一个积极的前馈Wnt /之间的循环β连环蛋白和NOX4促进硅Dioxide-Induced Epithelial-Mesenchymal肺上皮细胞的过渡

文摘

硅肺病是一种慢性纤维化肺病二氧化硅粉尘的积累造成的远端肺。规范Wnt信号和NADPH氧化酶4 (NOX4)已经证明在肺纤维化的发病机制中起关键作用包括矽肺病。然而,这两个信号之间的串扰的潜在机制还没有完全理解。在目前的研究中,我们旨在探索Wnt /之间的交互β连环蛋白和人类上皮细胞NOX4二氧化硅粉尘的风险敞口。结果表明Wnt /关键组件的高表达β连环蛋白信号和NOX4二氧化硅(SiO的肺₂-)诱导小鼠矽肺。此外,激活Wnt /β连环蛋白和NOX4信号是伴随着细胞增殖的抑制作用,增加了活性氧的生产和细胞凋亡,并upregulation profibrogenic因素BEAS-2B人类肺上皮细胞暴露于SiO₂。机械的研究进一步证明了Wnt3a-mediated激活规范Wnt信号可以增强SiO₂全身NOX4表达和活性氧(ROS)生产,但减少谷胱甘肽(GSH),而Wnt抑制剂DKK1展出Wnt3a相反的效果。反之亦然过度的SiO NOX4进一步激活₂全身的Wnt /β连环蛋白信号和NFE2-related因子2 (Nrf2)抗氧化反应和还原谷胱甘肽,而shRNA-mediated击倒NOX4塞入NOX4显示了相反的效果。这些结果意味着积极的前馈Wnt /之间的循环β连环蛋白和NOX4暗示可能促进epithelial-mesenchymal过渡(EMT)的肺上皮细胞在回应一个二氧化硅粉尘暴露,可能因此提供一个洞察profibrogenic Wnt /的角色β连环蛋白和NOX4相声在肺上皮细胞损伤和矽肺的发病机理。

1。介绍

矽肺病是一种致命的职业性慢性肺纤维化疾病引起的长期接触呼吸道石英(二氧化硅(SiO₂)尘埃,最终沉积在远端航空公司(1,2]。由于疏忽和无法控制的风险过度暴露于二氧化硅现代工业和工作活动使用的手工工具,如牛仔喷砂、珠宝抛光,人造石工程、牙科修剪,建筑构造,和高速公路的维修,包括中国在内的许多发展中国家正在经历的再度出现硅肺病(3- - - - - -5]。与矽肺来源于长期暴露于二氧化硅等传统职业采矿、silica-related在现代工业的特点是一种急性疾病和加速发展由于高强度二氧化硅粉尘浓度和氧化应激在短的时间内(3]。

硅肺病目前是一种无法治愈的疾病,其发病机制仍不完全清楚。病因、吸入和淀积二氧化硅粉尘引起的炎症反应和活性氧(ROS)的产生,进而导致epithelial-mesenchymal过渡(EMT)和肺纤维化的发展,可表现为大量的细胞外基质(ECM)沉积和成纤维细胞增殖,和myofibroblast分化6]。类似于其他慢性肺部疾病证明,矽肺的发病机制是由各种细胞信号通路之间的相互作用(7- - - - - -10]。其中,wingless-type MMTV-integration网站(Wnt) /β连环蛋白的信号,一个众所周知的关键细胞信号通路在胚胎发育和组织内稳态,是重新激活在许多慢性肺疾病,包括硅肺病(8,9,11- - - - - -13]。Wnt /阻塞β在silica-induced连环蛋白信号减轻肺部炎症和纤维化小鼠和大鼠矽肺模型(14- - - - - -16]。这些研究表明,Wnt /β连环蛋白是一个关键的司机矽肺病的起始与发展。

除了细胞信号活动的失调,二氧化硅粉尘的吸入也会导致氧化应激的生产活性氧(ROS)导致慢性气道炎症,上皮细胞损伤(17]。的确,ROS是具有多种生物功能的重要介质,如细胞增殖和分化、细胞迁移、和免疫调节18]。ROS也需要维护和原代肺成纤维细胞的分化为肺组织内稳态(19]。然而,持续过度生产ROS(氧化应激)在肺的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)可能会导致组织损伤和损伤特异表达/修复,最终导致慢性肺部疾病,如肺纤维化(19,20.]。此外,暴露于二氧化硅粉尘了诱导活性氧生产和肺损伤动物模型(17,21),这表明发病的ROS矽肺病的发展的作用。

