文摘
每天接触皮肤的UVA辐射导致氧化修饰细胞组件和生物分子。这些包括蛋白质参与成纤维细胞的新陈代谢和cytoprotection,和他们的修改会引起细胞功能的中断和皮肤疾病的发展。因此,仍然是一个需要高度活跃cytoprotective化合物具有抗氧化特性。本研究的目的是探讨抗坏血酸对芦丁的活动的影响对UVA-induced人类成纤维细胞的蛋白质组的变化。所有分析都进行成纤维细胞培养在一个三维系统暴露在UVA辐射和孵化芦丁和抗坏血酸。他们使用nano-HPLC蛋白质组剖面进行了分析,显示150之间的蛋白质的表达显著改变治疗条件。UVA辐射导致82蛋白的表达变化。然而,这些改变被减轻分别芦丁和抗坏血酸(分别为23和25蛋白质)和芦丁和抗坏血酸(23)的蛋白质。UVA辐射导致蛋白质的upregulation参与基因表达,蛋白质的差别催化过程和抗氧化途径,对这些绑定活动。然而,芦丁和抗坏血酸单独或一起反驳这些不同程度的变化。 Moreover, rutin and ascorbic acid stimulated fibroblasts irradiated by UVA to increase the expression of the signalling molecules responsible for the opening of the transmembrane channels. In the context of the results obtained, the observed cytoprotective effect of the cooperation of rutin and ascorbic acid results not only from the overlapping properties of the compounds. The effect of rutin alone is probably inhibited by its limited bioavailability. Therefore, its interaction with ascorbic acid increases membrane penetration and improves the cytoprotective effect on skin fibroblasts.
1。介绍
芦丁是酚类化合物中发现不同的植物物种,它有助于植物的抗菌特性(1]。作为一个糖苷结合黄酮醇槲皮素和二糖芸香糖,它有一个化学结构丰富的双键和羟基(图1(一))[2]。芦丁对哺乳动物细胞也产生一些cytoprotective操作(3]。其报告的属性包括强有力的抗氧化活动,与直接清除自由基的能力。芸香苷还可以与细胞内抗氧化系统的组件交互,导致恢复所得到的低分子量抗氧化池,增加抗氧化酶的活性,起始cytoprotective基因的表达(4- - - - - -6]。研究也表明,芦丁减少促炎信号。它通过减少活性氧簇(ROS)水平,抑制环氧酶/脂肪氧合酶的活性,防止细胞膜的氧化代谢的组件(7,8]。
(一)
(b)
芦丁的cytoprotective性质有助于保护皮肤细胞暴露于各种类型的辐射,大大提高细胞生存能力(4,9]。然而,其细胞特性是有限的由于降低了膜的渗透,从而增加紫外线辐射引起的氧化应激(下4]。其他因素也可以刺激细胞吸收芦丁,包括另一个天然抗氧化剂,抗坏血酸(10]。抗坏血酸是一种小分子比芦丁及其化学结构提供了一个广泛的抗氧化能力(图1 (b))[11]。主要的细胞内抗坏血酸的抗氧化作用是通过减少回收的脂溶性维生素Eα-tocopheroxyl激进分子在膜12]。抗坏血酸还可以防止炎症造成的晒伤(13- - - - - -15]。抗坏血酸、芦丁之间的协同效应研究已被广泛证明了分析化合物的口服。这些发现与抗炎和血管密封操作相关的主要是(16]。同时,作为抗坏血酸对胶原蛋白的生物合成(至关重要17)和芸香苷的吸收,直接影响的潜在协同效应芦丁和抗坏血酸在保护皮肤细胞也被描述的18- - - - - -20.]。化合物对皮肤细胞起到保护作用是非常重要的细胞在不同层的皮肤经常暴露在有害的环境因素,包括紫外线辐射,主要出现在阳光下。
