腰椎扩大部分(三个部分/动物)分级如下:得分0,没有髓鞘脱失; score 1, mild demyelination; score 2, severe demyelination; and score 3, massive demyelination.

2.7。流式细胞术

细胞收获和彩色anti-CD4抗体在室温下为30分钟。洗后用PBS / 1% BSA,这些细胞被孵化与固定缓冲区在黑暗中在室温20分钟和洗透化作用(烫)缓冲区。删除后上层清液,细胞在烫resuspended缓冲区和孵化在黑暗中在室温下15分钟。然后,细胞被离心机,颗粒在100年resuspendedμl烫的缓冲区。细胞与胞内抗体在室温下孵化在黑暗中30分钟。最后,这些细胞被洗两次与PBS / 1% BSA, resuspended,运行在一个流式细胞仪第二章流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞,CA),并分析了FlowJo (TreeStar、亚什兰或)。

2.8。组织病理学和免疫荧光

脊椎腰椎普遍在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡和分段(4μ米)。一些腰扩大部分(每组3 - 4老鼠;3节/动物)都沾着他对炎性细胞浸润的程度进行评估。其他部分进行免疫荧光染色如下:部分paraffinized,水化,阻止了山羊血清为10%。然后,一夜之间,部分被孵化在4°C主要抗体Iba-1(1: 100)和MBP (1: 200)。洗后,部分是孵化Alexa Fluor-conjugated二级抗体(1:300)在室温下1 h,其次是DAPI对比染色。莱卡DM 4000 B显微镜下获得的图像,通过图像分析J(美国国立卫生研究院)。

2.9。统计分析

学生的 - - - - - -测试或Mann-Whitney测试是用来比较两组之间的数据( )。独立的非参数数据和多个组,如临床评分,评估了非参数单向方差分析(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)。 被认为是显著的。所有统计分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行。

3所示。结果

3.1。患者Th1极化是杰出的女士

评估患者的T细胞概要女士,我们测量了CSF的一些细胞因子和趋化因子水平,可以更好地反映中枢神经系统的炎症状况。总结了招募病人的临床特征表1。脑脊液蛋白水平的差异或白细胞计数女士和对照组之间被发现。图1显示脑脊液细胞因子/趋化因子的水平。促炎细胞因子/趋化因子的水平,包括MMP-9 IL-32a / b / c, CCL-20, CXCL-5, IL-19, CXCL-1, IL-16, IL-34, CCL-3, IL-15, g - csf, CCL-5,干扰素γIL-1a,以及一个抗炎细胞因子的水平,il - 10, MS患者中显著升高与控制相比,大多数这些细胞因子与Th1分化相关联(如干扰素-γ、IL-15 IL-16)。意外,我们观察到的水平一些th2型细胞因子(il - 4、IL-5 IL-13)也在MS组高于对照组,这是根据有限的研究(8]。之间没有相关性观察Th1、Th2细胞因子而发生明显改变。

3.2。抑制角ConA-Induced T细胞增殖和活化

如图2(一个)治疗组中,细胞生存能力相似与不同浓度的斗篷48 h,表明角对脾细胞没有毒性。测试在mitogen-induced角的影响细胞增殖,细胞被孵化ConA或有限合伙人,主要刺激T细胞和B细胞,分别。显著抑制角ConA-stimulated细胞增殖在剂量依赖性的方式(图2 (b))。相比之下,LPS-induced扩散与清廉不影响治疗μM角。一个重要的变化是观察20的浓度μM角相比对照组(图2 (c))。由于CD4⁺在女士T细胞发挥关键作用,我们研究CD4的频率⁺T细胞在ConA-stimulated脾细胞。未发现差异在细胞治疗剂量的角(图表示2 (d))。激活后,几个分子T细胞的表达,比如CD69(早期活化标记)和CD25(中间活化标记),增加转录因子的调控下,如NF -κB (9]。脾细胞刺激了ConA 8 h (CD69)或24 h (CD25)。数据3(一个)和3 (b)表明,10μ米预处理不仅显著抑制角细胞表达CD69、CD25的百分比也CD4的百分比⁺CD69⁺和CD4⁺CD25⁺细胞。这些活化分子基因的转录活动被报道是高度依赖NF -κB (9]。与这份报告一致,核易位NF -κ20 B p65被抑制μM治疗与ConA刺激后角2 h。

