超表达mir - 506 - 3 - p加剧DBP-Induced睾丸在大鼠氧化应激表达下调ANXA5通过Nrf2 / HO-1信号通路

文摘

背景。Di-N-butylphthalate(菲律宾)是一种独特的内分泌毒性与荷尔蒙分泌,影响男性生殖系统和引发了越来越多的关注。然而,DBP-induced睾丸损伤的机制仍不清楚。在这里,本研究的目的是调查的潜在分子机制mir - 506 - 3 - p在DBP-induced鼠睾丸氧化应激损伤通过ANXA5(膜联蛋白A5) / Nrf2 / HO-1信号通路。方法。在活的有机体内,共有40个青春期雄性老鼠从治疗2周和800毫克/公斤/天在类似1毫升/公斤玉米石油管理每日口服填喂法。其中,一些老鼠皮下注射2 nmol agomir - 506 - 3 - p和/或10 nmol重组鼠ANXA5。睾丸组织的pathomorphological变化被组织学检查,评估和抗氧化的因素进行评估。随后,ANXA5 Nrf2,及其相关的抗氧化酶,如HO-1 NQO1、销售税,被免疫印迹和免疫组织化学染色检测。在体外,TM3细胞(睾丸间质细胞)是用于检测细胞活性的CCK-8和转染DBP-treated组。结果。之间的差异表达microrna DBP-treated和正常老鼠进行了分析,并存在显示mir - 506 - 3 - p DBP-treated老鼠的睾丸组织中高度表达。DBP-treated老鼠提出严重的炎性浸润,增加不正常的生殖细胞,和错过了细胞层经常存在于细精管,导致氧化应激,降低睾丸功能。同时,upregulation mir - 506 - 3 - p加剧了上述变化。此外,mir - 506 - 3直接绑定到ANXA5 - p,和超表达mir - 506 - 3 - p可以减少ANXA5表达的蛋白质含量也减少Nrf2 / HO-1信号通路。此外,我们发现重组鼠ANXA5逆转DBP-treated睾丸氧化应激促进损伤mir - 506 - 3 - p的老鼠。在活的有机体内结果复制在在体外实验。结论。本研究提供的证据表明,mir - 506 - 3 - p可能加剧DBP-treated睾丸氧化应激损伤在活的有机体内和在体外通过抑制ANXA5表达和表达下调Nrf2 / HO-1信号通路,这可能在DBP-induced睾丸损伤的治疗提供新的理解。

1。介绍

作为一种邻苯二甲酸酯(PAEs) Di-N-butylphthalate(菲律宾)在全球范围内用于工业产品(1,2]。2015年,年生产邻苯二甲酸酯在5 - 8全世界几百万吨的范围(3]。然而,菲律宾会导致周围的土壤和大气的污染通过连续浸出塑料矩阵与其共价的边界,导致人类摄入(4,5]。长期接触能引起类似严重伤害到各种器官,特别是生殖系统(6,7]。关键产妇接触类似和雄激素干扰之间的关系已经有据可查的男性婴儿(7]。睾丸细胞发育异常,异常胆固醇运输和类固醇生成和低睾酮生产伴随着男性征丧失已报告在啮齿动物产前暴露于菲律宾的8- - - - - -12]。此外,子宫内暴露在胚胎将破坏尿道的形成与生殖结节的分化和发展,导致一系列的先天性畸形包括尿道下裂、隐睾症,等等13,14]。因此,知识有限的生理毒性和生态毒性在菲律宾,这是值得深入研究人类生殖系统损伤,这种损伤的具体机制。

先前的研究已经表明菲律宾可以诱导氧化应激在活的有机体内(15,16]。转录因子核转录因子erythroid-related因子2,也略Nrf2,是抗氧化的主要监管者课程(17,18]。通过把细胞核,然后结合抗氧化反应元素(是),Nrf2触发下游内源性抗氧化基因的转录,包括但不限于血红素加氧酶1 (HO-1),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化还原酶1 (NQO1)和得罪伤害引起的氧化应激(19,20.]。更重要的是,我们已经验证了这个结论的在体外与菲律宾政府在小鼠睾丸睾丸间质细胞,发现氧化应激中扮演了重要角色的伤害来自菲律宾和承诺提供预防措施,其毒性减少Nrf2 / HO-1途径[的蛋白表达水平21,22]。