主要的ROS产生氮氧化物,膜结合酶复合物在吞噬细胞和nonphagocytic细胞(22]。有七个氮氧化物同系物确定到目前为止,即NOX1-5和双氧化酶类1和2 (DUOX1和DUOX2) (18]。尽管这些氮氧化物蛋白质能力产生超氧化物阴离子,他们拥有不同的角色。其中,NOX4独特作用,广泛表达于肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞,气道上皮细胞和肺间质myofibroblasts。NOX4能够产生超氧化物和产生细胞外H₂O₂在过氧化氢酶活性(23,24]。此外,NOX4最常涉及profibrotic进程的多个器官,包括肝脏和肺。在这方面,只有NOX4同种型氮氧化物蛋白高度调节的上皮细胞和肺myofibroblasts特发性肺纤维化(IPF)的病人25,26]。这些临床研究结果证实了这一事实NOX4缺乏发达bleomycin-induced大大减少肺纤维化小鼠和肺泡上皮细胞死亡25),这表明NOX4的重要性在肺纤维化的发病机制。此外,在bleomycin-induced NOX4减毒的抑制肺纤维化大鼠肺纤维化模型(27]。从力学上看,NOX4的过度表达和生产活性氧诱导上皮细胞的死亡,myofibroblast分化,ECM沉积(23,25]。

针对广泛的证据hyperactivated NOX4和Wnt /β连环蛋白信号在肺纤维化的队伍,责任人silica-induced ROS生产silica-related疾病的发病机理,我们假设NOX4和Wnt /之间的交互β连环蛋白信号可能导致silica-related肺部疾病的发病的过程。然而,Wnt /之间的联系β连环蛋白信号和NOX4-mediated ROS矽肺病的发展尚未建立。在这里,我们表明,积极的前馈回路NOX4和Wnt /β连环蛋白信号促进纤维化的财产在气道上皮细胞响应二氧化硅粉尘暴露。

2。材料和方法

2.1。制备二氧化硅(SiO₂)粒子

硅(SiO₂介孔2μ米粒子大小、CAS号7631-86-9)和二氧化硅(SiO ~ 99%₂-10年,0.5μ米颗粒大小,14808-60-7)的产品Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。SiO₂粒子在200°C 2 h烤灭活内毒素之前被悬浮在盐水的浓度为100毫克/毫升。SiO₂盐水股票进一步分散15分钟在水浴超声发生器随后被磨碎通过25 g针在使用前按照以前的报告(28]。

2.2。代的SiO₂全身的硅肺病小鼠模型

的协议和使用老鼠实验动物委员会批准在宁夏大学生命科学学院,按照美国国立卫生研究院的指导方针指导实验室动物保健和使用的(NXULS20180123-3)。代小鼠矽肺肺,协议,剂量,在前面的描述和交付方法研究了略微修改(28]。十二个健康C57BL / 6小鼠6 - 8周的年龄,男性和女性的一半,从北京购买的重要河流实验动物技术有限公司(中国,北京)。所有的老鼠被安置在一个特殊的无菌(SPF)设施与12/12 h光/暗周期和水随意宁夏医科大学(银川,中国)。雄性和雌性小鼠随机分为两组(每组3男3女老鼠):(1)生理盐水对照组:小鼠气管内的灌输50μL盐水和(2)石英组:动物气管内的灌输50μL 50毫克/毫升的二氧化硅在盐水(SiO > 99%₂,-10年尘埃颗粒大小为0.5μ是1 - 5 m, 80%的粒子μ米)。小鼠安乐死在2周(14天)后的二氧化硅粉尘暴露pathohistological和分子分析28]。

2.3。细胞培养和重组腺病毒的感染

人类支气管上皮细胞系,BEAS-2B(写明ATCC crl - 9609),从美国购买类型文化集合(写明ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养在测距装置/ F12体积(50% / 50%)基础培养基(HyClone)补充10%胎牛血清的边后卫(Ausbian,猫没有。澳大利亚VS500T)在湿润的气氛中95%的空气(CO - 5%的二氧化碳₂在37°C)。当细胞达到~ 80%汇合,他们被用于感染运载体和/或暴露于不同浓度的SiO₂灰尘对各种时间进行分析。运载体表达鼠标Wnt3a (AdWnt3a),广告。shRNA-NOX4和adenoviral骨干矢量控制(AdC)请提供的爱荷华大学的约翰·f·恩格尔哈特博士(爱荷华州的城市,爱荷华州,美国)29日]。Adenoviral向量表达人类NOX4 (AdNOX4)是应用生物材料有限公司(产品的猫。没有。114456;加拿大列治文)。Adenoviral向量AdDKK1表示鼠标DKK1,是由上海Genechem有限公司有限公司(上海,中国)。BEAS-2B细胞感染病毒的感染复数运载体1000 24小时前他们培养48 h的额外SiO的存在与否₂(2μ100年大小)的浓度μ克/厘米²。然后细胞收获进行分析。治疗活性氧清除剂N-acetyl-L-cysteine (NAC),细胞被刷新与媒体包含10更易为2 h / L的NAC SiO之前₂添加到培养基。然后细胞连续培养的NAC额外的24小时或前48小时收获进行分析。