3.3。角抑制干扰素-γ表达式和改进Foxp3表达天真的CD4细胞⁺T细胞

评估在CD4角的影响⁺T细胞,我们发现干扰素-的水平γ、IL-17A Foxp3流式细胞术。如数据所示4(一)和4 (c),显著抑制干扰素的水平角γ诱导T细胞刺激后anti-CD3 anti-CD28抗体72 h。此外,治疗角增加Foxp3表达细胞的浓度为20μm .没有区别在CD4的百分比⁺T细胞和CD4⁺IL-17A⁺T细胞之间,vehicle-treated角细胞。因为Th1细胞显著增加MS患者与对照组相比,我们建立了Th1-polarizing条件rIL-12和anti-IL-4马伯,数据4 (b)和4 (d)表明,显著抑制角干扰素-γ( )但增加Foxp3 ( )在CD4水平⁺T细胞。CD4⁺T细胞和CD4⁺IL-17A⁺T细胞数量之间的类似斗篷,vehicle-treated T细胞。这些结果强烈表明,角是介导的抗炎功能至少部分是通过直接抑制作用的分化Th1和Treg子集,这可能会减轻运算单元在活的有机体内。

3.4。预防性治疗角严重降低实验性自身免疫性脑脊髓炎

调查的影响角运算单元,我们管理的斗篷在预防性或治疗性治疗方案和监控疾病的严重程度(图5(一个))。预防组角最初接受20或40毫克/公斤。分数在我们观察到减少实验性自身免疫性脑脊髓炎的浓度,没有进一步改善在40毫克/公斤(图5 (b))。角在20毫克/公斤因此用于后续实验。政府开始在天角0显示深远的影响在降低发病率和临床分数从21天开始显著减少。女士更贴近人类管理、治疗管理角后临床症状的出现没有好处。在实验性自身免疫性脑脊髓炎身体重量低得多的车辆组比角预处理组和治疗组角略高(表2;图5 (b))。

在实验的最后,单核细胞从老鼠脾脏和中枢神经系统收集的下角和车辆预防性治疗方案,和不同T细胞谱系的百分比确定。符合在体外发现,治疗显著降低的水平角Th1细胞在脾脏和中枢神经系统,并增加Treg数字在中枢神经系统(图中被发现5 (e))。汽车组相比,治疗组角表现出温和的炎性细胞和小胶质细胞/巨噬细胞浸润在脊髓(数字5 (c)和5 (d))。此外,脱髓鞘和他在海角分数显著降低治疗组比汽车集团(图5 (e))。

4所示。讨论

我们目前的研究显示角的治疗潜力在缓解疾病发病和严重程度通过Th1渗透抑制模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎,巨噬细胞和小胶质细胞激活,在中枢神经系统和白细胞招聘。一致,Ilhan等人所做的一项研究表明,角,降低氧化组织损伤可以预防实验性自身免疫性脑脊髓炎通过阻止活性氧(ROS)生产和NF -κB激活(10]。激活巨噬细胞和小胶质细胞活性氧的主要来源是在中枢神经系统,从而在其中扮演着重要的角色在免疫反应和组织损伤加重。在我们的研究中,角治疗有效地抑制这些细胞的激活,这有助于解释的治疗价值报道Ilhan等。此外,角被发现表达下调诱导的分泌一氧化氮合酶(间接宾语),cyclooxygenase-2,一氧化氮在LPS-stimulated小胶质细胞在体外(11),这表明角可能是一种强有力的抗氧化剂。

