二甲双胍改善β胰岛素降解酶在阿尔茨海默病转基因小鼠模型中的病理学研究

摘要

阿尔茨海默氏病（AD）是最常见的神经变性疾病。β淀粉样蛋白的积累（Aβ）是AD的主要病理。二甲双胍，公知的抗糖尿病药，已被报道具有AD-保护作用。然而，这一机制目前还不清楚。在这项研究中，我们试图找出是否二甲双胍能激活胰岛素降解酶（IDE），以改善一β诱发病变。Morris水迷宫和Y型迷宫结果表明，二甲双胍可以提高APP的学习和记忆能力^SWE/第1页^德9（APP / PS1）的转基因小鼠。¹⁸F-FDG PET-CT结果显示二甲双胍能改善APP/PS1转基因小鼠的神经功能紊乱。PCR分析表明，二甲双胍能有效提高神经及突触相关基因的mRNA表达水平(SYP，天然气，和Bdnf)在大脑中。二甲双胍可降低氧化应激(丙二醛和超氧化物歧化酶)和神经炎症(IL-1)β和白细胞介素-6）在APP/PS1小鼠中。另外，二甲双胍能明显降低AβAPP/PS1小鼠大脑水平。二甲双胍不影响A的酶活性和mRNA表达水平β-相关分泌(ADAM10，BACE1，和PS1)。同时，二甲双胍也没有影响到A的mRNA表达水平β- 相关转运体（LRP1和愤怒)。二甲双胍在APP / PS1小鼠脑，这可能是二甲双胍对AD键机构增加对AMPK和IDE的蛋白水平。总之，众所周知的抗糖尿病药，二甲双胍，可能是AD治疗前景的药物。

一。介绍

阿尔茨海默氏病（AD），慢性进行性变性疾病，在本世纪发病率较高，与病情进展认知和功能的能力下降。AD是一种主要特征是β淀粉样蛋白的积累（β）在大脑斑块和神经原纤维缠结（NFTs的）1-3]. A的积累β淀粉样前体蛋白（APP）是AD的主要特征[4]。因此，针对甲β导致了潜在的治疗策略[五]。然而，一系列的临床试验，例如抑制剂β-分泌酶（BACE1）或γ-secretase（PS1）失败[6，7]. 促进β被认为是作为一种替代的治疗策略[8]。

糖尿病（DM）也与AD的高风险相关[9，10]，其中胰岛素缺乏或胰岛素抵抗可以负责。二甲双胍，作为主要的抗糖尿病药，已被证明，以减少β分泌酶活性，促进磷酸 - 苏氨酸 - 231-tau蛋白降解，并影响线粒体功能[10-14]. 最近，一些在糖尿病中被广泛研究的分子已经被证明能影响β间隙，包括胰岛素降解酶（IDE），脑啡肽酶（NEP），受体晚期糖化终产物（RAGE），和基质金属蛋白酶（MMPs）15-19]. 在这些分子中，IDE在糖尿病和AD中都起着重要作用。IDE基因的功能缺失突变可导致β[20]。共存并用IDE的共沉积β斑块可以在AD大脑中发现。脑内IDE抑制被认为是DM和AD间串扰的主要因素之一[21]。然而，二甲双胍是否能通过IDE途径保护AD仍不清楚。

APP^SWE/第1页^德9（APP / PS1）双转基因小鼠用于该研究。在APP / PS1小鼠表现出甲β斑块形成和记忆障碍，与临床表型相似[22]包括记忆缺陷、焦虑、多动症和社交障碍。二甲双胍（Metformin）是一种实验性的治疗方法，被用来探讨二甲双胍通过IDE信号在APP/PS1小鼠中保护AD的假说。

2.材料和方法

2.1。物料

二甲双胍和硫磺素T（ThT的）试剂购自Sigma-Aldrich公司（圣路易斯，MO，USA）购买。甲BCA蛋白测定试剂盒和超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒购自碧云天生物技术获得。丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）由南京建成生物工程研究所（南京，中国）。定量PCR的试剂和ECL试剂盒购自Invitrogen。所有抗体购自Cell Signaling Technology公司（丹弗斯，MA，USA）获得。

2.2条。动物和治疗

7月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠和野生型小鼠（C57BL/6）取自南京大学模型动物研究所（中国南京），在广州医科大学实验动物中心饲养，标准住房条件下，可免费获得食物和水。动物管理由广州医科大学动物保护与利用专业委员会（SCXK2019-0013）批准。所有小鼠随机分为三组：野生型（WT， ),APP / PS1（ ),和APP/PS1+metformin (200 mg/kg/day, ）[23，24]。口服给药8周后，小鼠中进行行为学测试，随后牺牲了脑筋的集合。

