文摘

介绍。钙化的主动脉瓣狭窄(骑士)是一种常见的疾病与衰老有关。氧化应激参与骑士的瓣膜钙化过程。Semicarbazide-sensitive胺氧化酶(SSAO),也称为血管粘连蛋白1 (VAP-1),变换主要胺醛,生成过氧化氢和氨。在钙化主动脉瓣SSAO表达,但它在瓣膜钙化作用仍然是未知的。本研究的目的是描述表达式和SSAO活性在主动脉瓣钙化和建立SSAO抑制人类的影响瓣膜间质细胞(VIC)钙化。方法。人类主动脉瓣 患者用于信使rna提取和表达分析、免疫印迹,SSAO活性测定,免疫组织化学,初级维克的孤立的文化。结果。SSAO信使rna、蛋白质、和活动增加与增加在人类主动脉瓣钙化和本地化附近的钙化区。分层后的瓣膜SSAO upregulation一致的受试者根据心血管和骑士与氧化应激增加有关风险因素:身体质量指数、糖尿病和吸烟。SSAO mRNA水平显著相关的聚(ADP-ribose)聚合酶1 (PARP1)钙化组织。钙化的维克被抑制在特定LJP1586 SSAO抑制剂的存在。结论。SSAO表达和协会活动与瓣膜钙化和氧化应激以及减少维克钙化SSAO抑制点SSAO作为可能的标记和治疗目标在骑士需要进一步探讨。

1。介绍

钙化的主动脉瓣可以进化成钙化的主动脉瓣狭窄(骑士),如果未经处理,会导致心脏衰竭。在缺乏医疗、当前选项严重症状骑士仅限于手术或catheter-based植入假体阀门。氧化应激可能是一个潜在的机制,增加瓣膜钙化和骑士疾病负担(1,2]。瓣膜氧化应激主导周围钙化病灶和增强了骑士的进展。急性H₂O₂全身的氧化应激和由此产生的高活性氧(ROS)水平诱导成骨细胞的分化人类瓣膜间质细胞(VIC),是主要的结构细胞的主动脉瓣3]。这些过程高度与观察到动脉粥样硬化,,例如,血管过氧化物酶1,生成酶H₂O₂,已经涉及Ox-LDL-induced钙化血管平滑肌细胞(4]。

虽然内源性底物是未知的,semicarbazide-sensitive胺氧化酶(SSAO),也称为血管粘连蛋白1 (VAP-1),是一个中介组织氧化应激和动脉粥样硬化斑块发展的贡献者5]。SSAO酶生成醛,过氧化氢(H₂O₂)和氨(NH₃)从一级胺或胺组内的蛋白质。SSAO表达式被发现在人类主动脉瓣,与重大upregulation骑士与noncalcified阀门(6]。此外,患者的血清SSAO更高水平的患者相比,严重的骑士呈现温和的骑士,与骑士严重程度显著相关评估超声心动图(7]。SSAO已经涉及多种细胞类型的分化,如软骨细胞和脂肪细胞(8- - - - - -10),但它对维克以前没有调查的影响。

SSAO作为心血管风险因素特别是肥胖患者(11]。SSAO预测九年制绝对主要心血管事件的风险增加和心血管死亡率> 50岁。此外,血清SSAO活性增加类型I和II型糖尿病患者与非糖尿病患者相比对照组(12]。同时,nicotine-enhanced氧化应激通过SSAO报道导致吸烟的负面影响(13]。因为肥胖、糖尿病和吸烟也主要风险因素的发生率骑士(14- - - - - -16),SSAO出现作为动脉粥样硬化血管疾病的共同危险因素和骑士。

综上所述,上述观察结果收敛于假设通过SSAO氧化应激可能是与骑士和可能代表一种新颖的目标发展anticalcification疗法。因此本研究的目的是:(1)确定SSAO表达式和活动与人类主动脉瓣钙化的程度,(2)建立心血管风险因素是否影响SSAO upregulation在瓣膜钙化,和(3)识别潜在SSAO之间的相关性和其他氧化应激通路。最后,我们的目标(4)确定SSAO在瓣膜钙化的作用通过评估的潜力SSAO抑制抑制人类维克钙化。

