强酸性的影响电解铝水通过炎症和氧化应激反应在伤口愈合

文摘

强酸性电解铝水(StAEW)被灭活微生物但不是完全在医疗领域探索。本研究旨在探索StAEW作为一个潜在的伤口护理剂及其机制。StAEW (pH值:2.65,ORP: 1159 mV, ACC: 32.1 ppm)是一天三次喷无毛小鼠皮肤创伤的七天。伤口形态和组织学特性和immune-redox标记与盐水- (Sal)和酒精(Alc)治疗组。结果表明StAEW组显示伤口愈合比例显著高于天Sal小组2,4,5,6,酒精度组4天。StAEW集团早些时候还显示中介等促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α白介素- 6 (IL), IL - 1β和角化细胞化学引诱物。此外,基本成纤维细胞生长因子和血小板源生长因子被发现显著变化的成纤维细胞合成和血管生成。StAEW集团一致显示控制数量的ROS和酒精度组相比显著降低。StAEW集团也有利于氧化应激通过抗氧化反应平衡。此外,基质金属蛋白酶9 (MMP)和MMP1调制为角化细胞和细胞迁移。综上所述,本研究已证明的伤口愈合效果StAEW及其中介早些时候通过氧化和炎症反应。

1。介绍

酸性电解铝水(AEW)或也称为电解铝氧化水是由一台机器通过电解水,稀释盐溶液和水通过并生成水和氧气、氯气、次氯酸盐离子,次氯酸和盐酸组件。酸性水的一般特征是:低pH值(2.2 - -6.5),高氧化还原电位(ORP) (800 - 1100 mV),高可用氯浓度(ACC) (60 ppm)和高溶解氧含量(1]。由于其广泛的pH值,研究人员在这个领域提出了AEW的分类:稍微AEW (SAEW)、弱AEW (WAEW),和强大的AEW (StAEW)。自生产酸性水的发现,一些研究已经进行了多年,证明其功效在杀死微生物,真菌,病毒,和灭活毒素1]。它还研究了影响消毒食品设备、蔬菜、水果、家禽和肉类;洗手;和医院的杀菌作用2- - - - - -4]。最近的研究在AEW得出其破坏细胞膜和细胞内稳态荧光假单胞菌生物膜(5),还发现提高活性氧(ROS)的清除能力水果的增强可存储性(6]。

了解AEW可能促进伤口愈合,重要的是要知道伤口愈合过程。伤口愈合是一个复杂的重叠,但系统性机制强烈控制恢复皮肤的完整性。的过程由四个阶段即:止血,炎症扩散和装修阶段。因为它是一个复杂的机制,涉及到几个因素,如营养、缺氧、感染、免疫抑制、慢性疾病、伤口管理、年龄、和遗传学(7]。此外,pH值有很大的影响在伤口愈合,因为它影响控制伤口感染,增加抗菌活性,改变蛋白酶活动如基质金属蛋白酶(MMPs)和组织基质金属蛋白酶的抑制剂(TIMPs),释放氧气,减少细菌的终端产品的毒性,增强上皮形成和血管生成8- - - - - -11]。因此,越来越多的研究使用的伤口护理代理或伤口敷料,控制和改变pH加速愈合过程。伤口的恶化阶段取决于伤口类型及其病理条件以及敷料材料的类型。一些标准的着装选择提供防止细菌感染的能力,增强表皮迁移,并促进血管生成和结缔组织合成,必须无菌,无毒,nonallergic [12]。然而,一些伤口愈合的安全代理仍然可以由于其副作用构成威胁。一般StAEW被报道为安全在体外和在活的有机体内。StAEW得出结论,酸性水的生物相容性研究没有显示细胞毒性甚至在剂量依赖性的方式,和皮肤刺激测试人类表皮模型报道StAEW无刺激性(13]。另外,另一项研究得出的结论是,电解铝水一般安全就是明证细胞毒性试验和磷脂泄漏检查14]。此外,氧化应激反应和免疫反应的参与在伤口愈合在治疗伤口护理研究的关键之一。的良好平衡活性氧(ROS)和抗氧化酶也称为氧化还原平衡会导致一个正常的和成功的伤口愈合过程15]。

免疫学和氧化应激调节已被证明调解皮肤疾病,如过敏性皮炎(16]。自从AEW生产的发展,一些研究已经完成多年来探索它的功能在医学领域。由于其广为人知的抗菌效果,一些研究得出的结论是,它可以有效的在伤口愈合17,18]。然而,这些研究没有充分探讨AEW促进皮肤伤口愈合。知道这水的不同性质和特点,和复杂性和伤口愈合的相关因素,然后,我们假设StAEW可以是一个有效的伤口愈合剂,我们试图找出如何StAEW促进伤口愈合的机制通过测量氧化应激和免疫反应的标记和比较其效果与其他的伤口护理剂。