2.4。细胞生存能力分析

细胞生存能力是通过细胞计数工具访问——(CCK -) 8按照制造商的指示(Dojindo分子技术、熊本、日本)。简单地说,细胞( /)被播种在96孔板,一夜之间长大之前暴露于二氧化硅粉尘(2μ米颗粒大小)的密度0,五十,100,150,200μ克/厘米²24或48小时。随后,10μL CCK8的解决方案是添加到每个好,和盘子孵化在37°C的额外2 h。在450纳米波长的吸光度是读上标(美国BioTek Winooski, VT)。相对细胞生存能力的百分比表示 ,在哪里 , ,OD_细胞,OD_媒介代表了OD值_450海里井的SiO₂处理细胞,包含SiO介质₂,未经处理的控制细胞培养,分别和空白中。所有与生物实验进行了一式三份,数据代表至少有三个独立的实验。

2.5。免疫印迹分析

细胞的总蛋白从细胞中提取处理100μ克/厘米²的SiO₂48 h使用细胞裂解缓冲(Kaiji生物技术有限公司、北京、中国)。核蛋白质提取与NE-PER™核萃取设备(热费希尔科学中国,上海,中国)。总蛋白的小鼠肺孤立了均质化组织增强里帕裂解缓冲(Leagene生物技术有限公司,北京),其次是离心。细胞溶解产物或均质肺组织然后离心机 20分钟在4°C;收集上清液总蛋白。蛋白质检测用BCA的浓度分析工具(Kaiji生物技术有限公司、北京、中国)。蛋白质(30μg)解决8% -10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶(SDS - page)和转移到PVDF膜(美国微孔,Billerica的)。膜被封锁在TBS 5%脱脂牛奶1小时在室温下(RT)。感兴趣的蛋白质;探讨了其特定的抗体,然后屁股被开发使用增强化学发光(ECL)试剂(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)所描述的其他地方。蛋白表达的水平被光学微semiquantified使用ImageJ软件版本2.0.0 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)。之间的比例每个样品的净强度除以GAPDH内部控制作为光密度计算任意单位(美),作为一个索引的相对感兴趣的蛋白质的表达。初级抗体的使用和信息用于本研究中列出增刊。表S1和S2。

2.6。组织学和Immunofluorescent染色

以小鼠的肺的病理组织学检查暴露于二氧化硅,小鼠的肺组织在中性10%福尔马林固定,石蜡包埋处理和pathohistological分析部分通过苏木精和伊红染色(他)。与此同时,部分肺组织固定在4%多聚甲醛(PFA) PBS 2天前被嵌入在一个最佳切削温度(10月)复合免疫荧光染色(如果)10μ冷冻组织切片。如果盖玻片上染色的细胞,细胞被播种在玻璃底部细胞培养皿(直径15毫米)的密度 细胞/菜和培养过夜之前暴露于二氧化硅粉尘(100μ克/厘米²),一个额外的24 h或48 h。然后,细胞被固定为4% PFA 15分钟。如果染色,4% PFA-fixed幻灯片permeabilized 0.2% tritonx RT - 100 / PBS 20分钟,随后被屏蔽5%正常驴血清在PBS 1 h RT,感兴趣的适当稀释主要抗体蛋白质被应用于部分和孵化一夜之间在4°C。绑定Alexa面粉主要抗体检测的荧光(488或565)共轭二次抗体。EdU公司分析了使用点击它™EdU细胞增殖装备按照制造商的指示(猫# C10340,热费希尔科学中国,上海,中国。幻灯片是安装与DAPI VectShield介质(h - 1200,向量实验室,伯林盖姆,CA)可视化和用莱卡TCS SP2 A0BS共焦成像系统和徕卡共焦上处理软件v.2.6.1(德国徕卡)。

2.7。ROS的流式细胞术分析

细胞( 细胞/)培养6-well板被感染adenoviral向量24 h和/或治疗有或没有硅额外48 h在细胞间ROS流式细胞术分析评估。简单地说,这些细胞被分离从盘子和洗1 x PBS,紧随其后的是被孵化的CellROX®橙色试剂(CellROX®氧化应激试剂,C10443,英杰公司)的最终浓度5μ米在苯酚prediluted red-free DMEM在黑暗中30分钟的37°C。孵化后,CellROX®橙色试剂溶液移除,移除介质和细胞被洗前三次与PBS为流式细胞术分析在PBS resuspended BD FACSCanto II。至少10000事件为每个条件进行了分析。ROS染色,细胞被孵化5更易与L CellROX®橙色试剂在黑暗中在RT为30分钟,之前他们是在荧光显微镜成像。所有与生物实验进行了一式三份,数据是代表至少有三个独立的实验。