紫外线辐射可以破坏各种代谢途径在皮肤细胞中,这个功能被广泛发表的报告中记录(21,22]。紫外线辐射的主要作用是增加一代的活性氧与抗氧化系统的功能障碍(22]。紫外线辐射也与不可逆的氧化修饰在细胞内分子,包括核酸、磷脂和蛋白质。这些修改可能会导致新陈代谢的改变,DNA突变,甚至皮肤癌的发展(23,24]。此外,ROS、高活性脂质过氧化作用的产品,修改结构的蛋白质已被证明为UVB-irradiated成纤维细胞(20.)和蛋白质构象改变,导致修改他们的生物活性25]。预防皮肤细胞的这一行动是至关重要的,主要的蛋白质具有抗氧化和修复性能不仅在DNA分子的参与抗炎或凋亡信号的转导(25,26]。
虽然表面分散的皮肤层的大部分紫外线波长长,UVA辐射(320 - 400 nm)显示了强大的深入渗透肌肤,达到真皮,主要由成纤维细胞(27]。因此,这些成纤维细胞有一个成熟的cytoprotective系统维持细胞内稳态(28]。然而,这些自然细胞防御系统不足以应付与紫外线辐射相关的损伤,需要对肌肤保护化合物的日常使用。同时,这些化合物的不同渗透通过生物膜和多层细胞系统是另一个需要解决的问题。到目前为止,芦丁的合作和抗坏血酸保护蛋白质结构UVB-irradiated皮肤成纤维细胞(20.]。因此,本研究旨在研究抗坏血酸的作用对UVA-induced芦丁的cytoprotective作用的蛋白质组变化的人类皮肤成纤维细胞培养在三维(3 d)系统。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类皮肤成纤维细胞(crl - 1474)得到来自美国文化集合类型(写明ATCC)和培养在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C介质由杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM) 10%胎牛血清(的边后卫)成纤维细胞的标准协议。为了避免细菌污染,媒介与青霉素(50 U /毫升)补充和链霉素(50μg / ml)。后两个段落,细胞被播种在24-well板(500000个细胞/)与AlgiMatrix凝胶(美国加州生活技术)来创建一个三维(3 d)模型。四天的培养后,细胞暴露在UVA辐射(Bio-Link交联剂BLX 365;Vilber Lourmat,德国)的总剂量20 J /厘米2( 海里)。辐照之前,细胞用PBS (4°C)。在这个缓冲区,细胞板搁置被暴露在辐射6灯的组装6 W,对应于4.2 mW /厘米2。细胞和灯之间的距离是15厘米。分析芦丁的影响和抗坏血酸UVA-radiated细胞,我们跟着Gęgotek等的相应方法。20.),专用的UVB辐射导致的变化。辐照后,细胞培养24 h中包含25μM芦丁或/和100年μ抗坏血酸在0.1% DMSO溶液。平行,控制细胞培养介质中含0.1% DMSO溶液。图中显示如图的实验2。
孵化后,使用AlgiMatrix™溶解缓冲区(美国加州生活技术)、成纤维细胞收集的3 d凝胶。细胞被sonification洗PBS和细胞溶解。溶菌产物的总蛋白质含量测定用布拉德福德试验(29日]。
2.2。蛋白质分离和分析
