通过CSF1R Rh-CSF1变弱氧化应激和神经细胞凋亡/ PLCG2 / PKA / UCP2信号通路在新生儿HIE的大鼠模型

文摘

氧化应激(OS)和神经元细胞凋亡是主要病理过程缺血脑病(HIE)之后。集落刺激因子1 (CSF1)、绑定CSF1受体(CSF1R),已经被证明可以减少神经元损失后hypoxic-ischemia——(HI)引起的脑损伤。在目前的研究中,我们假设CSF1可以缓解OS-induced神经元变性和凋亡通过CSF1R / PLCG2 / PKA UCP2在老鼠模型信号通路的嗨。总共127为期十天的雄性sd大鼠中幼崽。嗨被右颈总动脉结扎诱导与随后的接触缺氧为2.5 h。外源性重组人类CSF1 (rh-CSF1)在鼻内接种1 h和24 h后嗨。CSF1R抑制剂、BLZ945或磷脂酶C-gamma 2 (PLCG2)抑制剂,U73122,腹腔内注射在1 h嗨感应。脑梗塞体积测量、避崖测试、扶正反射测试,双重免疫荧光染色法,免疫印迹评估,8-OHdG MitoSOX染色,Fluoro-Jade C染色法和TUNEL染色。我们的研究结果表明,内生CSF1的表情,CSF1R, p-CSF1R, p-PLCG2, p-PKA,解偶联实验研究(UCP2)嗨后增加。CSF1 CSF1R表达在神经元和星形胶质细胞。 Rh-CSF1 treatment significantly attenuated neurological deficits, infarct volume, OS, neuronal apoptosis, and degeneration at 48 h after HI. Moreover, activation of CSF1R by rh-CSF1 significantly increased the brain tissue expressions of p-PLCG2, p-PKA, UCP2, and Bcl2/Bax ratio, but reduced the expression of cleaved caspase-3. The neuroprotective effects of rh-CSF1 were abolished by BLZ945 or U73122. These results suggested that rh-CSF1 treatment attenuated OS-induced neuronal degeneration and apoptosis after HI, at least in part, through the CSF1R/PLCG2/PKA/UCP2 signaling pathway. Rh-CSF1 may serve as therapeutic strategy against brain damage in patients with HIE.

1。背景

新生儿缺血脑病(HIE)是一种破坏性疾病的高发病率和死亡率。糟糕的结果的主要原因是在婴儿和导致终生的神经发育障碍,如脑瘫、认知障碍、视觉障碍、听觉障碍和癫痫(1- - - - - -3]。目前,目前仍缺乏有效的治疗方法为催促。

在过去的几十年里,研究人员划定许多病理机制,导致脑损伤,如炎症、氧化应激(OS),血脑屏障功能障碍,和细胞凋亡4]。操作系统的主要病理事件在许多神经系统疾病的发病机制5,6]。活性氧(ROS)产生有毒副产品的有氧代谢。的生产和解毒ROS是紧平衡的在正常情况下。操作系统时出现ROS的生成超过抗氧化剂清除系统的能力,这被认为是一个重要的病理因素导致衰老和疾病(7]。先前的研究表明,活性氧诱导细胞凋亡增加p53和细胞色素c的释放,减少Bcl2,激活caspase-9 caspase-3 [8,9]。缺血性脑损伤后,生产过剩的活性氧不仅直接受损的神经元,导致神经元凋亡,还间接导致神经元变性通过调节线粒体通路,DNA修复酶,和转录因子10]。在许多因素参与新生儿HIE的发病机理11),操作系统在神经变性和细胞凋亡中起着至关重要的作用[12- - - - - -14]。