2.8。测量了谷胱甘肽(GSH)

细胞被冲洗tritonx PBS和细胞溶解1% - 100在PBS 30分钟在4°C。裂解是收集和离心机在3500转10分钟。浮在表面的收获进行分析。总共有100μL上层清液是用来衡量OD的价值_405海里使用谷胱甘肽的检测设备/制造商提供的手册(南京建成生物技术研究所,中国)。减少谷胱甘肽被蛋白质浓度正常化。所有与生物实验进行了一式三份,数据是代表至少有三个独立的实验。

2.9。Wnt / TCF信号双荧光素酶报告实验

Wnt信号TCF记者质粒(TopFlash)是微孔的产物(美国伯灵顿,MA)和pCMV-renilla荧光素酶质粒是购自Promega (WI麦迪逊,美国)。为了访问Wnt /β连环蛋白活性,在12-well BEAS-2B细胞培养板和TCF cotransfected记者质粒(TopFlash)和pCMV-renilla荧光素酶质粒(用于内部控制规范化的转染效率)50的比例:1使用X-tremeGENE惠普(罗氏,Penzburg,德国)。细胞暴露于二氧化硅粉尘(2.0 nm大小)在24 h后转染并继续文化为额外的24小时或48小时前他们收获进行分析。细胞细胞溶解在1 x被动记者裂解缓冲(Promega)。蛋白质浓度测定采用布拉德福德法,溶菌产物都是归一化到相同的蛋白质浓度使用裂解缓冲。两毫升规范化细胞溶解产物被用于测量的相对荧光素酶活性单位(RLU),萤火虫和renilla荧光素酶,利用双荧光素酶检测设备(Promega)。转染效率是归一化相对萤火虫荧光素酶单位除以相对renilla荧光素酶的单位。正常化后,值表示为RLU。所有与生物实验进行了一式三份,数据是代表至少有三个独立的实验。

2.10。统计分析

所有的实验进行至少三个生物学重复。给出的数据 。所有使用GraphPad棱镜版本5评估分析软件(版本5.0,GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。被定义为统计意义 。

3所示。结果

3.1。一个增强的Wnt /β连环蛋白信号活动和健壮的表达式NOX4 SiO的肺₂老鼠全身矽肺病

为了理解的潜在角色Wnt /β-连环蛋白信号和NOX4 silicotic肺,开发和发展的几个关键组成部分的表达Wnt /β连环蛋白信号级联NOX4蛋白质和SiO肺纤维化和纤维发生的因素₂全身的矽肺老鼠通过免疫印迹(IB)和immunofluorescent染色(如果)化验。小鼠气管内的收到二氧化硅粉尘展出丰富的矽肺结节肺实质的作为评价他组织学染色(数字1(一)- - - - - -1 (c))。这样矽肺结节没有观察到肺控制老鼠的挑战与生理盐水(数字1 (d)- - - - - -1 (f))。值得注意的是,没有区别在雄性和雌性小鼠矽肺的发病机制是观察。分子分析使用一个免疫印迹试验发现NOX4和Wnt /β连环蛋白信号在silica-challenged肺高访问增加大量的NOX4,活跃β连环蛋白(ABC)和Axin2但减少Wnt抑制剂DKK1蛋白(数字1 (g)和1 (h))。NOX4和Wnt信号的增强的活动是伴随着生产的增加profibrogenic蛋白质α平滑肌肌动蛋白(αsma)和波形蛋白,在肺部暴露于二氧化硅(数字1 (g)和1 (h))。此外,NOX4 Wnt3a丰度的增加,αsma,波形蛋白被进一步证实主要表达的矽肺结节silica-challenged肺由immunofluorescent染色(如果)试验(图1(我))。这些结果证明NOX4和Wnt /的参与β连环蛋白信号在矽肺的发病机理老鼠的肺。

3.2。SiO₂激活Wnt /β连环蛋白信号和增强NOX4肺上皮细胞

自从epithelial-mesenchymal过渡(EMT)或myofibrogenesis肺上皮细胞的肺纤维化的一个特点,矽肺的特征(30.),变更Wnt /β连环蛋白信号活动和NOX4 BEAS-2B肺上皮细胞的表达,以应对二氧化硅粉尘被检查。细胞生存能力分析建议降低50%在肺上皮细胞的生存能力BEAS-2B细胞暴露于200年μ克/厘米²的SiO₂和显示剂量依赖性抑制细胞增殖的细胞暴露于SiO₂24小时和48小时0 - 200的范围μ克/厘米²(图2(一个))。正如所料,SiO的接触₂(100μ克/厘米²)导致显著增强激活Wnt /β连环蛋白在BEAS-2B细胞生理盐水相比控制信号( ),评估如果染色Wnt3a配体的细胞质和ABC在核(图2 (b)),Wnt / Tcf-Lef转录活动使用双荧光素酶报告实验,Wnt /读出β连环蛋白信号(图2 (c))和免疫印迹(IB)分析(数据2 (d)和2(e))。高架Wnt活动伴随着增加大量的Wnt /β连环蛋白信号配体Wnt3a和中介核活动β连环蛋白(ABC)证实了如果染色(图)2 (b))和IB分析(数据2 (d)和2(e))。