2。材料和方法

2.1。制备StAEW、盐和酒精

StAEW从电解水生成机(HDR,爱奥尼亚有限公司。Bucheon,韩国),在自来水和1%氯化钠溶液添加到机器和StAEW收集在阳极区。自来水有pH值的属性:7.62,ORP: 500 mV, ACC: 0.2毫克/毫升,和StAEW pH值:2.65,ORP: 1159 mV, ACC: 32.1毫克/毫升。盐水(Sal)解决方案(0.9%氯化钠、生命科学有限公司有限公司Dangjin,韩国)和70%酒精(Alc) (SK化工、韩国蔚山、韩国)准备作为对照组。

2.2。动物分组

女性,已无毛小鼠( )从东方购买生物有限公司,凭借韩国,放置在一个塑料笼( ,5每笼老鼠)。首先,老鼠适应一周并保持在室温条件下22°C,湿度40 - 60%的12:12 h光明与黑暗。动物与10小鼠随机分为四组:NC:正常的控制,没有伤口诱导组;和wound-induced组:萨尔:saline-treated组;酒精度:alcohol-treated组;和StAEW:强酸性电解铝处理的水。机构的动物保健和使用委员会(IACUC),延世大学Wonju校园(ywc - 170907 - 1),批准了动物使用和协议在本研究完成的。

2.3。伤口感应和治疗

诱导的伤口,总共有六个伤口每个部分后面创建无毛小鼠后协议(19)通过使用5毫米活检穿孔(美国宾夕法尼亚州Integra-Miltex)。伤口被喷洒2毫升的治疗方案治疗受伤的区域,一天三次连续吃七天。

2.4。伤口面积测量和检查

伤口大小使用数字游标卡尺测量量表(日本三丰公司Corp .)测量的长度和宽度两个伤口位于中间的一部分老鼠,伤口面积计算。伤口愈合比例测量使用以下公式(20.]:

伤口观察宏观上,数码照片拍摄每天检查和比较每个老鼠伤口的状态。

2.5。血液收集和血清制备

牺牲后第七天,收集血液样本从retroorbital丛穿刺采用EDTA(乙二胺Tetra-Acetic酸)和BD Microtainer®。约,血液收集每个管/鼠标microcontainer和用于血液和生化分析仪。简而言之,EDTA microcontainer血液用于白细胞(WBC)分析通过彻底搅拌3 - 5分钟自动滚动混合器和统计的血液学分析仪(Hemavet®HV950 FS;把科学、Erba诊断,Inc .)、美国达拉斯,得克萨斯州)。BD Microtainer®每个老鼠的血液样本进一步离心机 10分钟在4°C血清和保持在-80°C到分析。

2.6。皮肤溶解产物制备

相同大小的皮肤组织从背区域被切断,并放置在冰冷的里帕缓冲区(皮尔斯生物技术有限公司)与蛋白酶和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。当时皮肤原油溶解产物均质在25 rpm 15分钟使用一个组织溶解II(试剂盒,医学博士,美国)。然后溶解产物离心5分钟,上层是收集和转移到一个新的epitube和保持在-80°C到进一步使用。皮尔斯BCA分析工具包(美国热科学,罗克福德,IL)被用来检查总蛋白浓度。

2.7。组织学检查

每组的代表皮肤被切断从伤口面积和缓冲福尔马林固定在10% (0.1 M磷酸盐缓冲剂,pH值7.4),通过分级脱水乙醇系列,通过二甲苯,嵌入在石蜡(美国WA Polyscience)。石蜡切片是切成4μ米厚的切片机(Reichert Inc .纽约,美国),彩色苏木精和伊红染色,光学显微镜下观察(BA300, Motic有限公司、香港、中国)。

2.8。WBC及其微分项考试

总白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞计数测量的自动血液分析仪(HEMAVET HV950 FS,吸引了科学Inc .,达拉斯,得克萨斯州,美国)。

2.9。总活性氧检测

通过测量总ROS DCFH-DA(美国Abcam、剑桥、马)后,制造商的手册。总之,25μ血清和50 LμL皮肤溶解产物被镀成一个96孔板。然后,100年μL (10μM DCFH-DA添加到井,板在黑暗中孕育了30分钟。荧光板的阅读488海里激发/ 525海里排放使用dtx - 880多模标(贝克曼计数器Inc .,富勒顿、钙、美国)。