CSF1是由多种细胞类型,包括单核细胞/巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和骨髓基质细胞(15]。CSF1主要调节增殖、分化和存活的单核吞噬系统(如骨髓祖细胞,循环单核细胞、巨噬细胞和组织)(16),由蛋白质酪氨酸激酶受体,介导CSF1R [17]。在中枢神经系统(CNS) CSF1广泛表达于神经元,小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞18]。CSF1R表达对小胶质细胞和海马和皮层神经元在生理条件下(17]。CSF1R表达在产后早期发育的不成熟的神经元,在成年人的大脑逐渐减少(19]。在nestin-positive神经祖细胞,消融CSF1R基因导致的脑容量小,放大的神经祖细胞池,提升细胞凋亡在前脑皮质19]。此外,CSF1的表达式和CSF1R各种脑损伤后神经元深刻的增加(17,20.,21]。以前的出版物的规定主要集中在由CSF1神经炎症,但最近的研究报告对神经元细胞的保护作用。的删除CSF1R加剧细胞死亡和减少神经元生存excitotoxin-induced脑损伤(22]。CSF1发现改善浦肯野细胞的存活率,减少神经细胞凋亡在体外(23]。腹腔内注射的rh-CSF1-containing微胶囊改善神经元的存活率在缺血性脑损伤的动物模型24]。王等人发现外围CSF1管理减少凋亡神经元和神经元的存活率增加中风模型,独立小胶质细胞(17,21]。然而,特定的分子生物学机制CSF1对神经元的保护没有被报道。

CSF1 CSF1R绑定后,可以激活多个信号通路。磷脂酶Cγ2 (PLCG2)是一个下游分子的CSF1R通过磷酸化激活。CSF1R引发的研究表明,PLCG2磷酸化激活能增加Ca的快速释放^{2 +}在单核细胞和促进单核细胞的分化25]。PLCG2表达对小胶质细胞和神经元在中枢神经系统参与调节操作系统(26,27]。PLCG2激活环腺苷酸(营)反应元件结合蛋白通过激活的Ca^{2 +}信号通路诱导蛋白激酶A (PKA) (28,29日]。cAMP-PKA信号通路是一种重要的第二信使,影响多种细胞内信号转导途径,和调节蛋白质的活性和细胞功能30.]。在新陈代谢,它有一个显著的影响增长,细胞分化,细胞凋亡。PKA的磷酸化后增加缺氧缺血性脑损伤(31日,32]。激活的PKA peri-ischemic地区缺血性中风模型中扮演了一个至关重要的神经保护作用[31日,33,34通过调节星形胶质细胞的功能,恢复线粒体动力学,减少操作系统(35,36]。解偶联protein-2 (UCP2)是线粒体内膜蛋白能够调节线粒体的能量代谢,减少活性氧的生产(37,38,减轻脑损伤后的神经损伤和神经细胞凋亡和中风(39]。激活PKA改善UCP2的表达水平和抑制系统和神经元细胞凋亡在大鼠蛛网膜下腔出血后40]。

我们之前展示的antineuroinflammation影响rh-CSF1嗨(后41]。在目前的研究中,我们关注神经元的保护作用和假设CSF1变弱OS-induced神经元变性和凋亡通过CSF1R / PLCG2 / PKA UCP2信号通路在嗨(如图1)。

2。材料和方法

2.1。动物

机构批准的所有实验动物保健和使用委员会(IACUC) Loma Linda大学。所有研究进行了按照美国国立卫生研究院的指导实验室动物保健和使用的。雄性sd大鼠中母亲与10 - 12窝幼仔从Envigo购买实验室(利弗莫尔,CA)。十天的老老鼠幼仔被安置在一个环境和湿度控制,常数(25°C)温度与普通12 h / 12 h光/暗周期和随意进入水和食物。总共127只老鼠幼崽( )在这项研究中,无论性别,被随机接受虚假的( )或嗨手术( )。然而,111年7嗨老鼠被排除在研究期间或之后缺氧死亡。所有动物测试是盲目地进行的。

2.2。实验设计

2.2.1。实验我

确定内生CSF1的时间表达式,CSF1R, PLCG2, PKA, UCP2在6 h, 12 h, 24小时、48小时、72 h,和7 d后,嗨,老鼠幼崽被随机分为7组:骗局,6 h嗨,12 h嗨,24小时你好,48 h你好,72 h嗨,和7 d嗨( )。大脑样本的权利(同侧)半球收集免疫印迹评价蛋白质表达水平在不同时间点后,嗨。虚假的组的老鼠被牺牲在手术后24小时。