为了检查SiO的潜力₂诱导活性氧的生产和EMT的上皮细胞,我们检查了氮氧化物的表达蛋白质和EMT-related分子在细胞暴露于二氧化硅24小时和48 h,虽然显著减少诱导细胞生存能力的SiO的接触₂在100μ克/厘米²48 h。正如所料,活性氧产量的增加存在剂量依赖的相关性观察与SiO BEAS-2B细胞治疗₂48 h,但不是24小时后的二氧化硅粉尘相对于生理盐水(图3(一个)),这表明抑制细胞增殖的细胞暴露于SiO₂。氮氧化物的蛋白质是细胞内活性氧的主要来源(31日),改变几个氮氧化物的家庭在SiO BEAS-2B细胞蛋白质检测₂刺激。的确,增加活性氧产量增加大量的NOX4和profibrogenic因素αsma和减少钙粘蛋白(数字3 (b)- - - - - -3 (d))。值得注意的是,SiO₂未能诱导的表达NOX1和NOX5由IB试验(数字3 (b)和3 (c))。SiO₂NOX4和全身的表达式α进一步验证了sma和另一个profibrogenic蛋白质波形蛋白如果BEAS-2B细胞(图)3 (e))。

有趣的是,活性氧清除剂N-acetyl-L-cysteine (NAC)(10更易/ L)容量减少SiO展出₂激活Wnt /β连环蛋白信号由改变大量的核ABC蛋白,虽然没有重大改变核ABC中检测出细胞治疗NAC(图4(一))。值得注意的是,NAC治疗减少SiO也显示能力₂全身的EMT MMP2和纤维发生的蛋白质,αsma,波形蛋白和EMT抑制钙粘蛋白,尽管SiO的事实₂单独或NAC未能显著改变这些蛋白质的表达BEAS-2B细胞(图4)。值得注意的是,除了抑制细胞增殖,SiO的接触₂也诱导细胞凋亡由表达增加caspase-3-mediated proapoptotic蛋白质包括裂解caspase-3和伯灵顿,但减少了抗凋亡蛋白的表达相对于盐水控制数据4(一)和4 (d))。南汽的存在可以减少SiO的表达₂全身的凋亡蛋白(数字4(一)和4 (d)),这表明二氧化硅的曝光可能抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡BEAS-2B细胞。在一起,这些数据表明SiO₂全身NOX4和ROS生成发挥了关键作用的EMT在肺上皮细胞和纤维发生矽肺病,这也意味着一个潜在的机制之间的交互Wnt /β连环蛋白信号和NOX4肺上皮细胞的肺与矽肺的发病机制。

3.3。Wnt /β连环蛋白信号改变NOX4-Mediated在肺上皮细胞ROS生产

为了调查Wnt /之间的交互β连环蛋白信号和NOX4肺上皮细胞、信号活动改变BEAS-2B细胞的感染adenoviral向量表示鼠标Wnt3a (AdWnt3a)或DKK1 (AdDKK1)和活性氧产量的变化应对SiO₂曝光测量。Wnt3a IB分析显示一个健壮的表达式和DKK1蛋白质在细胞感染AdWnt3a AdDKK1,增加和减少的ABC蛋白相比,细胞感染控制AdC向量,分别为(数字5(一个)和5 (b))。值得注意的是,Wnt / AdWnt3a-mediated激活β连环蛋白信号导致增加αsma和波形蛋白的蛋白质,但降低钙粘蛋白(数字5(一个)和5 (c))。值得注意的是,Wnt3a或DKK1仅能够改变NOX4 BEAS-2B细胞表达和ROS作品,无论SiO的接触₂(数据5(一个)- - - - - -5 (e)),尽管SiO₂孤独也显著诱导活性氧生成,同时证明了荧光染色法与CellROX®橙色试剂(图5 (d))和流式细胞仪定量分析(图5 (e))。此外,激活Wnt信号也抑制减少谷胱甘肽(GSH)的生产相比AdC-infected细胞(图5 (f))。正如所料,AdDKK1-mediated抑制Wnt /βWnt3a连环蛋白信号导致相反的效果(图5)。这些结果表明SiO机制₂激活Wnt /β连环蛋白信号诱导NOX4表达式,它大大增加了活性氧产量和EMT的表达在肺上皮细胞和纤维发生的蛋白质。