2.10。抗氧化剂酶化验

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性和过氧化氢酶(CAT)皮肤溶解产物测定使用Biovision工具包(苗必达、钙、美国)制造商的指示。总之,从皮肤蛋白质浓度溶解产物规范化使用皮尔斯™BCA蛋白质化验设备热科学(美国伊利诺斯州),每个试验的标准准备,每个试验的试剂混合在96 -微量滴定板,和吸光度是阅读在340 nm (GPx)和510 nm(猫)。

2.11。细胞因子和生长因子的分析

血清细胞因子白介素- 1 (IL)等β、白介素、肿瘤坏死因子(TNF)α,角化细胞化学引诱物(KC)和生长因子,如血小板源生长因子(PDGF)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)测量使用珠阵列悬挂多路复用设备(美国Bio-Rad,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。标准曲线为每个细胞因子生成使用中给出的参考浓度工具包。标准和样本多路珠悬浮阵列系统中读取(200年Bio-Plex BIO-RAD®、钙、美国)。

2.12。免疫印迹分析

蛋白表达的MMP1、MMP3、MMP9 (Abcam、剑桥、马、美国)被执行西方墨点法测量。皮肤准备规范化溶菌产物同样加载并在SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离。然后转移到硝化纤维膜被封锁在5%的脱脂牛奶tris-buffered盐水(TBS)含0.1%渐变20 1 h在室温下。阻塞后,膜与初级孵化抗体在4°C风潮。随后孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体在室温下1 h。这些墨迹是使用化学发光免疫印迹检测系统(BioSpectrum®600成像系统,高地,CA,美国)。

2.13。统计分析

组之间的平均值分析GraphPad Prism 5.0版本软件包(美国GraphPad拉霍亚,CA),然后使用单向方差分析比较(方差分析)其次是随后的多重比较测试(图基)。一个值≤0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

StAEW对伤口愈合的影响比例和伤口愈合伤口形态和组织学的百分比StAEW比较与生理盐水(Sal)和酒精(Alc)治疗受伤的老鼠。伤口愈合的百分比StAEW组明显高于天Sal小组2,4,5,6,酒精度小组第四天(图1(一))。最后的七天,伤口愈合比例最高StAEW组比萨尔和酒精度组,表明,伤口愈合7天在71 - 77%。图1 (b)显示代表伤口的形态变化的老鼠从每组从第0天到第七天的治疗。组织学分析,表皮的厚度StAEW组更明显的类似于NC组和紧随其后的是萨尔组,虽然酒精度组显示的表皮明显增加表皮层(图的扩散1 (c))。此外,免疫细胞的存在更多的是观察酒精度组和小StAEW组。

3.1。总共StAEW WBC及其微分项的影响

我们检查了总白细胞及其微分项的变化。表1显示与NC组相比,萨尔( )和酒精度( )组白细胞总数减少,但是没有统计上显著的减少StAEW组。我们发现,中性粒细胞计数被类似的在所有治疗组。然而,淋巴细胞计数是减少StAEW-treated组( ),和萨尔- Alc-treated组( )而数控组。同样,单核细胞在StAEW显著降低,萨尔,酒精度组( )而数控组。

3.2。StAEW在活性氧和抗氧化酶的影响

探索它对氧化应激的影响,结果表明,ROS水平StAEW组的血清活性氧的最低水平,比酒精度还显示明显降低集团( )。皮肤溶解产物,ROS水平表现出类似的趋势:酒精度集团始终明显高于ROS水平相比数控( ),萨尔( ),和StAEW组( )(图2)。抗氧化酶的活动,在萨尔GPx水平有显著提高( ),酒精度( ),和StAEW ( )组织与NC组。过氧化氢酶的活动,另一方面,发现低StAEW相比数控( )和萨尔( )组(图3)。

3.3。StAEW在炎性细胞因子的影响

探索StAEW中介的各种炎症介质如细胞因子生产,我们测量il - 1的浓度βKC, il - 6和TNF -α。我们的结果表明,il - 1βKC, il - 6和TNF -αStAEW集团的浓度明显下降相比数控(图4)。在细节中,il - 1β酒精度和StAEW-treated组相比显著降低NC ( )和萨尔组( )。另一方面,只有StAEW显示显著减少il - 6浓度相比数控( )和萨尔组( )。也观察到,酒精度组的il - 6的浓度明显低于NC组( )。同样,肿瘤坏死因子-α显示与il - 1类似的趋势β在酒精度和StAEW组相比显著降低NC组(两种 )和萨尔集团( , ,分别)。KC浓度表现出类似的趋势显著减少的治疗组相比,数控( )。KC浓度的减少也观察到在萨尔和StAEW组( )。