2.2.2。实验二世

最佳剂量(80μ克/千克)的鼻内管理rh-CSF1选择基于我们之前的研究(41]。双重免疫荧光染色法被用来评估CSF1R表达在神经元和星形胶质细胞48 h后嗨。评估系统的嗨老鼠大脑,8-hydroxy-2 - - - - - -脱氧鸟苷(8-OHdG)和MitoSOX染色后48 h在嗨。评估神经变性和细胞凋亡在嗨老鼠大脑,Fluoro-Jade C (FJC)染色和末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色进行。老鼠幼仔随机分为3组( ):骗局,嗨+车辆(车辆rh-CSF1 DDH₂O),嗨+ rh-CSF1。所有三组都牺牲在手术后48 h。

2.2.3。实验3

调查的潜在机制rh-CSF1 anti-OS和凋亡的影响,BLZ945 CSF1R(抑制剂)和U73122 (PLCG2抑制剂)。组包括虚假的,嗨+车辆(车辆rh-CSF1 DDH₂O),嗨+ rh-CSF1,嗨+ rh-CSF1 + DMSO(车辆BLZ945 U73122),嗨+ rh-CSF1 + BLZ945,嗨+ rh-CSF1 + U73122与 ,6幼崽的2、3、去除氯一水(TTC)(西格玛奥德里奇Inc .)、美国)染色和免疫印迹和免疫荧光染色4幼崽。短期神经行为测试(悬崖回避试验和扶正反射试验),TTC染色、免疫印迹,FJC, TUNEL, 8-OHdG染色,MitoSOX染色后48 h在嗨。六组都牺牲在手术后48 h。

2.2.4。实验四世

调查的效率CSF1R PLCG2抑制和内源性神经保护机制CSF1 / CSF1R PLCG2 / PKA UCP2信号通路在这项研究中,BLZ945和U73122使用。组包括嗨+ DMSO(车辆BLZ945 U73122),嗨+ BLZ945,嗨+ U73122组( )。正确的(同侧)半球的大脑组织收集免疫印迹CSF1表达水平进行评估,CSF1R, p-CSF1R, p-PLCG2, p-PKA, UCP2、Bcl2,伯灵顿和caspase-3分开。所有三组都牺牲在手术后48 h。

2.3。嗨模型

新生儿嗨的动物模型进行了如前所述[42]。短暂,老鼠幼仔使用3%异氟烷和维护2.5%异氟烷麻醉手术期间。纵向中线颈部切口是在右边前的脖子,和右颈总动脉被确认,孤立的,5.0和双重结扎手术丝绸手术缝合。之间的动脉被切断结扎,过程的持续时间限制在5 - 9分钟。手术后,老鼠幼仔给定时间从麻醉恢复1 h温控加热毯子。小狗被受到2.5 h O缺氧的室为8%₂和92% N₂在37°C水浴。虚假的对待,正确的颈总动脉被曝光,但不结扎或暴露于低氧条件。缺氧后,动物们回到他们的母亲,离开孵化器的48 h。

2.4。药品监督管理局

老鼠幼崽被置于仰卧位低于2%异氟烷麻醉在1 h和24 h后,嗨,总量的5μl rh-CSF1 (80μ美国克/公斤,Abcam)或车辆(DDH₂O)是通过鼻内下降为1.25μl给每2分钟,左和右鼻孔之间的交替。BLZ945(60毫克/公斤,开曼化学、美国),U73122(30毫克/公斤,开曼化学、美国),或车辆BLZ945和U73122 (10% DMSO溶液溶解在玉米油)是经由腹腔内注射,根据先前的研究在1 h嗨感应(之前39]。

2.5。神经系统评估

嗨,48 h后短期neurobehavior测试包括悬崖回避和扶正反射测试由一名调查员失明组信息。

2.5.1。避崖测试

悬崖回避测试是由放置老鼠幼崽边缘的平台( ),前脚掌和胸部扩展到了崩溃的边缘。老鼠的延迟拒绝或退出边缘被记录。如果老鼠从平台,或者他们没有回应在60年代,延迟是记录为60年代。

2.5.2。扶正反射测试

扶正反射测试是用来记录时间的幼崽才完全翻身到四肢后放置于仰卧位。最大测试时间是60年代,60年代记载的任何录音超过60年代(3试验/小狗/天)。最后,所有这三个试验的平均值计算。