3.4。NOX4增强Wnt /β连环蛋白信号和促进EMT在肺上皮细胞

接下来,我们试图探索NOX4是否能改变Wnt /β连环蛋白在肺上皮细胞信号响应二氧化硅粉尘。为此,NOX4的功能改变BEAS-2B细胞感染的运载体表达NOX4 (AdNOX4)或短发卡RNA(成分)NOX4基因(AdshRNA)。正如所料,增加大量的NOX4蛋白质在细胞被发现感染了AdNOX4,和减少感染AdshRNA NOX4蛋白质中检测出细胞,表明这些运载体能够overexpressing和推倒NOX4 BEAS-2B细胞(数字6(一)和6 (b))。必然地,AdNOX4-mediated NOX4 Wnt /激活的超表达β连环蛋白信号由Wnt3a丰度的增加,美国广播公司、细胞周期蛋白D1和Axin2。Wnt /的激活β连环蛋白信号被进一步证实如果ABC(图)6 (c)),NOX4的表达增加的EdU公司BEAS-2细胞,这意味着NOX4能够促进上皮细胞增殖(图6 (c))。的利益,过度NOX4显著抑制DKK1 BEAS-2细胞蛋白(数字6(一)和6 (b))。见上面的AdWnt3a-infected细胞,NOX4-activated Wnt /β连环蛋白信号的表达也增加了纤维发生的因素,和氧化应激相关蛋白NFE2-related因子2 (Nrf2) BEAS-2B细胞,但Nfr2-regulated基因的表达血红素oxygenase-1 (HO-1)没有NOX4的异位表达(改变数字6(一)和6 (b))。相比在细胞overexpressing NOX4, above-examined蛋白的表达在细胞shRNA-mediated NOX4击倒的是相反的(数据6(一)- - - - - -6 (c))。符合Wnt3a-mediated Wnt激活,NOX4增加了活性氧的过度生产(数字6 (d)和6 (e)),而抑制减少谷胱甘肽(GSH)的生产(图6 (f))和一个可拆卸的NOX4减少活性氧的生产,但诱导BEAS-2B细胞中谷胱甘肽生产不管SiO₂刺激(数据6 (d)- - - - - -6 (f))。这些数据表明SiO₂全身NOX4表达式可以提高Wnt /β连环蛋白信号活动,进而增加活性氧的生成和减少谷胱甘肽,最终引起细胞损伤,促进了EMT在肺上皮细胞。

4所示。讨论

矽肺病作为慢性肺纤维化疾病的特点是由重复吸入二氧化硅粉尘过多引起的。硅接触的侮辱导致持续的炎症和氧化应激,导致直接或间接损伤肺泡上皮在远端肺。为了应对损伤,上皮细胞能够修复的初始损伤/修复过程严格监管的不同细胞信号通路之间的相互作用。然而,这些信号的失调可能导致纤维化的起始反应肺纤维化(32]。在这些信号,Wnt信号与纤维化的发展(9),被二氧化硅粉尘在肺上皮细胞改变在体外硅肺病动物模型在活的有机体内,通过机制与其他信号或分子相互作用,导致profibrogenic和炎症反应在肺上皮细胞13- - - - - -15,33]。

在目前的研究中,Wnt /之间的互动β连环蛋白信号传导和扩散和profibrogenic NOX4应对SiO₂在人类上皮细胞被审问。结果表明,Wnt /β连环蛋白和NOX4信号在肺部的SiO升高₂全身的小鼠矽肺。SiO的接触₂导致细胞增殖和诱导细胞凋亡,抑制Wnt /激活β连环蛋白信号感应NOX4和活性氧的生产,EMT-related蛋白的表达在BEAS-2B人类肺上皮细胞。分子分析进一步表明Wnt3a-mediated激活Wnt /βSiO连环蛋白进一步增加₂全身NOX4表达式和ROS生产但减少谷胱甘肽,而Wnt抑制剂DKK1展出Wnt3a相反的效果。反之亦然的异位表达NOX4增强Wnt /的活动β连环蛋白信号和减少谷胱甘肽,而shRNA介导击倒NOX4-enervated Wnt信号活动,增加谷胱甘肽。从力学上看,NFE2-related因子2 (Nrf2)抗氧化反应是参与Wnt /之间的串扰β连环蛋白和NOX4信号SiO BEAS-2B细胞反应₂挑战。