微rna (microRNA的),作为一个分支的小非编码rna (ncRNAs),参与转录后的基因表达的调节通过绑定目标mRNA (23,24]。越来越多的研究表明,microrna在各种病理生理过程(扮演至关重要的角色25,26]。同时,先前的研究已经发现这些老鼠暴露在菲律宾之间不同的microrna表达和正常大鼠(27,28]。然而,机制如何microrna的功能,尤其是在DBP-induced睾丸损伤的发展,尚未阐明。,我们开创了表达谱的研究,生物调节,和详细的分子机制的一种新的识别microrna (mir - 506 - 3 - p)在DBP-induced睾丸损伤。丰富的实时PCR(存在)化验证实的表达水平显著调节mir - 506 - 3 - p DBP-mediated睾丸损伤。此外,我们的研究结果表明,mir - 506 - 3 - p的表达下调ANXA5通过Nrf2 / HO-1信号通路在老鼠和小说提供了一个潜在的治疗目标DBP-induced睾丸损伤。

2。材料和方法

2.1。动物和实验协议

所有在实验动物进行的程序,协议是动物研究的伦理委员会批准在动物保健设施南京医科大学(南京、江苏、中国)。研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。40青春期男性Sprague-Dawley (SD)大鼠(180 - 220 g)岁时平均6周大是购自南京医科大学动物实验中心(南京、江苏、中国)。这些动物被保持在室温下( ),相对 湿度自动控制的12小时光/暗周期环境。除此之外,这些老鼠提供丰富的颗粒食物和水在这个实验。

2.2。动物治疗

青少年雄性SD大鼠被安置在一个恒定的温度,与12:12 h明暗周期和免费获取水和啮齿动物的食物。所有协议都是动物实验的伦理委员会批准的南京医科大学(中国南京)。菲律宾(Sigma-Aldrich;圣路易斯,密苏里州,美国)悬浮在玉米油(车辆控制、99.5%纯溶剂厂、上海、中国)填喂法。填喂法类似剂量和时间窗的选择是根据我们之前研究管理(26]。雄性SD大鼠随机分为5组( )和玉米油管理(车辆控制)或从2周类似800毫克/公斤/天在类似1毫升/公斤玉米油管理每天口服填喂法。治疗2周后,所有老鼠的睾丸很仔细,甲醛和睾丸之一是存储在4%,另一个是保持在-80°C对后续生化措施。此外,精子是孵化与BSA 5%生理盐水进行进一步分析。

2.3。细胞培养和转染

小鼠睾丸间质TM3细胞系细胞获得银行的中国科学院(中国上海)。TM3细胞培养在杜尔贝科的修改鹰和火腿的F12(测距装置/ F12 1: 1、 )德国媒体(PAA)和10%胎牛血清(PAA)。0、5、10、50毫克/毫升菲律宾准备和溶解在二甲亚砜(DMSO,σ,美国)。然后,这些细胞,分别用1μl菲律宾每1毫升培养基稀释剂,稀释剂类似的总量在每个保持一致。此外,转染了的表达水平上调mir - 506 - 3 - p。短暂,溶解mir - 506 - 3 - p模仿或消极控制模拟Opti-MEM分开。解决方案是在室温下平衡5分钟。然后,根据制造商的协议,每个解决方案结合Lipofectamine 3000转染试剂,轻轻混合解决方案允许形成抑制剂脂质体20分钟。

2.4。细胞生存能力分析

细胞(10⁴细胞/)被镀到96 -圆底板块和菲律宾在不同处理浓度。24小时后,细胞计数Kit-8 (CCK-8)试剂(Dojindo实验室、熊本、日本)被添加到每个孵化2 h。450纳米的吸光度测量使用标(Tecan、Mannedorf、瑞士)。最后,细胞生存能力(%)是由一个特定的计算公式: 。对照组的细胞生存能力是调整到100%。