2.6。违反体积测量

在嗨48 h后神经系统测试后,老鼠幼仔transcardially灌注与深麻醉下20毫升prechilled PBS。大脑被切成2毫米厚冠状部分。大脑部分被孵化TTC 2%(西格玛奥德里奇Inc .)、美国)解决方案在黑暗中5分钟,然后用PBS冲洗(43]。脑梗死体积是量化和分析使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。梗塞的区域计算的百分比如下:[(侧半球的总面积)-(面积uninfarcted面积同侧半球)]/(总面积侧半球×2)。

2.7。免疫印迹分析

免疫印迹试验进行如前所述[44]。TTC染色法和数字拍摄后48 h后嗨,同侧和对侧的大脑部分被分为半球,提前在液态氮冷冻,并存储在冰箱−80°C,直到进一步的组织细胞溶解。侧半球样本中提取里帕裂解缓冲(美国圣克鲁斯生物技术)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒了15分钟,然后进一步离心机在4°C 14000 g 30分钟。蛋白质浓度被收集上层的决定,使用洗涤剂兼容性试验(Bio-Rad特区™蛋白质测定)。等量的蛋白质被加载到各车道的10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶。电泳后,蛋白质被转移到硝化纤维膜,阻止了5%脱脂阻塞年级牛奶(美国大力神Bio-Rad)和初级抗体孵育过夜在4°C。以下主要使用抗体:anti-CSF1 (Abcam 1: 1000年,美国),anti-CSF1R (LSBio 1: 500年,美国),anti-p-CSF1R(热费希尔科学1:1000年,美国),anti-PLCG2(罗福斯生物制品1:500年,美国),anti-p-PLCG2 (Abcam 1: 1000年,美国),anti-PKA (Abcam 1: 1000年,美国),anti-p-PKA (Abcam 1: 1000年,美国),anti-UCP2(1: 1000年,细胞信号技术。美国),anti-Bcl2 (Abcam 1: 1000年,美国),anti-Bax (Abcam 1: 500年,美国),anti-cleaved caspase-3(1: 500年,细胞信号技术,美国),和山羊反β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术1:3000年,美国)。第二天,膜被孵化与适当的二次抗体(圣克鲁斯生物技术1:3000年,美国)在室温下2 h。乐队被可视化的光学密度与ECL +化学发光试剂盒(美国Amersham生物科学)和使用图像分析软件(美国国家卫生研究院)J。

2.8。组织学和免疫组织化学

与冰冷的PBS老鼠幼仔transcardially灌注,其次是10%福尔马林在48 h后深麻醉下嗨。后缀在大脑10%福尔马林一夜之间在4°C 24 h,然后脱水在30%蔗糖在PBS溶液在4°C,直到他们沉没。大脑样本嵌入在10月后冻结在-80°C(美国Scigen科学)。冠状切片切成8 - 10μ在-20°C m厚度对免疫荧光染色使用低温恒温器(LM3050S;德国徕卡微系统)。

2.8.1发布。免疫荧光染色

免疫荧光染色总是执行(45]。30分钟的片与PBS冲洗,然后用0.3% permeabilized Triton x - 100在室温下10分钟。与PBS切片然后冲洗15分钟,5%挡着驴在室温下血清2 h。随后,每个冠状切片孵化主要抗体在4°C过夜。以下主要使用抗体:anti-neuronal核(NeuN) (1: 200 Abcam,美国),anti-glial原纤维酸性蛋白(GFAP) (Abcam 1: 200年,美国),anti-CSF1 (Abcam 1: 100年,美国),anti-CSF1R (LSBio 1: 100年,美国),和anti-8-OHdG (Abcam 1: 200年,美国)。第二天,片与PBS冲洗1 h,然后孵化与相应的二次抗体(1:150)在室温下1 h。最后,片与PBS冲洗1 h,然后覆盖着4 6- - - - - -diamidino-2-phenylindole (DAPI)(向量实验室Inc .)、美国)来显示总核。染色片可视化,荧光显微镜下拍照(徕卡DMi8、徕卡微系统公司、德国),分析了徕卡应用程序套件软件。四大鼠大脑每组数从5字段/大脑perilesion区域内进行量化分析。给出了数据的总数CSF1R-positive NeuN, CSF1R-positive GFAP、CSF1-positive NeuN,和CSF1-positive GFAP细胞每平方毫米(cell /毫米²)。数据作为8-OHdG-positive细胞的平均比率(%)。