蛋白质组学分析之前,与Laemmli缓冲区被混合变性的蛋白质含有5% 2-mercaptoethanol (1): 1 )和加热10分钟在95°C。初步准备Tris-glycine 10% sds - page凝胶蛋白分离。一夜之间所有乐队都被染色和考马斯亮蓝r - 250。蛋白质是切片和凝固态与胰蛋白酶消化一夜之间(WI Promega,麦迪逊,美国)。获得肽混合物溶解在5%乙腈(ACN) + 0.1%甲酸(FA)和分离 PepMap RSLC毛细管分析C18柱(Dionex LC包装)使用终极3000高效液相色谱(Dionex, Idstein,德国)。筛选了肽进行了分析使用QExactive高频质谱仪(热费希尔科学、不来梅、德国)在一种积极的方式。的细节分析前面描述的(6,20.]。
2.3。蛋白质鉴定和Label-Free量化
原始数据处理使用蛋白质组发现者2.0(热费希尔科学、不来梅、德国)和针对UniProtKB-SwissProt数据库搜索(分类:智人,释放2019 - 04)。肽质量公差将10 ppm, MS / MS质量公差是0.02哒,和两个允许错过分裂被用于蛋白质鉴定。的细节描述了蛋白质识别之前(6,20.]。只有蛋白质至少三个鉴定肽超过6个氨基酸残基,至少有两个独特的肽被选作进一步分析。
2.4。统计分析
分析每个样品进行了三个独立的实验。缺失值估计利用原始数据的最小值的一半归责。结果从单个蛋白质label-free日志和量化 - - - - - -分数转换。统计分析的数据进行了使用免费可用MetaboAnalyst 4.0软件(http://www.metaboanalyst.ca),RStudio软件(R版本操作(2019-12-12)),和珀尔修斯1.6.10.43。主成分分析(PCA)进行了探索性数据分析、R包MetaboAnalyst [30.]。方差分析测试之后,费舍尔事后测试执行与R内置函数。热图创建使用R包pheatmap [31日使用“欧几里得”作为聚类距离和”病房。D”作为聚类方法。
3所示。结果
这一研究获得的蛋白质组学数据允许我们创建一个列表的蛋白质的表达显著改变成纤维细胞培养在3 d和UVA照射后接着用芦丁和抗坏血酸(补充表S1)。这个列表包括150个蛋白质,其中94被确定在控制细胞和128年UVA-irradiated成纤维细胞没有芦丁和抗坏血酸。
芸香苷治疗4蛋白的诱导表达中没有其他治疗组和4在使用抗坏血酸的蛋白质。同样的行为观察细胞处理芦丁UVA照射后/抗坏血酸。所有的数量显著改变蛋白质在细胞接受芦丁或/和抗坏血酸但没有UVA照射细胞被辐照时通常高于UVA(46蛋白质和94)。在这种情况下,化学处理诱导18的表达蛋白中没有发现128个蛋白质表达的细胞治疗只有UVA照射(图3)。
(一)
(b)
使用主成分分析(PCA),我们发现皮肤成纤维细胞的蛋白质组的改变配置文件导致的集群实验小组未照射成纤维细胞(40.9%和28.6% PC2 PC1 UVA-irradiated成纤维细胞和PC1 37.5%, PC2 22.7%)(图4)。在未照射的情况下成纤维细胞,对照组集群抗坏血酸和芦丁+抗坏血酸组,主要是在较低的象限。样品处理芦丁在左上象限(图组装4(一))。观察不同UVA照射后,治疗组内样本主要集中在一起下象限,和抗坏血酸治疗组在右上象限(图组装4 (b))。
(一)未照射的细胞
(b) UVA-irradiated细胞
火山情节比较抗坏血酸、芦丁对细胞的影响由UVA辐射也凸显了一些实验条件下的蛋白质表达改变(图5)。UVA辐射引起了重大改变82年的表达蛋白质。然而,这些变化被这些cytoprotective化合物23和25减毒蛋白,分别在芦丁和抗坏血酸的情况下单独使用,和23个蛋白质在细胞治疗芦丁+抗坏血酸。重要的蛋白质和褶皱的变化的列表(FC)补充表所示S2。这些蛋白质的集群和功能可以在二维可视化分层聚类热图(图6)。在所有的实验中,个人的集群的变化表达的蛋白质的相似性表明他们集群分成三个主要组。在对照组,UVA辐射导致upregulation主要是催化活性的蛋白或转录/翻译的差别监管属性和对这些蛋白质分子与绑定到其他活动(图6(a))。类似的观察是在细胞治疗的情况下芦丁(图6(b))或抗坏血酸(图6(c))在UVA照射。治疗前与这些化合物结合的细胞蛋白质的UVA照射导致upregulation具有抗氧化和转录/翻译活动,以及监管机构的蛋白质降解。(图6(d))。