2.5。抗氧化能力测定

水平的丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(谷胱甘肽),以及减少谷胱甘肽是由使用每一个分析工具(南京建成生物工程研究所,中国),根据制造商的指示。

2.6。活性氧(ROS)水平检测

ROS水平进行了分析使用原位dihydroethidium(美国Sigma-Aldrich她)荧光。被甲醛固定后,细胞被孵化与她轻防护,调湿室在室温下,然后,细胞核与DAPI染色。ROS是在荧光显微镜下观察(Eclipse Ti-SR、尼康有限公司、日本),和图像中检测出任意单元的密度每平方毫米场荧光分光光度计。

2.7。microrna的微阵列分析

根据制造商的指示,总RNA样本DBP-treated组和正常组大鼠( )孤立使用试剂盒试剂(美国表达载体)和纯化使用RNeasy迷你包(试剂盒,德国)。层次聚类进行显示的microrna的表达分析中样品。

2.8。预测目标microrna和Dual-Luciferase记者分析

上面的目标microrna ANXA5验证筛选的“miRDB”,“TargetScan”和“母星”数据库,和每个目标microrna的必须在至少两个搜索数据库。建立包含野生型质粒mir - 506 - 3 - p - anxa5 (wt-Luc-ANXA5)响应元素和相应的突变(mut-Luc-ANXA5),空白质粒从RiboBio购买。有限公司(广州)。Cotransfecte质粒DNA (wt-Luc-ANXA5 mut-Luc-ANXA5)和mir - 506 - 3 - p模仿或数控模拟成TM3。最后,荧光素酶活性与Double-Luciferase记者分析工具,从Promega购买生物技术有限公司有限公司(中国,北京)和使用Dual-Light化学发光报告基因分析系统(贝特,德国)评估萤火虫荧光素酶的活动。

2.9。组织学检查

睾丸组织样本在24小时4%的多聚甲醛固定,脱水,嵌入在石蜡,切割5点μm,与苏木精和伊红染色。接下来,部分标准光学显微镜下进行评估(奥林巴斯BX-51、东京、日本)对睾丸结构的变化由两个被调查人员。细精管直径均值(MSTD)细精管测量在同一组织切片在5种不同集中microscope-adaptable千分尺。

2.10。免疫组织化学染色

睾丸组织部分和4%多聚甲醛固定在室温下30分钟。微波幻灯片后20分钟,可以在室温下冷却1 h,内源性过氧化物酶活性在所有部分被孵化的部分3% h₂O₂15分钟。然后,部分是孵化anti-Nrf2抗体(1:500)或anti-ANXA5抗体(1:500)1 h,广泛洗,染色1 h和Alexa萤石594 -或德州Red-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 1000)。分析了免疫组织化学染色使用蔡司LSM 510元共焦激光扫描显微镜。

2.11。实时定量PCR(存在)

从培养TM3细胞总RNA提取试剂盒的试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA),然后,cDNA反向转录了Primescript RT试剂(豆类,大津,日本)根据制造商的指示。然后,执行中存在利用StepOne +实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)与SYBR®预混料交货Taq™试剂(豆类)。以下不同的引物设计和合成了Sangon生物科技(中国)被用于这项研究:mir - 506 - 3 - p:转发:5 - - - - - -GCCACCACCATCAGCCATAC-3 ,反向:5 - - - - - -GCACATTACTCTACTCAGAAGGG-3 ;U6:转发:5 - - - - - -TCCGATCGTGAAGCGTTC-3 ,反向:5 - - - - - -GTGCAGGGTCCGAGGT-3 ;ANXA5:转发:5 - - - - - -AGCGGGCTGATGCAGAAAC-3 ,反向:5 - - - - - -ACTTCGGG ATGTCAACAGAGT-3 ;和GAPDH:转发:5 - - - - - -AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3 ,反向:5 - - - - - -AATGAAGGGGTCATTGATGG-3 。

英国保险协会第一步软件2.1版是用来进行数据分析,和相对mRNA水平计算使用2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。