Wnt信号是关键的肺肺成熟的发展和自我平衡的维护,通过调解干细胞自我更新、营业额和损伤/修复上皮细胞(34,35]。然而,越来越多的证据表明,Wnt已经涉及到许多类型的肺部疾病,肺部成熟和Wnt信号特异表达,被认为是一个司机不当导致过度的细胞增殖和细胞分化为纤维修复(36,37]。事实上,重新激活Wnt被确认为的起始和发展的一个关键因素hyperproliferative慢性肺疾病(9,12),如特发性肺纤维化(IPF) [11,38),哮喘39)和慢性阻塞性肺病8,11,34,40]。对矽肺β-catenin-mediated标准信号和β-catenin-independent不在经典里的信号在人类改变气道上皮细胞在二氧化硅刺激;Wnt抑制剂SFRP1和不在经典里的配体Wnt5a表达下调,而另一个Wnt抑制剂DKK1是调节(13),尽管规范化Wnt /β连环蛋白信号被激活在矽肺肺14,15]。因此,抑制Wnt /β连环蛋白信号的成分β连环蛋白(14,15]显示能力大大减轻silica-induced在矽肺纤维化小鼠模型(16]。这种衰减silica-induced肺纤维化的针对Wnt /β连环蛋白信号也被报道在矽肺大鼠管理与大鼠骨髓间充质基质细胞(bmsc) [16]。符合上面的发现,一个增强Wnt /β连环蛋白信号,以及增加NOX4和profibrogenic蛋白质丰富,但减少DKK1,也是观察SiO₂全身的硅肺病鼠肺,BEAS-2B人类肺上皮细胞暴露于SiO₂。

重复的氧化应激是肺损伤的不利因素之一。NOX-mediated生产过剩的活性氧由于过度刺激促炎细胞因子或二氧化硅粉尘等环境的侮辱导致肺部氧化应激的重要组成部分。的病理生理角色在不同亚型的氮氧化物,NOX4同种型有很大的含义在肺上皮细胞死亡,(myo)成纤维细胞分化,和胶原沉积23,25,41]。在这方面,高架NOX4在增生性肺泡II型细胞,导致细胞死亡和强劲表现在IPF患者的肺成纤维细胞和上皮细胞25,26]。实验,小鼠缺乏NOX4表现出明显不太严重的肺部纤维化的表现型的bleomycin-induced肺纤维化小鼠模型(25),这表明NOX4是治疗肺纤维化的潜在目标包括矽肺病。事实上,在之前的研究的影响Tanshinone花絮(Tan花絮),中药的天然化合物在矽肺大鼠模型中,冯等人发现,谭花絮可以显著缓解silica-induced肺纤维化,通过减少silica-augmented NOX4和增强Nrf2 /矽肺大鼠肺中抗氧化活性(42]。在这个报告中,增加表达NOX4和活性氧的生产也观察到在应对SiO BEAS-2B肺上皮细胞₂刺激。注意,shRNA-mediated击倒的SiO NOX4导致明显降低₂全身profibrogenic分子(αsma,波形蛋白)在肺上皮细胞。

越来越多的证据显示Wnt /的相声β连环蛋白和ROS在调节细胞增殖和分化43- - - - - -46]。例如,一项研究表明,Wnt /β连环蛋白能调节氧化还原调控蛋白质p66(自燃),进而调节NOX4-mediated ROS,最终导致血管内皮功能障碍(43]。在这种背景下,Wnt3a-induced Wnt信号,NOX4表达式,可以抑制ROS生产p66击倒和抗氧化剂NAC(自燃),而过度的p66(自燃)增强Wnt信号。一个本构激活Wnt /β连环蛋白在内皮细胞导致血管ROS增加生产和内皮功能障碍(43]。相比之下,在调制Wnt / ROS也显示能力β连环蛋白信号在小鼠胚胎外的内胚层模式;持续暴露的H₂O₂(ROS)增强Wnt /β连环蛋白活动视黄酸洗F9畸胎癌细胞,促进细胞分化成原始内胚层,虽然接触这些细胞抗氧化剂NAC阻碍细胞分化[44]。同样,细胞氧化损伤诱导的复活Wnt /β连环蛋白信号也被观察到在足细胞功能障碍,podocyte-specific击倒β连环蛋白保护足细胞损伤和高级氧化引起的蛋白尿在小鼠蛋白质产品。从力学上看,Wnt /β连环蛋白诱导受体发挥其功能的先进的糖化终端产品——(愤怒)介导的氮氧化物表达式,ROS生产、核factor-kappaB (NF和激活κB) (45]。这样一个NOX-mediated Wnt /监管β连环蛋白在小肠和结肠上皮细胞也报道,NOX1监管的Wnt信号redox-dependent的方式(46]。的自尊和上面的发现,在目前的研究中,Wnt /的相声β连环蛋白和NOX4 BEAS-2B也发现了肺上皮细胞暴露于二氧化硅粉尘的反应。Wnt3a-activated Wnt /β连环蛋白信号增强NOX4表达式、ROS生产,减少生产谷胱甘肽,伴随着profibrogenic蛋白的表达增加;相反,DKK1-mediated抑制Wnt /β连环蛋白产生了相反的效果,对肺上皮细胞暴露于SiO Wnt3a₂。反之亦然的超表达NOX4增强Wnt /β连环蛋白信号活动,连同profibrogenic蛋白质在细胞的增加。NOX4也减少谷胱甘肽生产和Nrf2的表达增加,保持体内平衡的关键细胞内antifibrotic因素ECM (47),而shRNA-mediated击倒NOX4 NOX4演示了一个相反的效果的过度。这个结果是在协议与囊性纤维化跨膜电导调节的发现(雌性生殖道)叛逃细胞ROS生产过剩(48]。值得注意的是,过度的NOX4抑制DKK1表达式。这个观察符合的结果减少DKK1矽肺肺的老鼠(图1 (b)),这意味着绝大silica-induced NOX4 silicotic肺部可能抑制DKK1表达式。因此这个结果表明DKK1可能是小说在矽肺的目标,这就需要进一步调查。