2。材料和方法

2.1。人类主动脉瓣

人类主动脉瓣获得80例主动脉瓣置换术手术在斯德哥尔摩卡罗林斯卡大学医院,瑞典。这项研究是由当地伦理委员会批准(2012/1633),所有患者知情同意。

2.2。样本收集和宏观解剖

立即手术切除后,阀门都沉浸在RNA后(试剂盒)和储存在4°C,直到传输到实验室。免疫印迹和SSAO活性决定阀门收集在苯酚red-free DMEM补充10%胎牛血清的边后卫,解剖,储存在-80°C。相邻的块被嵌入在石蜡进行组织学分析。执行宏观解剖将每个阀门分为健康、增厚、钙化区域如前所述[17- - - - - -19]。

2.3。阀mRNA表达

总RNA从主动脉瓣孤立使用RNeasy脂质组织迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。量化和RNA的质量评估使用NanoDrop(美国马热科学、沃尔瑟姆)和2100生物分析仪(美国安捷伦,圣克拉拉,CA),分别。阀基因表达数据获得了使用基因芯片Affymetrix人类转录组2.0 (HTA 2.0数组,圣克拉拉、钙、美国)和归一化信号空间transformation-robust multi-chip分析(SST-RMA)使用表达式控制台(美国Affymetrix,圣克拉拉,CA) (18]。

2.4。免疫印迹和SSAO活性匀浆

组织标本的人类主动脉瓣在液氮使用称重和碎BioPulverizer (Biospec)。样本悬浮在20μl不1毫米₂阿宝₄/ Na₂HPO₄包含250毫米,pH值7.4 (NaPi缓冲)蔗糖每毫克的组织。组织匀浆在600 x离心机5分钟在4°C,和上层清液储存在-80°C到使用。蛋白质浓度测定用直流试验(Bio-Rad牛丙种球蛋白,S60)根据制造商的协议。吸光度是阅读在750 nm FLUOstar®最适条件(BMG) 413 - 0149。

2.5。SSAO活性

SSAO活性的测量分析了H₂O₂荧光的方法生产的改编自松本et al。20.),使用苄胺作为底物。组织匀浆(20μg蛋白质/)在复制preincubated没有或存在SSAO抑制剂氨基脲(250μ米,σ)15分钟37°C反应总量的50μl包含40毫米NaPi缓冲区,1毫米优降宁(σ),1合国际单位/毫升,80 nM Amplex红(分子探针)。然后,SSAO衬底苄胺(500μ米,σ)补充道。孵化进行1 h在37°C。H₂O₂作为标准曲线来确定生成的数量在每一个条件。的荧光强度是衡量FLUOstar最适条件(413 - 0149)荧光标使用励磁563海里和荧光检测587海里。SSAO特定活动,过氧化氢的数量发现与苄胺氨基脲的存在是相对于过氧化氢生成苄胺的氨基脲的缺席。

2.6。免疫印迹

组织匀浆(10μg)变性在加载缓冲区(Laemmli样本缓冲区,BioRad) 5分钟在95°C和加载页面上一个丙烯酰胺SDS /凝胶(Bio-Rad) Mini-PROTEAN利乐细胞(Bio-Rad)。解决蛋白质随后转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)和一个迷你Trans-Blot模块。细胞膜被封锁在室温下1 h (RT)在0.1%渐变20 TBS缓冲区(10毫米Tris-Base氯化钠和15毫米,pH值7.5)含5%脱脂奶粉和孵化主要抗体(兔子anti-SSAO、克隆H43和反β肌动蛋白,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、美国TX)阻碍解决方案。几个洗后,膜是潜伏在一个适当的辣根过氧化物酶-(合)耦合的二次抗体(anti-mouse或anti-rabbit免疫球蛋白,通用电气医疗集团,芝加哥,美国)在屏蔽解决方案1 h rt,洗后,使用化学发光的蛋白质乐队是可视化工具包(Immun-Star™WesternC™化学发光设备,Bio-Rad)富士胶片上的发光图像分析仪LAS4000系统。图像分析与多计v3.0程序执行。