2.8.2。MitoSOX染色

线粒体ROS水平测量使用MitoSOX红色。在黑暗中大脑切片是孵化5μ与MitoSOX mol / L(热费希尔科学、美国)10分钟37°C,然后覆盖在室温下与DAPI 5分钟。染色片可视化,荧光显微镜下拍摄和分析使用徕卡应用程序套件软件。四大鼠大脑每组数从5字段/大脑perilesion区域内进行量化分析。数据作为MitoSOX-positive细胞的平均比率(%)。

2.8.3。FJC染色

执行检测神经元退化,FJC染色使用FJC Ready-to-Dilute染色工具包(美国Biosensis)根据制造商的协议。染色片可视化,荧光显微镜下拍摄和分析使用徕卡应用程序套件软件。四大鼠大脑每组数从5字段/大脑perilesion区域内进行量化分析。给出了数据的平均数量FJC-positive细胞每平方毫米(cell /毫米²)。

2.8.4。TUNEL染色

检测神经元细胞凋亡,双重免疫荧光染色法是由嗨48 h后利用TUNEL标记(红色)和神经元NeuN(绿色)原位细胞凋亡检测设备(美国罗氏公司)根据制造商的协议(46]。染色切片的可视化和荧光显微镜下拍摄和分析了徕卡应用程序套件软件。四大鼠大脑每组数从5字段/大脑perilesion区域内进行量化分析。给出了数据的平均数量每平方毫米(cell /毫米TUNEL-positive神经元²)。

2.9。统计分析

使用SPSS统计分析完成v.21.0(美国IBM)。提出了数据 。各个组之间的差异首先比较用单因素方差分析(ANOVA),紧随其后的是多个对比组使用图基的事后分析。两组之间的差异比较使用学生的 - - - - - -测试。数据被认为是具有统计学意义 。

3所示。结果

3.1。时间进程内源性蛋白质的表达水平(p-CSF1R、CSF1R CSF1, p-PLCG2, p-PKA, UCP2)嗨

p-CSF1R的内源性表达水平、CSF1R CSF1, p-PLCG2, p-PKA, UCP2通过免疫印迹。结果表明,p-CSF1R、CSF1R CSF1, p-PLCG2 p-PKA, UCP2增加时间的方式在24 h(嗨达到顶峰后 )相比与虚假的组(图2)。

3.2。CSF1R受体的细胞表达和CSF1嗨

双重免疫荧光染色CSF1R受体或CSF1 NeuN和GFAP进行三组的骗局,嗨+车辆,嗨+ rh-CSF1。我们的研究结果表明,CSF1R和CSF1表达神经元在幼鼠从所有组48 h后嗨(图3(a))。尽管神经元数量减少,CSF1-positive和CSF1R-positive嗨+车辆组神经元增加而夏姆斯。鼻内rh-CSF1治疗减毒CSF1R-positive和CSF1-positive神经元,神经元损失和进一步增加相比,嗨+汽车集团(数字3(b)和3(c))。

在嗨,48 h后CSF1表示在星形胶质细胞在老鼠幼崽从所有三组。的星形胶质细胞表达CSF1R中没有发现夏姆斯但在嗨幼鼠(图4(a))。嗨,后与星形胶质细胞的数量增加CSF1-positive和CSF1R-positive星形胶质细胞增加而虚假的集团。鼻内rh-CSF1治疗减少了星形胶质细胞的数量,但进一步增加CSF1-positive和CSF1R-positive星形胶质细胞嗨+ rh-CSF1组相比,嗨+汽车集团(数字4(b)和4(c))。

3.3。抑制CSF1R或PLCG2废除Rh-CSF1治疗48 H后的神经保护效应嗨

确定CSF1发挥其神经保护作用通过CSF1R / PLCG2 / PKA / UCG2信号通路,BLZ945(具体CSF1R抑制剂)和U73122(具体PLCG2抑制剂)。TTC染色数据显示,鼻内管理rh-CSF1明显减少梗塞体积的嗨动物相比,嗨+汽车集团(数字5(一个)和5 (b))。BLZ945和U73122逆转rh-CSF1的有利影响,以增加梗塞的面积与相应的对照组相比( ,数据5(一个)和5 (b))。