2.3。莫里斯水迷宫实验

进行Morris水迷宫测试，以评估空间内存性能。The opaque platform with a diameter of 10 cm was positioned 1 cm beneath the water surface. The duration of training and testing session was 60 s. In the training session, mice completed four trials daily with at least 20 minutes of interval between two trials for six consecutive days. Each mouse was released into the water by facing the wall in one of the four quadrants. If the mouse failed to reach the platform within 60 s, it would be directed to the platform and stay there for 15 s. In the testing session, the platform was removed from the pool and the mice were allowed to search for the platform for 60 s. A computerized video imaging analysis system (Feidi, Guangzhou) was used to record and analyze the swimming paths in the maze.

2.4。Y型迷宫测试

进行Y型迷宫测试评价工作内存性能。该装置由三个武器（一个起始臂和两个目标臂） cm由一个交点连接。培训和测试时间为2分钟。在训练和测试之前，通过限制食物，老鼠的体重会减少到90%。在训练期间，小鼠每天完成10个试验，两个试验之间至少间隔20分钟，连续4天。在奖励交替测试之前，每只老鼠会吃掉在手臂末端被填满的食物4-6次，以适应迷宫。每个目标手臂的选择应该是均等的，正确选择的百分比将被计算并分析。

2.5。¹⁸F-FDG PET显像

注射二甲双胍8周后，用microPET-CT评价脑葡萄糖摄取。¹⁸F-Fluordeoxyglucose (¹⁸F-FDG）腹腔注射到动物体内。将小鼠通过使用焦点220的microPET扫描仪（西门子医疗美国公司，诺克斯维尔，TN，USA）扫描。Dynamic scans were conducted for 1 h. PET images were reconstructed using the microPET-CT manager (Siemens Medical Solutions USA, Inc.). To evaluate relative glucose metabolism, the ratio of the SUV standardized uptake value was obtained by dividing the SUV of each region with the SUV of the whole brain.

2.6条。ELISA法

脑组织用盐水匀浆，含有蛋白酶抑制剂的混合物。样品经离心 15分钟。测量了IL-1的上清液β，IL-6（赛默飞世尔科技），Aβ1-40，甲β1-42（Invitrogen）中，并α-,β- 和γ分泌酶（R＆d系统，USA）通过根据制造商的建议，使用ELISA试剂盒。

2.7。ThT的染色

将切片在PBS中在室温下洗涤三次，然后用试剂的ThT孵育（50 μM) for 30 min. After washing three times in PBS, the sections were captured by a fluorescence microscope (Leica).

2.8。SOD、MDA含量测定

脑组织匀浆并通过离心 15分钟。根据试剂盒说明书(南京建城生物工程研究所)，用上清液检测SOD活性和MDA水平。

2.9。定量PCR

使用TRIzol试剂从脑组织的总RNA提取。逆转录用的ExScript RT试剂盒（Invitrogen公司）进行处理。实时PCR分析使用SYBR预混防爆Taq酶（Invitrogen公司）进行。该转录考察了几个靶基因，其中包括突触素（SYP):5 -GTGCTGCAATGGGTCTTCG-3和版本5 -CCGTGGCCAGAAAGTCCAG-3 ;神经生长因子（天然气):5 -CAAGGACGCAGCTTTCTATACTG-3和版本5 -CTTCAGGGACAGAGTCTCCTTCT-3 ;脑源性神经营养因子（Bdnf):5 -TACTTCGGTTGCATGAAGGCG-3和版本5 -GTCAGACCTCTCGAACCTGCC-3 ;含域的解聚素及金属蛋白酶蛋白10（ADAM10):5 -TTCTCCCTCCGGATCGATGT-3型和版本5 -ATACTGACCTCCCATCCCCG-3 ;β-分泌酶1（BACE1):5 -ACTTTACACTCTGTTCTGGGTGG-3和版本5 -ACCACAAAGCCTGGCAATCTC-3 ;早老1（PS1):5 -aatgacgaacggtgaggg-3型和版本5 -ccagataggtcttccccg-3型 ;低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1):5 -GGACCACCATCGTGGAAA-3和版本5 -TCCCACGCGTGATAG-3型 ;受体晚期糖化终产物（愤怒):5 -GGACCCTTAGCTGGCACTTAGA-3和版本5 -GAGTCGTCGGGTCT-3型 ;和β肌动蛋白：对于5 -AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3和版本5 -AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 。