2.7。组织学和免疫组织化学

主动脉瓣部分来源于4患者deparaffinized甲苯、水分在降低乙醇浓度(100%,95%,50%),和之前在蒸馏水冲洗用茜素红钙化的组织化学检测。免疫组织化学,deparaffinized部分被孵化TBS-T 0.05% / 3% H₂O₂阻止内生氧化酵素。非特异性的网站被封锁在TBS-T 0.05% / 5% BSA(牛血清白蛋白)。主要的部分被孵化anti-SSAO抗体(H-43、圣克鲁斯生物技术、sc - 28642)在一夜之间在4°C。经过几个洗TBS-T 0.05%,部分与生物素化的孵化驴anti-rabbit二级抗体在RT(杰克逊ImmunoResearch)一小时,其次是链霉亲和素/合解决方案(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)10分钟,轻拍(3 3 - - - - - -diaminobenzidine)(向量实验室,sk - 4100)。最后,有些部分与苏木精counter-stained(向量实验室,h - 3404)一分钟,观察到在一个Eclipse Ci-S, 403116显微镜(尼康)。

2.8。维克隔离

人类主动脉瓣 患者使用酶消化16 h鸡尾酒含胶原酶I和II dispase如前所述[18]。孤立维克被播种到聚苯乙烯组织培养容器和培养在DMEM补充10%的边后卫,青霉素100单位/毫升,100年μ丙酮酸钠g / ml链霉素,1毫米,10毫米玫瑰,谷酰胺和2毫米。培养基是改变了每隔一天。段落之间的细胞用于实验1和3。细胞培养试剂购自Gibco,塑料被从康宁如前所述18]。

2.9。维克钙化

测量的在体外钙化,维克被播种在96孔板和孵化标准介质或成骨的介质包含2.8毫米无机磷酸盐(π)。细胞治疗的具体SSAO抑制剂LJP1586 (1μ米)。中改变了每隔一天八九天。在最后介质变化,800 nM IRDye cw BoneTag光学探针(LI-COR,糟糕的小礼帽,德国)被添加到所有媒体,和维克孵化24小时。与PBS细胞被洗了三次,随后扫描板的奥德赛CLx近红外(NIR)荧光成像仪,和获得的图像量化使用图像工作室软件版本5.2 (LI-COR,糟糕的小礼帽,德国)。

2.10。维克TaqMan实时聚合酶链反应

的信使rna逆转录隔绝维克都使用了高容量RNA-to-cDNA工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)如前所述[21]。定量实时PCR进行Quant7快速实时PCR系统(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)使用TaqMan Assay-on-Demand Hs00907290_m1(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)SSAO。相对目标基因的mRNA表达是量化的方法使用TaqMan Assay-on-Demand Hs99999905_m1 GAPDH作为内生控制。

2.11。统计分析

结果表示为 。统计学意义是评估一个——或双向方差分析重复测量紧随其后Holm-Sidak事后测试多个比较。SSAO mRNA水平比较的不同子组分层后根据BMI,糖尿病,吸烟,使用双向方差分析考虑分层组和类型的组织(健康、中间、钙化组织)。建立了相关性使用枪兵的相关性。统计学意义被分配 。正确的单变量分析多个测试,我们实施了Bonferroni-corrected意义阈值为0.007(即。,0.05/7的单变量分析)。统计分析使用SigmaPlot 12.5 (Systat软件公司,美国)。

3所示。结果

3.1。SSAO表达式,活动,人类阀门和本地化

的水平从人类主动脉瓣来源于SSAO信使rna 患者骑士图所示1(一)。SSAO mRNA表达明显,逐步调节与健康相比,在中间和完全钙化的主动脉瓣(图1(一))。SSAO蛋白质含量测量的阀门 骑士的病人都遵循同样的模式表达式(图1 (b))。钙化地区SSAO活性显著增加 人类主动脉瓣(图1 (c))。免疫组织化学分析显示在阀门来源于SSAO染色 骑士的病人(图1 (d)),最突出的信号接近茜素红点的钙化阀门区域(图1 (e)左面板)。