2.12。免疫印迹分析

由BCA蛋白质测定总蛋白浓度计算工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL),根据制造商的指示。细胞和组织细胞溶解在细胞裂解缓冲20分钟振动在冰上和离心机在12.000×克在4°C,持续15分钟。蛋白质在10% sds - page分离和转移到0.45毫米PVDF膜(美国加州Bio-Rad大力神)。膜是孵化与5%脱脂奶粉溶解在TBST(20毫米Tris-HCL, pH值7.5,150毫米氯化钠,0.1%渐变20)2小时。以下蛋白抗体Nrf2 (68.0 kDa),组蛋白H3 (15.0 kDa),和GAPDH (40.2 kDa)(细胞信号技术,CST);HO-1 (34.6 kDa), NQO-1 (30.0 kDa),和销售税(24.0 kDa) (Abcam);和ANXA5 (36.0 kDa)(圣克鲁斯,CA)被用来结合相应的蛋白质和孵化一夜之间在4°C。所有这些蛋白质抗体稀释的抗体稀释缓冲(Beyotime,中国),比例为1:1000 - 2000。HRP-conjugated二级抗体(1:4000,细胞信号技术,美国)被用来结合主要抗体大约1.5小时。最后,免疫反应性的乐队是可视化与电化学发光试剂(Amersham,乌普萨拉,瑞典)。 Densitometry and quantitative analysis were analyzed using the ImageJ software (Bethesda, USA) and regulated by Histone H3 and GAPDH.

2.13。统计分析

使用SPSS 22.0统计分析(美国纽约阿蒙克)。结果表示为 每组(SD)。方差分析(方差分析)与学生的多个比较未配对使用 - - - - - -测试、评估差异的重要性。 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。mir - 506 - 3 - p在老鼠DBP-Induced睾丸损伤中高度表达

作为显示在表1,菲律宾可以降低老鼠的精子数、精子活力和畸形率增加。此外,血清睾酮(T)水平下降而促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)增加DBP-treated组与正常组相比。老鼠的鼠体重正常组和菲律宾没有差异(图组1(一))。显著降低了肛门与生殖器的距离(AGD)和比较的比例/鼠体重DBP-treated组的观察,与正常组相比(数字1 (b)和1 (c))。此外,睾丸重量和睾丸重量/老鼠重量的比率也低于DBP-treated集团和结果具有统计学意义(数据1 (d)和1 (e))。)染色显示菲律宾明显恶化了睾丸精上皮损伤,增加了不正常的生殖细胞,错过了细胞层经常存在于细精管(图1 (f))。

这些差异表达的总microrna至少2倍和变化值小于0.05所引起的大鼠睾丸组织中DBP-induced睾丸损伤使用微阵列分析,与正常组相比。如图1 (g),热量地图显示双向分层聚类的结果的样本,这些差异表达microrna,这显示芯片检测发现的相对表达水平。其中,mir - 506 - 3 - p被发现之间的明显差异正常组和菲律宾组,和菲律宾可以显著增加mir - 506 - 3的表达水平在老鼠(图- p1 (h))。因此,可以推断upregulation mir - 506 - 3 - p可能参与DBP-induced睾丸损伤。因此,DBP-treated老鼠注射mir - 506 - 3 - p agomir进一步识别角色DBP-treated mir - 506 - 3 - p的老鼠。DBP-treated老鼠的存在结果提出agomir - 506 - 3 - p的表达水平可以显著提高mir - 506 - 3 - p,而这些老鼠DBP-treated agomir-NC(图1(我))。