比较CSF细胞因子/趋化因子水平之间复发患者疾病检测不到发炎和其他迹象显示女士的干扰素-γ典型的Th1细胞因子,显著增加的女士。然而,Th17细胞因子的水平,如IL-17 IL-21,和il - 22生成时,并没有增加,这与先前的发现是一致的(12- - - - - -14]。在最近的一份报告中,干扰素-γ被发现增加患者的CSF MS,而增加IL-17检测血清中(14),这表明Th1反应起着更重要作用在编排女士的免疫病理过程级联。由于CD4⁺T细胞可以分化成各种子集具有独特的免疫能力,表达下调的频率致病性Th1 / Th17人口虽然最大限度地扭转抗炎子集是一个合理的策略当女士治疗(15]。我们的在体外和在活的有机体内研究结果表明,角能够减少的百分比Th1细胞在不改变CD4的百分比⁺T细胞和Th17细胞。一致,蔡等人观察到显著降低干扰素水平角-γ,而Th17和Th2细胞因子不影响在一个实验性自身免疫性uveoretinitis模型(8]。相比之下,王等人的研究表明,抑制角不仅干扰素-γ生产CD4⁺T细胞刺激通过CD3和CD28抗体也IL-5健康受试者和哮喘患者(16]。在我们的在体外发现,在Th0和Th1-polarizing条件下,斗篷管理显著改善CD4的比例⁺Foxp3⁺T细胞在体外。在运算单元模型中,T细胞群的频率,称为亚群,也是中枢神经系统的调节。我们的研究结果强调的重要性在角调节T细胞的活化和分化,这可能有助于在MS患者的管理。需要进一步调查的确切机制调节这些T细胞角子集。

与早期的发现一致(9),有效地抑制角ConA-stimulated T细胞增殖在体外。有趣的是,一项研究报道,ConA诱导T细胞增殖显著增加小鼠接受20毫克/公斤角两周(11]。此外,增加CD4的比率⁺/ CD8⁺T细胞是指出CAPE-treated组相比汽车组(9),这与我们的发现和其他团体的冲突(7]。我们假设的差异可能是由于研究老鼠的基本状态。评估角对免疫细胞的影响在健康动物将会是很有趣的。此外,激活T细胞诱导的细胞受体和costimulatory分子立即促进许多转录因子的活动,包括NF -κB家族(17]。越来越多的证据表明,抑制NF -κB可能通过改变改善实验性自身免疫性脑脊髓炎周边和中枢神经系统T细胞渗透、影响T细胞增殖,扭曲的T细胞对non-Th1 / Th17表型(18- - - - - -20.]。此外,许多天然化合物已确定NF -至少部分目标κB途径和表现出有前途的治疗潜力[在治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎21,22]。我们的数据表明,政府减少了角核易位NF -κB p65。除了NF -κB的核转录因子激活T细胞(NFAT),参与调节基因表达,包括干扰素-γ最近发现一个目标角的马尔克斯et al。9]。

我们的研究也有一些局限性。首先,健康的生物抑制T细胞活动可能导致负面影响如持续感染,癌症和自身免疫。因此,其他器官的正常免疫反应是否受损角治疗期间应考虑在同一时间。第二,尽管免疫荧光数据表明,角可能抑制NF -的核易位κB p65,免疫印迹将是一个更好的方法来证实这一结论。第三,如果淋巴细胞/ T细胞角的影响需要进一步调查。

总之,我们的结果表明,角展示强大的抗炎和免疫调节作用,抑制NF -κB细胞激活和T细胞活性,在实验性自身免疫性脑脊髓炎暗示的可能性使用角作为免疫调节代理女士治疗。

数据可用性

研究数据用于支持本研究的发现是包含在这篇文章(表、数据)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

周一帆和王Jingqi co-first作者。

确认

我们感谢yap燕教授的帮助下,生命科学学院,陕西师范大学,他支持实验。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(# 81771300,# 81971140),广东省自然科学基金(# 2017 a030313853)和广州市科技计划项目(# 201904010444)。

补充材料

角的化学结构。(补充材料)

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