悬崖回避试验表明,老鼠幼崽花更多时间拒绝或退出后边缘嗨与虚假的集团相比。老鼠幼崽,收到rh-CSF1显著改善性能相比,嗨+汽车集团( ,图5 (c))。然而,BLZ945或U73122显著逆转的影响rh-CSF1相比,每个相应对照组( ,图5 (c))。

扶正反射测试结果表明,老鼠幼崽后需要长时间正确定位嗨与虚假的组相比,改进的rh-CSF1治疗。然而,BLZ945或U73122显著逆转rh-CSF1的好处相比,每个相应对照组( ,图5 (d))。

3.4。Rh-CSF1政府抑制操作系统,减轻神经元变性,减少神经元凋亡通过CSF1R / PLCG2 / PKA UCP2信号通路在48 H后嗨

确定CSF1R / PLCG2 / PKA UCP2信号通路参与了潜在的神经保护机制CSF1你好后,pathway-related蛋白质的表达水平测定蛋白质印迹。与虚假的集团相比,CSF1的表情,total-CSF1R, p-CSF1R, p-PLCG2, p-PKA, UCP2和caspase-3增加裂解,但Bcl2 /伯灵顿比率明显下降后48 h嗨。Rh-CSF1治疗进一步增加CSF1的表达,total-CSF1R, p-CSF1R, p-PLCG2, p-PKA, UCP2和Bcl2 /伯灵顿的比率,但减少的表达裂解caspase-3比你好+汽车集团。CSF1R抑制剂减少p-CSF1R表达式和逆转p-PLCG2 rh-CSF1对蛋白质含量的影响,p-PKA, UCP2、Bcl2 /伯灵顿,的比例和裂解的表达caspase-3 ( ,数据6(一)- - - - - -6 (g))。p-CSF1R缺乏变化,PLCG2抑制剂减少p-PLCG2表达式也逆转的影响rh-CSF1 p-PKA后续蛋白质含量,UCP2、Bcl2 /伯灵顿,的比例和裂解的表达caspase-3 ( ,数据7(一)- - - - - -7 (g))。

进一步确定rh-CSF1治疗抑制操作系统,减轻神经元变性,并通过CSF1R减毒神经元细胞凋亡/ PLCG2 / PKA / UCP2信号通路,MitoSOX染色,8-OHdG染色,FJC染色法和TUNEL染色后48 h在嗨。与假组相比,MitoSOX, 8-OHdG,和FJC-positive细胞和神经元TUNEL-positive增加嗨,48 h后减毒的鼻内rh-CSF1管理局( ,数据8和9(一)-9(d))。CSF1R或PLCG2抑制剂废除rh-CSF1的保护作用,就是明证MitoSOX数量的增加,8-OHdG和FJC-positive细胞和神经元TUNEL-positive与相应对照组(相比 ,数据8和9(一)-9(d))。总的来说,这些结果表明,rh-CSF1治疗抑制操作系统和改善神经元生存通过CSF1R / PLCG2 / PKA UCP2嗨后信号通路。