3.4。StAEW在生长因子的影响

我们还测量了PDGF的浓度和bFGF和发现他们明显改变了NC组相比。相比数控,PDGF显示显著增加水平Sal ( )和酒精度( )组而不是一样增加StAEW集团( )。此外,显著增加StAEW组bFGF的表达被认为比NC和萨尔组( )(图5)。

3.5。StAEW MMP的表达的影响

伤口愈合的另一个重要的调制器是MMP的活动。我们的结果表明,可以和MMP9表达调节在所有组,但没有观察到MMP3相比数控组。相对MMP9的表达显示有显著upregulation萨尔( ),酒精度( ),和StAEW ( )组,而萨尔组显示表达最高,明显高于酒精度( )和StAEW ( )组。同样,在萨尔MMP1表达也显著调节( ),酒精度( ),和StAEW ( )组与NC组(图6)。

4所示。讨论

酸性水已经知道不同微生物灭活。我们确认的功效实验水杀死微生物,如金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌相比其他类型的水(补充图1)。在此背景下,本研究证明StAEW也可以加强在SKH-1无毛小鼠皮肤创伤愈合的影响通过减轻炎症和氧化反应,从而促进伤口早期伤口收缩和血管新生组织。这是第一个支持更高的伤口愈合的百分比StAEW-treated组经过7天的治疗尤其是在早期(2到6天)。我们与StAEW组织学结果显示治疗,受伤的表皮区域高度比其他可用常规伤口清洗剂和完整显示较小的炎症细胞浸润。探索进一步的治疗疗效的可能机制,重要的是要知道的参与炎症和氧化反应在伤口愈合过程及其标志。

众所周知,白细胞发挥重要作用在伤口愈合和组织修复过程中特别是在伤口愈合的早期阶段。在损伤,炎症细胞迁移到损伤区域,促进炎症阶段,进一步以顺序但重叠的中性粒细胞的浸润,巨噬细胞,淋巴细胞(21,22]。在我们的研究中,减少白细胞计数特别是淋巴细胞和单核细胞表明治疗组的中介在伤口愈合。这个中介StAEW组织学上以较小的存在也支持在这个伤口炎症细胞阶段相对于其他组。

继续探索免疫和氧化应激反应在伤口愈合,我们还探讨了StAEW介导的氧化应激反应。一定量的ROS是研究正常愈合反应中发挥重要作用。他们的一些角色包括行动通过吞噬作用作为东道主的辩护,也作为第二信使的免疫细胞,调节血管生成(23]。这个控制数量的ROS清除活性氧的抗氧化的作用,在这一过程被称为氧化还原内稳态15]。一致,控制数量的ROS StAEW治疗血清和伤口面积可能会建议其有益的中介在伤口愈合过程,而ROS的显著增加血清和皮肤溶解产物Alc-treated组可能会建议其氧化应激损伤后治疗。生产过剩的活性氧引起氧化应激造成细胞毒性和延迟伤口愈合过程,并消除这些贡献ROS可能是伤口愈合的重要策略。支持这一点,似乎生产抗氧化酶介导StAEW早些时候。至关重要的是要注意,在伤口愈合抗氧化酶的功能是在一个时间和空间表达式模式(24]。因此,抗氧化剂酶GPx和猫的估计肉芽组织有关,因为抗氧化活动已报告加速伤口愈合效果通过减少自由基25- - - - - -27]。因此,StAEW治疗后获得的抗氧化水平,以及减少ROS,似乎会阻止氧化损伤,促进愈合过程。

进一步证实StAEW中介的免疫反应,细胞因子和生长因子参与愈合过程的检查和化验。经过仔细检查,细胞因子,il - 1β、il - 6、TNF -α,KC追究中介对伤口愈合治疗组的反应。促炎细胞因子il - 1β、il - 6和TNF -α发布的中性粒细胞,巨噬细胞和角化细胞和触发炎症细胞增殖和也参与促进血管生成(28]。此外,趋化因子的显著变化,KC, epithelialisation可能属性功能,血管生成,组织改造(29日]。这些细胞因子的显著减少StAEW-treated组显示了潜在的StAEW中介早些时候在这些细胞因子促进愈合过程。我们的研究结果表明,与StAEW Alc-treated组也有相似的效果这些细胞因子;然而,更多的减少趋势观察StAEW组。除了细胞因子,生长因子也在加速愈合过程发挥重要作用。在这个伤口阶段,中介PDGF StAEW,这是很重要的在伤口愈合和功能的早期炎症,肉芽组织形成,reepithelialisation,矩阵的形成,和改造30.),没有比萨尔和酒精度组。另一方面,bFGF,扮演着一个重要的角色在改造阶段和功能在血管增生和肉芽组织的形成31日),显示StAEW显著。我们的研究结果显示,在这个伤口阶段,StAEW似乎调解bFGF的PDGF和增加生产降低生产速度比其他传统的伤口愈合剂。