2.10。Western印迹

新鲜脑组织用含1%苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液匀浆。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离样品，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。用5%牛血清白蛋白封闭吸附膜。将膜在4℃下孵育过夜，主要抗体如下：抗p-AMP-活化蛋白激酶（AMPK）、抗AMPK、抗IDE、抗NEP和抗-β肌动蛋白。所有抗体购自CST购买。将膜在室温下的二级抗体一起温育。将膜覆盖着从ECL化学发光底物试剂盒混合液。所述条带通过一个发光图像分析仪（Invitrogen）中进行扫描。

2.11条。统计分析

所有的统计分析采用SPSS 20.0软件进行。单因素方差分析（ANOVA）和Student -用实验进行分析。数据表示为 。 被认为是显著。

3.结果

3.1条。二甲双胍改善APP/PS1小鼠学习记忆障碍

为了证明二甲双胍对APP / PS1小鼠的治疗效果，Morris水迷宫和Y-迷宫试验用来评估认知功能。结果表明，APP / PS1小鼠遭受认知功能明显下降。二甲双胍能显著改善逃避潜伏期，增加穿越时间，并缩短找到平台的时间（图图1（a）-图1（c）). 三组间游泳速度差异无统计学意义（图1（d）)。在Y迷宫测试中，APP / PS1小鼠显示自发交替一个显著下降的趋势，相比于WT组。二甲双胍治疗后，将小鼠表现出比APP / PS1组更好的性能（图1（e）中)。

3.2。二甲双胍改善在APP / PS1小鼠脑功能

降低葡萄糖代谢是AD的特征症状。¹⁸F-FDG-PET用于评估脑代谢。如图2，微PET-CT成像建议¹⁸APP/PS1小鼠的F-FDG摄取强度明显降低。二甲双胍显著增加¹⁸APP/PS1小鼠大脑F-FDG摄取。神经营养因子(Bdnf和NGF）和突触因子（SYP）在APP被显著减少/ PS1小鼠（图图3（a）-3（c）)。二甲双胍可显著提高神经营养因子和突触相关蛋白的mRNA表达水平。

3.3条。二甲双胍减轻APP/PS1小鼠脑内氧化应激和炎症反应

神经氧化应激和炎症是AD的主要病理机制[25]. APP/PS1小鼠脑组织MDA含量升高，SOD活性降低（图4（甲）和4（b）). 二甲双胍能明显缓解氧化应激状态。此外，炎症标志物IL-1的水平βAPP/PS1小鼠脑内IL-6显著升高（图4（c）和4（d）)。二甲双胍降低IL-1的水平β还有IL-6。提示二甲双胍对APP/PS1小鼠氧化应激和炎症有抑制作用。

3.4。二甲双胍降低了βAPP/PS1小鼠脑内的蓄积

积累β是AD的主要病理特征。APP / PS1小鼠脑重载用甲β。因此，Aβ水平进一步研究。ELISA结果表明，二甲双胍有效地减小A的水平β1-40和β1-42在APP/PS1小鼠的大脑中(图1)5（甲）和图5（b）)。的ThT染色结果进一步证实了二甲双胍改善的βAPP/PS1小鼠脑内积聚(图图5（c）)。这些都是强有力的证据表明二甲双胍可降低β积累APP / PS1小鼠。

3.5。二甲双胍激活AMPK，并提高IDE在APP / PS1小鼠脑组织

我们下一步研究二甲双胍如何影响β代谢。该APP的顺序裂解通过β- 和γ分泌酶可以产生Aβ[26]。因此，我们首先检测到这些分泌。ELISA结果表明，二甲双胍有没有影响α-,β-， 要么γ-秘书（图图6（a）-图6（c）). 基因表达水平ADAM10，BACE1，和PS1也进行了测试。二甲双胍没有影响，除了有轻微的下降，这些基因表达水平BACE1（数字图6（d）-图6（F）)。接下来，我们检测到的一个β运输相关的基因。结果表明，二甲双胍也对mRNA表达水平无影响LRP1和愤怒（数字6 (g)和6 (h)）。此外，IDE和NEP，作为A的降解酶β，是A的过程等关键环节β过关。我们评估在APP / PS1小鼠脑中的IDE和NEP的蛋白表达水平（图7)。IDE并NEP表达水平显著在APP / PS1小鼠降低相比于野生型小鼠。二甲双胍显著增加IDE的表达水平，但不NEP，在APP / PS1小鼠。以前的研究报告说，AMPK途径参与二甲双胍效果[24，27-三十]。我们的结果证实了这一现象。二甲双胍显著提高p-AMPK蛋白表达水平。这些数据提示IDE信号通路可能参与二甲双胍的神经保护作用。