3.2。瓣膜SSAO mRNA表达与肥胖、糖尿病和吸烟

出了 骑士病人捐赠主动脉瓣mRNA决定,9正常体重的患者(体重指数:18.5 -25公斤/米²),33例超重(BMI: 25 - 30公斤/米²),和13是肥胖(BMI: > 30公斤/米²)。十四2型糖尿病患者和没有有1型糖尿病。有一个当前吸烟者,29患者前吸烟者和25例从不吸烟。根据BMI(图分层的病人2(一个)2型糖尿病(图),普遍2 (b)(图)和吸烟2 (c))透露,而显著变化的组织(健康、中间、钙化组织)被保留,未发现在统计上有显著差异的SSAO表达式之间的不同的子组。

3.3。SSAO表达式与氧化应激的途径

SSAO mRNA表达的相关分析与其他通路与氧化应激相关的执行 人类与不同程度的主动脉瓣钙化患者来自骑士( )和主动脉瓣返流( )。虽然单变量分析表明显著相关性与可溶性SSAO丝氨酸hydroxymethyltransferase 1 (SHMT1)以及超氧化物歧化酶2和3 (SOD2和3)在健康组织,这些相关性是显著后修正多重比较(表1上面一行)。然而,相关性与细胞色素b - 245, SSAOα多肽(CYBA)和SOD3 Bonferroni-corrected统计学意义阈值( )在中间组织(表1中间行)。然而,这些相关性不显著钙化组织。相比之下,保利SSAO显著相关性(ADP-ribose)聚合酶1 (PARP1)钙化组织(表1底下一行)。

3.4。在维克钙化SSAO抑制效果在体外

维克的主要文化孤立的从主动脉瓣 骑士48 h后病人SSAO mRNA表达的文化没有( )和存在( )高浓度的磷酸盐在生长介质(2.8毫米)。此外,SSAO活性在维克发现培养在两个条件下,和维克SSAO活性抑制70%的特定SSAO抑制剂LJP1586 (1μ米)。当维克隔绝 骑士患者高磷条件下培养,钙化明显减少了LJP1586 (1μM;图3)。

4所示。讨论

这是第一个报告显示一个渐进和显著增加SSAO信使rna,蛋白质,和活动在人类主动脉瓣,分为健康,中间,和钙化的组织。与瓣膜钙化的SSAO upregulation心血管和骑士的独立风险因素:肥胖、糖尿病和吸烟。此外,SSAO表达显著相关通路的氧化应激也透露,,特别是与PARP1钙化组织显著相关。最后,我们表明,抑制SSAO活性降低维克钙化在体外。综上所述,这些研究结果表明SSAO之间的联系,氧化应激,主动脉瓣钙化和指向SSAO抑制作为一个公认的治疗方法探索预防阀门钙化和骑士的进展。

逐步upregulation SSAO与主动脉瓣钙化的发展支持的观测数据在本研究瓣膜mRNA的表达。这是确认通过免疫印迹蛋白质表达,表现出类似的模式与更高水平的钙化部分。免疫组织化学分析也支持本地化SSAO表达在靠近主动脉瓣钙化区域的组织。后者发现证实先前的结果发现SSAO调节在钙化狭窄的主动脉瓣(6]。此外,我们的研究结果扩展观察显示钙化阀也增加了SSAO活动组织。我们表明,SSAO存在和功能在健康领域的骑士阀门。意味着特定SSAO活性约800 pmol / h /毫克,这大约是3到4倍而从人类股膝关节软骨9]。此外,我们表明,人类主动脉瓣钙化部位表现出5.7倍SSAO活性健康部分相同的阀门相比,支持SSAO mRNA和活动增加骑士疾病进展。事实上,强劲增加SSAO表达式和活动也被描述在其他疾病,如人类膝关节骨关节炎(9]。