3.2。Upregulation mir - 506 - 3 - p加剧睾丸DBP-Treated大鼠氧化应激损伤

agomir - 506 - 3 - p注入后,他走时染色进行测量老鼠的睾丸组织形态学变化。如前所述,DBP-treated老鼠的睾丸组织紊乱的细胞层细精管不定期安排甚至失踪,虽然upregulation mir - 506 - 3 - p的肿胀和炎症细胞浸润增加DBP-treated老鼠(图2(一个))。此外,ROS染色结果确定,upregulation mir - 506 - 3 - p增强她的强度(dihydroethidium)染色的睾丸DBP-treated老鼠(图2 (b))。此后,氧化应激是评价大鼠睾丸组织MDA水平,猫,T-AOC, SOD,谷胱甘肽,谷胱甘肽减少。如数据所示2 (c)- - - - - -2 (h)、MDA含量+类似agomir - 506 - 3 - p组相比明显高于菲律宾+ Agomir-NC集团( )。此外,mir - 506 - 3 - p agomir可以减少抗氧化酶SOD和CAT的水平,和内容的抗氧化剂T-AOC谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG加剧睾丸相比,氧化应激+ Agomir-NC组类似。因此,上述结果表明,mir - 506 - 3 - p加剧DBP-induced睾丸氧化损伤在活的有机体内。

3.3。Upregulation mir - 506 - 3 - p降低Nrf2及其下游靶基因的表达水平在DBP-Treated老鼠

Nrf2观察睾丸中表达水平的评估从免疫组织化学分析如下。相比菲律宾组和菲律宾+ Agomir-NC集团Nrf2的表达水平是减少类似+ agomir - 506 - 3 - p组( ,图3(一个))。如图3 (b)Nrf2的表达水平,HO-1 NQO1、销售税蛋白质免疫印迹分析。Nrf2及其下游靶基因的表达水平,HO-1, NQO1、和销售税,菲律宾+ agomir - 506 - 3 - p组与菲律宾组相比均有显著下降,菲律宾+ Agomir-NC集团( )。因此,upregulation mir - 506 - 3 - p导致减少Nrf2及其下游靶基因的表达水平在DBP-treated老鼠。

3.4。mir - 506 - 3 - p必定ANXA5

如图4(一)之间的交互网络mir - 506 - 3 - p及其下游mrna被Mirbase预测(http://www.mirbase.org/),Mirdb (http://www.mirdb.org/)和米兰达(http://www.microrna.org/microrna/home.do)。然后,六mrna被存在试验进一步验证。如图4 (b),mir - 506 - 3 - p的表达水平显著降低ANXA5, SIX4, ITGB1, MAGT1和明显增加的ATL3水平DBP-treated老鼠,而Agomir-NC组。此外,免疫印迹的结果还表明,与Agomir-NC组相比,mir - 506 - 3 - p可以显著降低了ANXA5 DBP-treated老鼠(图表达水平4 (c))。RNA序列比对表明,3 - - - - - -UTR ANXA5 mRNA包含一个互补的站点的种子区域mir - 506 - 3 - p。提出了图4 (d)双荧光素酶报告质粒是获得执行dual-luciferase记者分析。组ANXA5-Wt,荧光素酶的活动极大地压抑了mir - 506 - 3 - p模拟与数控模拟组相比。然而,这些影响没有观察到的突变ANXA5组,表明ANXA5的目标基因mir - 506 - 3 - p。

3.5。重组鼠ANXA5扭转睾丸氧化应激促进损伤DBP-Treated mir - 506 - 3 - p的老鼠

进一步确认是否ANXA5激活睾丸负责氧化应激促进损伤mir - 506 - 3 p的DBP-treated老鼠进一步cotransfected mir - 506 - 3 p agomir和重组鼠ANXA5。相比,结果表明,mir - 506 - 3 p转染重组鼠cotransfection ANXA5 agomir - 506 - 3 - p导致维持精原细胞的管状结构和排列(图5(一个))。同时,细胞内ROS在DBP-treated老鼠与转染重组鼠cotransfection ANXA5和agomir - 506 3 - p明显低于+ agomir - 506 - 3 - p组类似,这表明ANXA5可以扭转引起的细胞内ROS增加mir - 506 - 3 - p在DBP-treated老鼠(图5 (b))。此外,免疫组织化学分析表明,相对于菲律宾+ agomir - 506 - 3 - p组,ANXA5的表达水平增加DBP-treated老鼠与重组鼠ANXA5 cotransfection agomir - 506 - 3 - p(图5 (c))。如图5 (d)Nrf2的表达水平,ANXA5 HO-1, NQO1、销售税蛋白质被免疫印迹分析。的表达水平ANXA5 Nrf2以及其下游靶基因HO-1, NQO1、销售税的cotransfection重组鼠ANXA5和agomir - 506 3 - p与菲律宾相比显著增加+ agomir - 506 - 3 - p组( )。因此,上述结果表明,重组鼠ANXA5可以扭转Nrf2及其下游靶基因表达水平降低造成upregulation DBP-treated mir - 506 - 3 - p的老鼠。