四。讨论

在这项研究中，我们证实，抗糖尿病药，二甲双胍，可在APP / PS1有效改善AD症状双转基因小鼠。8周治疗后，我们发现，二甲双胍可以缓解学习和记忆功能障碍，提高脑功能。同时，二甲双胍可抑制信号地氧化应激和神经炎症。此外，二甲双胍激活AMPK并增加在APP / PS1小鼠的大脑，这可能是二甲双胍的关键神经保护机制IDE。

一个β积累是AD的主要病理，这可能会导致级联反应和诱导神经细胞凋亡[31]。研究表明二甲双胍对AD患者有益[10-12]. 本实验进一步探讨了二甲双胍对APP/PS1小鼠的神经保护作用机制。我们做了初步实验：给APP/PS1小鼠不同剂量的二甲双胍（25、50、100和200毫克/千克/天）。Morris水迷宫试验结果表明二甲双胍（200毫克/千克/天）是最佳剂量（数据未显示），这与以前的研究一致[23，24]。行为研究（Morris水迷宫和Y型迷宫）证实二甲双胍能显著改善APP / PS1小鼠，这与以前的研究相一致的学习和记忆。此外，二甲双胍改善脑代谢和脑功能和减少A的电平β。

一个β积累加剧氧化损伤和炎症。一个β可以提高超氧阴离子的合成中，过氧化氢酶减少和SOD的活性，激活MDA生产，并最终产生活性氧[三十]。在我们的研究中，我们发现，MDA的含量显著增加，SOD活性在APP / PS1小鼠显著下降。二甲双胍治疗后，氧化应激缓解。一个β积累可以增加IL-1水平β以及促炎因子IL-6在APP/PS1小鼠中[32，33]。神经炎症也会使AD病理恶化[25]。在这项研究中，二甲双胍降低IL-1的水平β和IL-6在APP / PS1小鼠。

一个β生产强烈链接α-,β- 和γ分泌酶[26]。当APP被蛋白水解处理由β- 和γ分泌酶，Aβ产量增加了。当αγ-分泌酶的增加，甲β生产受到抑制。一个β交通是另一种方式β新陈代谢。RAGE和LRP1是参与β运输[34]。在这项研究中，ELISA和定量PCR结果表明，二甲双胍对影响不大α-,β- 和γ分泌酶和RAGE和LRP1，除了在小减少BACE1表达，这与之前的研究一致[11]。这些结果表明，除了甲β生产和运输，其他信号通路也可能参与了二甲双胍的作用。

AMPK是调节细胞内系统的关键因素[三十]。AMPK的活化可以增强抗炎作用，这可能是由AMPK / mTOR和AMPK / NF-调控κB信号通路[24，27-三十]。二甲双胍是应该有一个潜在的药理作用，由于AMPK的活化[35]。在一些研究中，AMPK / SIRT1参与在非淀粉样途径来提高AD [36]。在这项研究中，二甲双胍明显激活AMPK在APP / PS1小鼠的大脑。至于一β间隙，IDE和NEP是A的主要细胞降解酶β。早期研究发现IDE可以调节Aβ在体内和胰岛素水平[37]。IDE的主要地点是在细胞质，线粒体和过氧化物酶体[38]。IDE是特定于β-有毒低聚物的结构形成底物(Aβ）39]。在大脑IDE的活性随着年龄的增长，并在AD的早期阶段降低。在转基因小鼠IDE的过表达可以防止淀粉样蛋白斑块的形成[40]。IDE的抑制被识别为T2D和AD [之间的串扰的一个21]。在我们的研究结果，IDE和NEP的蛋白质表达水平在APP / PS1小鼠显著降低。二甲双胍有效地提高IDE的蛋白质水平。这些数据表明，IDE通道也可能参与了二甲双胍的保护作用。

总之，我们提供了证据表明二甲双胍通过降低Aβ在APP/PS1小鼠中通过IDE途径水平。此外，二甲双胍还能减轻炎症和氧化应激。然而，还需要进一步的研究。二甲双胍可能为AD的治疗提供新的思路。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

陆欣宜、黄顺顺、陈屈波完成了大部分实验；张大鹏、李万彦、冉敖、梁菲娜、张志敏帮助组织数据。唐英和张世杰帮助修改了手稿。黄继生、汤颖、张世杰设计实验并修改手稿。陆欣宜、黄顺和陈屈波对这项工作的贡献是一样的。

致谢

这项工作是由中医中药中国的广东省（项目编号：20190408212815）的管理项目的支持。

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