(一)UVA-irradiated细胞与控制
(b) UVA +常规与Rut-treated细胞
(c) UVA + Asc和Asc-treated细胞
(d) UVA +常规+ Asc和常规+ Asc-treated细胞
4所示。讨论
皮肤细胞暴露在阳光下,这往往会影响细胞代谢由于有害UVA和UVB辐射(22]。UVB-irradiated成纤维细胞蛋白质组学分析表明,这种氧化应激诱导有害因素会导致ROS-dependent蛋白质结构的变化,通过加强脂质过氧化等产品活性醛(4-hydroxynonenal 4-oxynonenal,和丙二醛)导致aldehyde-protein加合物的形成(20.]。此外,UVB已经发现积极的刺激器热休克蛋白90复杂的形成是至关重要的,适当的蛋白质构象(20.]。另一方面,在本研究中使用的剂量UVA辐射还可以修改蛋白质结构,已显示氨基酸残基的直接氧化和先进的糖化创造最终产品(32,33]。这些影响包括多种细胞功能级别的同步变化,包括基因转录、蛋白质生物合成,细胞内代谢,细胞间信号(6),没有诱导坏死。因此,本研究直接集中在蛋白质表达的变化从成纤维细胞暴露在UVA辐射剂量导致细胞代谢显著变化,但允许细胞维持核的完整性。此外,描述的变化发生在UVA-irradiated皮肤细胞,有必要了解体内平衡不仅在细胞层面,而且在组织级别。使用三维细胞培养模型便于观察皮肤组织不同层次的过程,包括细胞内代谢和细胞间信号的变化(34- - - - - -36]。
成纤维细胞的一个主要类型的细胞,构建人类皮肤,但是他们的位置在皮肤内层,真皮,给他们部分表皮细胞抵御外部因素。因此,成纤维细胞穿透UVA辐射非常敏感(37]。支持他们的自卫机制,cytoprotective物质(如芦丁)可以口服或局部。许多治疗芸香苷的药理性质物质已经被描述38- - - - - -40]。但是,先前的研究表明,无论其内容在饮食、低血浆中芦丁的含量限制其生物利用度在有机体所有细胞(41,42]。然而,它也表明,芦丁可以有效地穿透皮肤细胞的三维培养和诱导cytoprotective效应甚至在深厚层(19]。此外,膜运输芦丁可以增强抗坏血酸,大大增加其行动18]。
这一研究获得的结果证实了先前公布的数据,清楚地表明,UVA辐射诱发大皮肤成纤维细胞的蛋白质组的变化(34,43]。结果还表明,芦丁和抗坏血酸展览cytoprotective影响,部分防止UVA-induced蛋白质组的变化不同的细胞类型5,6,15,18,19]。此外,最近,它也被显示,合作的芦丁和抗坏血酸可以防止UVB诱导扰动在蛋白质结构20.]。
主要的蛋白质的表达是对UVA辐射敏感那些参与蛋白质生物合成;我们的数据表明,UVA辐射显著上调表达的蛋白质参与mRNA转录过程,包括伸长因素(A8K9C4、P26641和P49411)、翻译起始因子2 (P41091) (A0A024R2P0)核糖体蛋白质,核糖核蛋白(P62318 Q7Z5A3)。这种细胞反应是旨在防御radio-induced UVA射线造成的压力(44]。
芦丁的cytoprotective作用UVA照射后显著防止translation-inducing蛋白的表达增加,而在此前公布的数据,被建议作为一种抑制致癌作用的方法(39]。抗坏血酸的作用(单独和与芦丁)也促进了这些蛋白的表达,以应对UVA辐射。伸长的变化不仅随处可见因素和核糖体蛋白还在氨基acid-tRNA连接(色氨酸和threonine-tRNA连接,P23381和P26639)。表达的变化导致核糖体的形成,而众所周知,抗坏血酸的增加促进氨基酸的羟基化的核糖体的结构。