当表达和活性组织,SSAO产生H₂O₂因此导致当地的氧化应激。SSAO也增加了在一些疾病增加系统性氧化应激。有趣的是,肥胖(11,14,22)、糖尿病(12,15),和吸烟16,23)都是心血管疾病的风险因素的例子与增加SSAO表达式和事件的风险增加骑士。然而,在目前的研究中,我们没有发现任何显著变化模式的瓣膜SSAO mRNA表达分层根据BMI后,普遍存在糖尿病,或吸烟状态,这表明SSAO mRNA的观察upregulation钙化并不影响系统增加氧化应激状态。

SSAO还与其他通路有关氧化应激(24- - - - - -26]。在目前的研究中,我们表明,SSAO与氧化应激通路的相关性是不同的在不同疾病阶段。而没有明显的相关性被发现在健康阀组织,我们确定CYBA和SOD3 mRNA水平是显著相关SSAO mRNA在瓣膜钙化的中间阶段。CYBA,也称为p22phox,过氧化物生成NADPH氧化酶是一个重要的组成部分(Nox)复杂,增加成骨细胞在钙化病灶(27]。缺乏相关的SSAO Nox4在当下研究支持钙化过程中氮氧化物微分调节亚基(27]。令人惊讶的是,SSAO明显与SOD3在中间而不是钙化阀组织,这可能代表一种防御机制。SOD3和过氧化氢酶表达下调与主动脉瓣钙化和骑士(28]。事实上,SOD3和过氧化氢酶adenoviral转染维克重建受损的DNA损伤反应,减少早期标志物维克激活(28]。SOD3歧化作用因此需要伴随的过氧化氢酶降解H₂O₂为一个完整的抗氧化效果。抑制其他H₂O₂一代SSAO可能会限制氧化应激在骑士。重要的是,SSAO表现出显著相关性只有PARP1钙化瓣膜组织。PARP1核酶激活DNA链断裂和氧化应激。有趣的是,在骑士PARP1与疾病严重程度,引起炎性刺激人类的维克(29日]。PARP1可能直接参与软组织钙化通过释放细胞外聚(ADP-ribose)氧化反应和/或DNA损伤(30.]。

添加H₂O₂Pi-induced钙化模型进一步增加钙沉积在体外,维克源自钙化阀门更容易受到氧化应激与维克从健康的阀门3]。氧化应激诱发Runx2的表达,成骨细胞的转录因子(27成骨的条件下),表达了维克(31日]。背后的机制来确定观察到协会SSAO表达式与瓣膜钙化,我们终于在维克SSAO mRNA表达和展示活动,抑制SSAO维克的LJP1586减少钙化在体外。这些发现符合研究SSAO表达在软骨细胞,由LJP1586肥厚性分化的延迟,响应,是伴随着低表达的钙化标记如碱性磷酸酶、骨桥蛋白、MMP9。这些发现表明,抑制SSAO阀门可能会减缓矿化过程。

本研究的一些局限性必须承认。SSAO表达在人类主动脉瓣的观测数据不能确定因果关系的发现。我们也可以不排除与PARP1 SSAO的相关性和其他氧化应激的标记不依赖于未知的协变量。最后,我们不能排除的表达SSAO主动脉瓣的其他细胞,如内皮细胞和树突细胞(32),可能导致疾病进展。

5。结论

这项工作提供了证据表明,除了作为一个可能的疾病标记,SSAO可能涉及瓣膜钙化的机制。这可以提供一个新的治疗角度来看骑士。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

马格努斯是一位受奖者的古腾堡主席卓越地区大Est和Eurometropole de斯特拉斯堡。资助的这项研究进一步老化的创新与研究(AGIR)计划在正常和病理衰老与南希的大学医院,洛林大学的洛林地区(通过操作程序FEDER-FSE洛林等地块孚日2014 - 2020年),和南希的城市社区。支持SCP教授奶奶Svartz基础。MB支持瑞典研究理事会(批准号2019 - 01486),瑞典的心脏,肺基金会(批准号20180571),国王古斯塔夫V和维多利亚女王共济会基金会,斯德哥尔摩郡议会(批准号20170365),和玛丽安和马库斯•瓦伦堡基金会(批准号2015.0104)。亚足联由弗雷德里克·Lundberg先生捐款支持。我们感谢教授Sirpa Jalkanen LJP1586慷慨的礼物。