在扩散和伤口愈合的改造阶段后期,基质金属蛋白酶及其抑制剂在不可逆转的改造中发挥关键作用主要基质金属蛋白酶降解细胞外基质的物质。最近,基质金属蛋白酶,也负责炎症,上皮修复、决议。同样重要的是要注意,有一个特定的位置和伤口阶段调节和表达下调MMP的行动32]。我们的结果显示upregulation MMP9的蛋白质和MMP1表达受伤的老鼠组MMP3的差别,对这些基因的表达可能意味着伤口阶段在老鼠的牺牲。众所周知,MMP9在伤口边缘由角化细胞促进细胞迁移和reepithelialisation也是通过激活TNF -参与血管生成α和VEGF (32]虽然可以促进角化细胞迁移33]。此外,MMP3是没有必要为角化细胞扩散或迁移,胶原蛋白合成,细胞外基质的重塑,但对伤口收缩有显著影响(34]。我们的结果显示upregulation MMP9和StAEW MMP3证明中介这些蛋白质,和减少水平可能会建议其速度比萨尔中介在这些基质金属蛋白酶和酒精度组。

综上所述,可以肯定的是,除了已知的和强有力的杀菌药物,如萨尔和酒精度,StAEW不仅证明是有效的,也显示了其先前的中介在伤口愈合过程。这是通过中介在免疫反应,可以在较小的炎症细胞,减少炎症细胞因子和wound-stage-dependent生长因子释放,和氧化反应,通过提供一个氧化还原环境必不可少的伤口愈合过程,显示控制的活性氧和抗氧化酶的显著差异,也通过交联wound-stage-dependent MMP的表达。随着越来越多的证据和研究证明StAEW的功效不仅杀死微生物,还在伤口愈合过程中,重要的是要确保StAEW保留在伤口的网站。方法之一是刚准备StAEW和伤口上的重复应用网站。我们的研究表明,一天三次被发现有效的应用程序。然而,进一步的研究可能需要检查应用程序的频率以及可能遭受的使用或保留StAEW水凝胶的发展。然而,最近的一份报告表明,pH值等物理性质,ORP,和可用氯浓度电解铝水可能会影响存储,温度,和曝光35),重要的是要确保StAEW准备和存储最大化其完整的治疗功效。总之,StAEW可以作为防腐剂在伤口和伤口敷料。这个结果与之前的研究一致,我们的实验室报告immune-redox调制的微酸性水(pH值:5 - 6.50,ORP: 800 mV, ACC: 25 ppm)在皮肤的伤口36]。多年来,一些消毒剂如酒精度和萨尔一直用于伤口护理剂。然而,由于其化合物的化学性质,它是可能的,这些药物都有副作用。使用StAEW作为伤口敷料的优点包括其更快的治疗功效比酒精度和萨尔。此外,由于酸性水已被公认为一个安全的化合物所示的生物相容性研究[13,14),包括毒性和mutagenicty研究在伤口愈合35),甚至在皮肤上的应用程序37在伤口护理),使用这个代理可以更有利的和更好的选择的化学消毒剂。此外,StAEW成本效益也是众所周知的由于其经济设置一代使用盐和自来水。

需要更多的研究来探讨交联免疫反应和炎症因子等参数和其他潜在的性别和其他老鼠菌株的使用,这可能影响StAEW早些时候中介的愈合过程。深入研究检查每个伤口StAEW阶段的影响将是一个伟大的未来研究完全理解其影响伤口愈合的反应和充分利用StAEW的应用。

数据可用性

数据将根据要求提供相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是博士论文的一部分Ailyn Fadriquela [38]。作者还想承认的帮助Jesmin Ara博士和Soon-Bong歌组织学分析在这项研究完成的。这项工作是由共和国教育部支持朝鲜和韩国国家研究基金会(nrf - 2016 s1a5b8925203)。

补充材料

补充图1。金黄色葡萄球菌(A)和铜绿假单胞菌(B)文化对待不同类型的水。PW:纯净水;TW:自来水;DW:蒸馏水;StAEW:强酸性electroyzed水。(补充材料)

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