羟基化的氨基酸胶原蛋白链的形成是必要的,特别是在压力条件下,比如皮肤切口的伤口(43- - - - - -45]。类似的变化我们已经描述了也被观察到具有蛋白质水解蛋白质负责监管。UVA辐射显著增加蛋白质的表达参与降解过程,如蛋白酶体亚基(A0A087WXQ8, P49720、P49721 Q59EG8),与氧化应激引起的UVA (46]。芦丁抵消这些变化,甚至导致减少的泛素羧基末端水解酶(D6RF53)细胞,在UVA。减少这种蛋白质限制的生成泛素单体蛋白加合物(47),从而防止标签的蛋白质降解。类似的效果的蛋白酶体抑制黄酮类化合物已经被观察到(48]。
在我们的研究中,我们还发现,抗坏血酸适度减少一些蛋白质的表达参与降解后UVA辐射。然而,这些蛋白质比在更强烈的调节成纤维细胞没有与抗坏血酸治疗。类似的复杂和模棱两可的抗坏血酸对蛋白酶体活性的影响也被观察到,主要与干扰细胞代谢,如肿瘤细胞(49,50]。成纤维细胞的反应与UVA辐射芦丁和抗坏血酸的行为表明这些化合物,当一起接种,在辐照细胞显著防止蛋白质的降解。这个观察可能与蛋白质结构变化引起的UVA辐射。这些修改可能使蛋白质功能失调和被淘汰的退化,如前所观察到的角化细胞或UVB-irradiated成纤维细胞(20.,51]。然而,芦丁的cytoprotective效果与抗坏血酸保护蛋白质免受氧化损伤和高水平的蛋白酶体亚基在细胞质中不是必要的。
其他组蛋白高度调节的UVA辐射3 d培养皮肤成纤维细胞与催化活性的蛋白质,特别是在糖酵解过程。先前描述的类似的变化也是UVB-irradiated成纤维细胞(20.]。减少暴露于紫外线引起的压力从细胞需要大量的能量,导致额外消耗的葡萄糖和与加速细胞新陈代谢52]。芦丁大大限制了数量的催化蛋白质参与能量反应后UVA辐射和已经被证明能够影响线粒体的能量流程强调通过抑制基质细胞氧化,以及作为氧化磷酸化的解偶联剂53]。抗坏血酸的含量也降低了蛋白质参与肝糖分解(磷酸化酶,P06737)和干扰glutaminolysis(磷酸丝氨酸转氨酶,A0A024R280)。抗坏血酸的作用在ATP生成和能量代谢密切相关,其浓度,以及细胞的条件被发现(54]。作为UVB-irradiated成纤维细胞已被证明和其他皮肤细胞(角化细胞)、抗坏血酸、芦丁、还支持通过细胞有氧能量的生产,特别是在压力下(19,20.]。然而,在成纤维细胞,这两个过程重叠细胞治疗时芦丁和抗坏血酸。这种机制为细胞提供了一个减少线粒体呼吸链电子流动强度,从而减少自由基的生成的可能性(55]。
芦丁和抗坏血酸的抗氧化作用,根据文献主要是基于他们的自由基清除活性56),导致减少了表达的蛋白质的抗氧化系统由UVA辐射强烈激活。这样的一个动作一个例子是影响硫氧还蛋白系统,以前也观察到在UVB-irradiated细胞(20.]。UVA辐射显著改变蛋白质的水平和活动在这个系统19,57),包括thioredoxin-like蛋白质4 b (Q9NX01),这项研究的发现。该系统的抗氧化活性是基于减少NADPH-dependent蛋白质二硫。这是由硫氧还蛋白的结构,确保了,作为一个小thiol-active多肽,是一个重要的电子供体UV-oxidized蛋白质(58]。还UVA辐射诱发的表达胱硫醚gamma-lyase(车车,P32929),催化生物合成的半胱氨酸或thiocysteine。车车的反应细胞活动的增加的需求增加硫醇组织氧化应激(下59),观察UVA照射后产生影响。由于他们有效的抗氧化性能,芦丁和抗坏血酸可能减少自由基大力,防止硫醇基的还原池,UVA照射后发生的成纤维细胞。
稍微不同的情况已经被观察到在角化细胞培养的3 d模型。在这些细胞,治疗与抗氧化化合物另外支持自然细胞抗氧化系统(19]。此外,单独使用时,芦丁和抗坏血酸降低其他抗氧化蛋白的表达在UVA照射后皮肤成纤维细胞,改变的程度减少硫醇等组织谷胱甘肽S-transferase disulfide-isomerase (P21266)和蛋白质(Q15084)。然而,芦丁和抗坏血酸一起使用不仅防止UVA-induced抗氧化系统的激活也沉默蛋白质所需的机械维修,观察热休克同源蛋白的减少(E9PS65)。相似的类黄酮对热休克蛋白水平的影响已经观察到癌细胞,清除突变的机制,是重要的细胞生物(60]。