3.5。CSF1R的影响和PLCG2抑制剂Pathway-Related蛋白表达水平后48 H嗨

进行免疫印迹在嗨嗨后48 h + DMSO(车辆BLZ945 U73122),嗨+ BLZ945,嗨+ U73122组。抑制CSF1R PLCG2 p-CSF1R的表达减少和p-PLCG2,伴随着减少p-PKA, UCP2, Bcl2,但增加了apoptotic-associated蛋白质伯灵顿和裂解caspase-3(图10)。结果证明CSF1R的效率和PLCG2抑制在这项研究也表明,CSF1 / CSF1R PLCG2 / PKA UCP2嗨后信号通路发挥了内源性神经保护作用。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们关注rh-CSF1治疗的影响在减少OS-induced嗨损伤后神经元变性和细胞凋亡。后我们的研究结果表明,(1)嗨,蛋白质的表达在CSF1R / PLCG2 / PKA UCP2信号通路时间的方式增加,达到峰值后24 h嗨。(2)嗨,导致操作系统损伤(由8-OHdG证据和MitoSOX-positive染色),重要的神经变性(FJC正面描写就是染色),和神经细胞凋亡(TUNEL-positive染色,Bcl2 /伯灵顿比率降低,并增加裂解caspase-3级别在大脑中)。(3)鼻内外源性rh-CSF1管理减少梗死面积,改善短期神经赤字,调节的蛋白质含量CSF1R / PLCG2 / PKA / UCP2信号通路。(4)CSF1R和PLCG2抑制剂逆转rh-CSF1的神经保护效应及其对蛋白质含量的影响CSF1R / PLCG2 / PKA / UCP2信号通路。这些结果表明,rh-CSF1神经保护反对OS-induced嗨后神经元变性和细胞凋亡。这样的保护,至少部分通过CSF1R / PLCG2 / PKA / UCP2信号通路。

CSF1是单程的类型我膜细胞因子,具有至关重要的作用在调节生存,增殖,分化的造血前体细胞,尤其是单核吞噬细胞,如巨噬细胞和单核细胞(16,47]。在中枢神经系统,CSF1有助于小胶质细胞的增殖和分化和小胶质细胞的发展至关重要48]。因此,CSF1参与多种中枢神经系统疾病的免疫和炎症反应,包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(49),阿尔茨海默病(AD) [18),帕金森病(50),和中风51]。通过其受体CSF1R CSF1发挥生物学作用[17]。我们之前的研究表明,CSF1及其受体表达在小胶质细胞和rh-CSF1减毒鼠模型的神经炎症治疗HIE [41]。然而,CSF1R不仅表现在小胶质细胞在神经元。CSF1和CSF1R神经元的表达水平有显著调节后的各种神经系统疾病(17,20.,52]。CSF1直接减少神经元凋亡后广告(17]。在目前的研究中,我们发现CSF1和CSF1R与神经元,还有CSF1增多和CSF1R-positive嗨后神经元。有趣的是,CSF1 CSF1R也与星形胶质细胞,嗨侮辱诱导CSF1和CSF1R-positive星形胶质细胞的数量增加。炎症监管者一样重要,星形胶质细胞产生抗炎和神经营养因子,释放大量的趋化因子调整大脑的微环境(53,54),和分泌抗氧化底物,如谷胱甘肽缓解神经损伤(55]。然而,过度的星形胶质细胞激活可能加重神经损伤通过释放促炎的因素很多,如肿瘤坏死因子-α和il - 6 (56]。Wylot等人报道,CSF1保持之间的平衡提供了一个显著的影响小胶质细胞和星形胶质细胞57]。因此,增加内源性CSF1和CSF1R表达在神经元和星形胶质细胞可能牵涉的upregulation嗨后内源性神经保护机制。在侧脑组织,CSF1内源性蛋白质含量,CSF1R, PLCG2, PKA, UCP2和增加加班后你好,建议他们嗨后发挥作用。抑制剂CSF1R和PLCG2 p-CSF1R和p-PLCG2的表达减少,伴随着减少p-PKA和UCP2在嗨。结果表明CSF1 / CSF1R PLCG2 / PKA UCP2信号通路发挥了内源性神经保护作用,但是效果并不足以改善神经损伤后嗨。外源治疗rh-CSF1 CSF1可能上调表达,进一步激活信号通路提供催促后神经保护作用。

rh-CSF1鼻内管理进一步加强CSF1高程和CSF1R神经元和星形胶质细胞,导致短期改善神经结果与梗死体积大大减少,神经元变性和细胞凋亡。我们的发现了其他的研究表明CSF1减少卒中后神经损伤,实验性自身免疫性脑脊髓炎,和广告(16,21,22]。更容易缺血神经元和化学损伤CSF1-deficient老鼠(58]。你好后,操作系统是与神经炎症显著增加,线粒体功能障碍,神经胶质/轴突诱变和突触传导障碍,导致神经元的逐步丧失包括神经元细胞凋亡(13,59]。我们的研究证实,有增加细胞OS标记MitoSOX和8-OHdG FJC——/ TUNEL-positive退化和凋亡神经元嗨perilesion大脑区域内的老鼠幼崽。同时,蛋白表达水平的裂解caspase-3都增加,但Bcl2 /伯灵顿的比例是下降的大脑组织。鼻内rh-CSF1治疗显著减毒OS标记和神经元损害,导致一种改进短期神经行为的结果。我们进一步阐明的信号通路CSF1 / CSF1R / PLCG2 / UCP2的神经保护效应使用CSF1R抑制剂和PLCG2抑制剂。