3.6。mir - 506 - 3 - p的氧化应激加剧DBP-Treated TM3细胞表达下调ANXA5在体外

TM3细胞的生存能力被CCK-8检查处理后不同浓度的菲律宾(0、5、10、50 mg / L)后24小时。结果发现差异显著( )当TM3, TM4细胞治疗10到50 mg / L菲律宾,虽然没有明显的变化被发现在菲律宾5 mg / L组。最终,10 mg / L菲律宾被选在这个研究。调查mir - 506 - 3 - p之间的相互作用和ANXA5 DBP-induced氧化损伤,重组鼠ANXA5管理,mir - 506 - 3 - p模仿在菲律宾转染TM3, TM4细胞模型。超表达mir - 506 - 3 - p可以减少TM3, TM4细胞的生存能力;然而,重组鼠ANXA5可能扭转TM3, TM4细胞的生存能力下降造成的过度mir - 506 - 3 - p在体外,从而增加生存能力在DBP-treated TM3, TM4细胞(图6(一))。接下来,我们测试了mir - 506 - 3 - p的表达水平,结果发现重组鼠ANXA5可以减少mir - 506 - 3的表达水平- p(图6 (b))。随后,我们可以清楚地显示在图6 (c)过度的mir - 506 - 3 - p可以增加细胞内ROS TM3 TM4细胞类似治疗(10 mg / L);但是,重组鼠ANXA5 cotransfection和mir - 506 - 3 - p模仿显著逆转过度引起的细胞内ROS增加mir - 506 - 3 - p DBP-treated TM3和TM4细胞。如图6 (d)的水平ANXA5 Nrf2以及其下游靶基因HO-1, NQO1、销售税在菲律宾被西方墨点法TM3 TM4细胞模型。结果发现,过度的mir - 506 - 3 - p明显显著降低ANXA5 Nrf2以及其下游靶基因。然而,重组鼠ANXA5可以反向促进影响Nrf2 / HO-1通路引起的过度mir - 506 - 3 - p在体外。所有结果表明,mir - 506 - 3 - p加重DBP-treated的氧化应激大鼠表达下调ANXA5通过Nrf2 / HO-1信号通路。

4所示。讨论

菲律宾曝光,一般通过食物和水的路线,会对各种人体系统造成破坏,特别是对儿童(4,5]。与雌激素的活动特点,菲律宾的毒性表现为低水平雄激素合成和男性生殖功能障碍之前提到的(3,7,8]。除了雄激素代谢的紊乱,也会产生类似直接毒性细胞或组织通过多种损害途径,已证明菲律宾可能会引起显著的氧化应激损害动物睾丸(15,16]。睾丸细胞受到DBP-induced氧化应激时,Nrf2抗氧化途径被认为是主要的细胞防御氧化压力补偿激活抵制这样的伤害(17- - - - - -20.]。

经过多年的microrna的研究,其异常表达参与报道在各种病理生理过程25,26]。占之间的重要关联异常的microrna的表达和发育畸形包括由DBP-induced睾丸氧化应激引起的,越来越多的研究人员关注利用microrna的小说DBP-induced睾丸损伤的预后和治疗的标志(27- - - - - -29日]。在当前的研究中,微阵列用于筛选差异表达的小分子核糖核酸DBP-induced睾丸损伤所导致的大鼠睾丸组织,和mir - 506 - 3 - p在DBP-induced睾丸异常调节氧化应激,以及DBP-treated TM3细胞模型。mir - 506 - 3 - p也被证实了炎性疾病不可缺少的一环。然而,没有研究报告的影响mir - 506 - 3 - p DBP-induced睾丸氧化应激损伤被发现,因此,mir - 506 - 3 - p可能被视为一个潜在的治疗目标加剧DBP-induced睾丸损伤。此外,upregulation mir - 506 - 3 - p增强ROS染色的强度和DBP-treated大鼠睾丸组织的MDA含量。此外,mir - 506 - 3 - p agomir可以减少抗氧化酶SOD和CAT的水平,和内容的抗氧化剂T-AOC谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG加剧睾丸氧化应激损伤相比,菲律宾+ Agomir-NC组。因此,上述结果表明,mir - 506 - 3 - p加剧DBP-induced睾丸氧化损伤在活的有机体内。