皮肤成纤维细胞的额外cytoprotective机制对UVA辐射能力提供多层保护皮肤细胞(61年]。在这样一个系统中,细胞之间的通信传输信号的因素是高度发达的62年]。然而,正如前面所示的,紫外线辐射会影响皮肤细胞的功能在这个级别(19,63年]。大幅的表皮,紫外线辐射诱发炎性和proapoptotic信号、芦丁和抗坏血酸防止这些变化(19]。在这项研究中关注真皮成纤维细胞,修改的主要蛋白质表达(排名前50的重要蛋白质)UVA照射后主要与细胞内的膜的功能,包括压敏电阻器阴离子通道2 (VDAC A0A024QZN9)和跨膜emp24 domain-containing蛋白9 (tm, A0A024R7M0)。VDAC是一个主要在线粒体外膜蛋白(在较小程度上,细胞膜)。它促进流动的离子和小分子亲水通过膜(64年]。抗坏血酸是一个这样的分子,但是,相反,它是一种线粒体膜的其他压敏电阻器渠道的有效抑制剂(65年]。此外,芦丁也已被证明能够充当VDAC抑制剂(66年]。因此,在3 d的成纤维细胞培养,我们观察到的表达增加UV-induced VDAC治疗后完全消除这种影响的细胞与芦丁和抗坏血酸。然而,UVA照射后的tm的作用仍不清楚;这种蛋白质的差别,对这些芦丁和抗坏血酸可以防止代谢障碍(67年]。
芦丁,结合抗坏血酸,也导致紫外线照射过的成纤维细胞移植Ras-related蛋白质的表达Rab-5C (P51148)。这种蛋白质活动也与膜结合蛋白密切相关,三磷酸鸟苷水解,参与调节分泌的细胞外信号分子(68年]。其他多酚类物质(如白藜芦醇)可以上调Ras-related蛋白质,Rab [69年,70年]。然而,芦丁没有显示这些属性。这项研究表明,只有可能与抗坏血酸。抗坏血酸促进细胞间通信在氧化应激和保护细胞免受UVA辐射的有害影响。
5。结论
总之,芦丁的强大的抗氧化性能,以及它的影响细胞内和细胞间的信号,可能是抑制其有限的生物利用度。的上下文中获得的结果在这项研究中,这种天然多酚与抗坏血酸不仅需要管理,提高膜渗透但也来补充其cytoprotective影响皮肤细胞与紫外线辐射。芦丁的作用机制的分析和抗坏血酸在不同类型的皮肤细胞,成纤维细胞和角质细胞等(19),特别注意蛋白质组的变化。这些变化主要是蛋白质与基因表达有关,信号转导,抗氧化反应。因此,芦丁的共同和抗坏血酸可以防止UVA射线引起的不良影响,这些发现可以用于皮肤病的预防与辐照和氧化过程。
数据可用性
质谱的蛋白质组学数据被存入ProteomeXchange财团通过骄傲(70年PXD018730)合作伙伴库与数据集标识符。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项研究是由美国国家科学中心、波兰(NCN),批准号2017/25 / N / NZ7/00863。合作者之间的合作是由波兰国家资助的学术交流机构(那霸)作为国际学术合作关系的一部分(PPI / APM / 2018/00015 / U / 001)。感谢也由于金融支持QOPNA (FCT UID /, / 00062/2019)和LAQV / REQUIMTE(选答/ 50006/2020)。
补充材料
重要的蛋白质补充表1:列表显示在三维培养的成纤维细胞治疗芦丁(25μ米)或/和抗坏血酸(100μ米)和后暴露在UVA (20 J /厘米2)。补充表2:列出重要的蛋白质形成火山地块(图5)芦丁(25的效果进行比较μ米)或/和抗坏血酸(100μ米)在UVA - J /(20厘米2在3 d模型)辐照成纤维细胞培养。(补充材料)