此外,减少谷胱甘肽(GSH)是一个无处不在的三肽硫醇,已被认为是一种保护性的抗氧化剂对抗氧化压力(49]。缺乏谷胱甘肽的下呼吸道被认为有重要影响的进展IPF (50];表达下调在bleomycin-induced肺纤维化在一只老鼠51和PM2.5-induced肺纤维化小鼠肺52]。在这项研究中,Wnt /β-catenin-mediated下降减少谷胱甘肽(GSH)也决定在肺上皮细胞,这是符合发现在晶状体上皮细胞(53[],斑马鱼ZF4细胞54),小鼠macrophage-like RWA264.7细胞(55]。综上所述,这些数据表明,Wnt /之间的积极的正向循环β连环蛋白和NOX4促进EMT在肺上皮细胞和纤维发生反应的硅灰。

5。结论

总的来说,在目前的研究中,规范化Wnt信号之间的串扰和NOX4调查BEAS-2B SiO人类肺上皮细胞反应₂粒子。的在活的有机体内结果表明Wnt /一个增强的活动β连环蛋白和SiO NOX4信号₂全身的小鼠矽肺肺。的在体外研究显示细胞增殖的抑制作用,随着增强Wnt /β连环蛋白信号活动,活性氧产量的增加,表达NOX4, BEAS-2B细胞暴露于SiO profibrogenic蛋白质₂。分子的研究进一步证明了正则Wnt /之间的串扰β连环蛋白信号和NOX4肺上皮细胞暴露于二氧化硅粉尘;一个激活的Wnt /β连环蛋白信号增加NOX4和ROS生产但减少谷胱甘肽;反之亦然,增加NOX4加强规范化Wnt信号。从力学上看,Nrf2-mediated抗氧化活性可能参与Wnt /之间的交互β连环蛋白和NOX4信号和扮演的角色EMT的肺上皮细胞和纤维发生的过程响应硅接触(图7)。这些研究表明积极的前馈Wnt /之间的循环β连环蛋白和NOX4信号促进EMT产权BEAS-2B细胞暴露于二氧化硅刺激,从而强调profibrogenic角色相声的Wnt和NOX-mediated ROS在矽肺肺上皮细胞损伤和发展,这需要进一步调查。

缩写

阿里:	急性肺损伤癌
ARDS:	急性呼吸窘迫综合征
是:	抗氧化反应的元素
伯灵顿:	Bcl-2-associated X
bcl - 2:	B细胞lymphoma-2
BM:	骨髓
伴着:	骨髓间充质干细胞
CM:	条件培养基
发射极耦合逻辑:	增强化学发光
电动汽车:	细胞外囊泡
hfPMSCs:	人类胎儿胎盘间充质干细胞
HGF:	肝细胞生长因子
HO-1:	谷胱甘肽过氧化物酶
keap1:	Kelch-like ECH-associated蛋白1
Nrf2:	核转录因子2红细胞两个相关因素
msc:	间充质干细胞
PVECs:	肺微血管内皮细胞
ROS:	活性氧
系统性红斑狼疮:	系统性红斑狼疮
T-AOC:	总抗氧化能力。

数据可用性

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

伦理批准

研究和协议经伦理委员会批准办理的生物研究宁夏大学的生命科学学院(NXULS20180123-3)。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

贾马和钱才造成了同样的工作。X.L. F.L.构思和设计实验;J.M.和核进行了实验,分析数据,并起草手稿;共晶,J.Y., J.X., M.Y., Y.L., and F.M. performed experiments and acquired data; J.M. and Q.C. drafted the manuscript; X.L. and F.L. interpreted data and critically revised the manuscript. All authors read and approved the final version of the manuscript.

确认

这项工作是财务支持由中国国家自然科学基金(31860318,31860318,81860566),国家自然科学基金的资助宁夏回族自治区(NZ17169)。

补充材料

增刊。表S1:初级和二级抗体用于免疫染色。增刊。表S2:初级和二级抗体用于免疫印迹。(补充材料)

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