基于生物信息学分析和double-luciferase记者分析,结果表明,mir - 506 - 3 - p ANXA5可以直接目标。因此,mir - 506 - 3 - p可能会通过调整Nrf2 ANXA5 / HO-1通往加剧DBP-induced睾丸氧化损伤损伤。膜联蛋白A5 (ANXA5), 35 kDa人类蛋白质功能作为一个内生监管机构在各种病理生理过程通过绑定到磷脂酰丝氨酸(PS)在Ca^{2 +}端依赖的方式(30.,31日]。一些研究已经表明,ANXA5与炎症反应和细胞凋亡32,33]。姚等人发现ANXA5鼠睾丸间质细胞中高度表达,可能会干涉睾酮合成和分泌的调节34]。此外,尤因等人发现ANXA5可能产生炎症和抗氧化功能在某些情况下(35]。因此,本研究旨在探索ANXA5的确切作用在DBP-induced氧化应激损伤大鼠睾丸细胞。针对类似的变化趋势,mir - 506 - 3 - p和ANXA5菲律宾政府之后,我们假设mir - 506 - 3 - p加剧DBP-induced鼠睾丸氧化应激损伤通过ANXA5 / Nrf2 / HO-1信号通路。在这项研究中,我们发现mir - 506 - 3 - p明显下调ANXA5的表达水平,然后减少Nrf2及其下游靶基因的表达水平,从而mir - 506 - 3 - p可能DBP-induced睾丸氧化损伤的损伤因素。此外,过表达ANXA5削弱了DBP-induced ROS,加强抗氧化应激指标的活性,减少MDA水平,显示超表达的ANXA5扭转的睾丸氧化应激促进损伤mir - 506 - 3 - p DBP-treated老鼠通过Nrf2 / HO-1信号通路。

因为先前的研究已经表明菲律宾可以诱导氧化应激在活的有机体内,导致蛋白质抗氧化途径的变化,在体外实验进行验证这一发现。我们首先再次表现睾丸氧化应激损伤后菲律宾政府通过染色在TM3细胞。ROS的生成与菲律宾浓度的增加细胞生存能力下降。引人注目的是,最佳细胞状态和重要的蛋白质变化也显示在菲律宾10 mg / L,而菲律宾的大剂量会导致可怕的细胞生存能力。同时,ANXA5和Nrf2相关基因的水平也有所下降后,菲律宾的管理。通过慢病毒转染加强mir - 506 - 3 - p的表达,减少水平的Nrf2及其下游抗氧化剂HO-1 NQO1、销售税重组鼠ANXA5管理时被发现。总的来说,这些发现丰富的理解在类似生殖毒性和更全面的研究有待进行。

5。结论

总的来说,这项研究照明,mir - 506 - 3 - p可能加剧DBP-treated睾丸氧化应激在活的有机体内和在体外通过抑制ANXA5表达和表达下调Nrf2 / HO-1通路。这项研究可能在DBP-induced睾丸损伤的治疗提供新的理解。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

M。T, ZQ。问,W。Z导致协议/项目开发;R。L, ZQ。问,Z。L导致了细胞培养、转染、可行性分析,和ELISA;W。W和平方。W contributed to the DHE and immunofluorescence staining; L.Z and ZQ.Q contributed to the qRT-PCR and Western blot. ZQ.Q, M.T, and W.W contributed to the data analysis. M.T, ZQ.Q, and L.Z contributed to the manuscript writing/editing. Min Tang, Lei Zhang, and Zheng Zhu contributed equally to this work.

确认

这项工作已经由中国国家自然科学基金(81600514,81670608)。

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