在我们的实验中,rh-CSF1 CSF1的表达水平增加,CSF1R, PLCG2磷酸化,UCP2。BLZ945 (CSF1R的特定抑制剂)或U73122 (PLCG2抑制剂)逆转的影响rh-CSF1 CSF1 / CSF1R / PLCG2 / UCP2信号。这两种抑制剂也废除了rh-CSF1的神经保护作用。PLCG2,作为经典的CSF1R下游蛋白质之一,可以与CSF1R诱导钙的释放^{2 +}(25,60]。U73122抑制磷酸化的PLCG2 Thr172,减毒的快速释放^{2 +}由CSF1人类单核细胞(25]。在中枢神经系统,PLCG2主要是小胶质细胞上表达,但也表达在神经元的齿状回颗粒细胞层61年]。PLCG2参与减轻活性氧水平,与操作系统密切相关(26,27]。其他的研究发现,PLCG2监管mTOR通过甘油二酯/蛋白激酶C信号分支,从而影响B细胞的增殖和凋亡62年]。PKA cAMP-dependent蛋白激酶,它起到了至关重要的作用在诱导细胞信号反应和调节信号转导通路。先前的研究表明,PKA提供重要的神经保护作用和减少神经元凋亡通过p38 MAPK /或分子/ BDNF分子信号通路在各种中枢神经系统状况,包括缺血性脑损伤、帕金森氏病,和广告63年- - - - - -66年]。PLCG2可以激活PKA和促进PKA的磷酸化28,29日]。莫等人表明PKA施加一个通过激活凋亡作用UCP2蛛网膜下腔出血后(40]。UCP2可以提供衰减的一个重要影响线粒体ROS水平和细胞死亡67年,68年]。增加UCP2的表达或激活会抑制神经损伤引起的操作系统在中枢神经系统疾病,如癫痫、中风、和蛛网膜下腔出血36,37,58]。UCP2也施加一个重要的神经保护作用后嗨通过操作系统通过阻止神经细胞凋亡抑制(12]。在目前的研究中,我们发现,激活CSF1R rh-CSF1增加PKA的磷酸化,UCP2的表达在老鼠大脑后48 h嗨,伴有神经功能障碍的改善,抑制OS-induced神经元变性和细胞凋亡。我们的研究结果暗示rh-CSF1减少OS-induced神经元变性和细胞凋亡在嗨,至少部分通过CSF1R / PLCG2 / PKA / UCP2信号通路。

这项研究有一些局限性。首先,CSF1也表示在星形胶质细胞和小胶质细胞。我们不能排除CSF1 / CSF1R信号的星形胶质细胞和小胶质神经元保护的贡献。第二,CSF1据说参与调节自噬的反应。目前的研究没有测量神经元自噬。未来的研究需要探索其他潜在的神经保护机制的设置rh-CSF1嗨。

5。结论

总之,鼻内管理rh-CSF1减少梗塞的面积的比例,改善神经行为赤字,和减毒OS-induced神经元变性和细胞凋亡在嗨老鼠。rh-CSF1部分介导的神经元保护通过CSF1R / PLCG2 / PKA / UCP2信号通路。这项研究提供了一个基础的翻译rh-CSF催促患者作为一个有前途的治疗策略。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

所有实验协议经IACUC洛玛连达大学,随后美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南在神经科学研究和指导方针到达。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

小胡和李案中贡献了同样的工作。

确认

这项研究是由美国国立卫生研究院的支持NS081740 NS082184约翰·h·张,拨款QNRC2016263 H201654,和GSWS2019080江苏省卫生和计划生育委员会的中国博士g .左和赠款5631[2017],[2018]5764年,[2017]5724年从贵州省级科技平台和人才中国x胡博士的团队项目。

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