文摘

晶体粘附肾结石的形成是一个重要的环节。本研究调查并比较了附着力之间的差异nano-calcium一水草酸(COM)和人类肾近端小管上皮细胞(HK-2)治疗前后与茶多糖(支持)TPS0 TPS1, TPS2, TPS3分子量为10.88,8.16,4.82,和2.31 kDa,分别。TPS治疗有效减少COM HK-2细胞的损伤,从而导致增加细胞活性,减少乳酸脱氢酶的释放,细胞形态恢复,减少活性氧水平,增加线粒体膜电位,增加溶酶体的完整性,减少表达粘附分子骨桥蛋白和磷脂酰丝氨酸外翻,和减少晶体粘附。中等分子量的支持,TPS2细胞和最好的保护作用最强的影响晶体粘附的抑制。因此,TPS2可能是一个潜在的anticalculus药物。

1。介绍

茶是世界上最受欢迎的饮料之一(1),有许多变化,如绿色、黑色、乌龙茶和普洱茶。众多研究表明,茶有很多属性,如下:抗氧化性质,降低胆固醇的财产,抑制高血压、抑制血液凝固,溶解纤维蛋白原,减少内皮素水平,氧化酶的活化,保护低密度脂蛋白氧化,预防心血管疾病,和抗癌特性2- - - - - -6]。不同浓度(0.00078 - 5μg / mL)红茶提取物(耳背式)在人类结肠癌细胞的毒性作用(HT-29),人类乳腺癌细胞(MCF-7)和肺泡癌细胞(A549)和对正常细胞没有影响(NIH-3T3) [4]。耳背式可以诱导DNA链断裂和氧化损伤在HT-29 MCF-7癌细胞。圣Cheang et al。5]预防ER应激的增加标记和活性氧(ROS)水平的差别,对这些Hcy aortae代谢酶的Ang II-infused老鼠通过BT治疗。范et al。6)观察到的水提取普洱茶,BT,和绿茶增加蠕虫的寿命,推迟了β全身的进行性瘫痪的阿尔茨海默病转基因蠕虫,并提高了宽容的蠕虫引起的氧化应激重金属铬6 +。

肾结石的主要成分是草酸钙(草酸钙)7]。茶的antistone效应已成为研究人员关注的焦点(8- - - - - -11]。Alhaji花草茶可以防止草酸钙肾结石的形成在高浓度的钙和草酸离子(8]。艾纳香属balsamifera(sambong)茶可以形成小石头,可以很容易地通过排尿消除由于表面自由能的减少和增加,成核率(9]。骑et al。10]显示流行的一水草酸钙(COM)石头绿茶饮用者中极大减少273人口hypercalciuric石头成型机。陈等人。11)评估13842例肾结石通过超声观察到日常茶消费的金额 和 毫升与和没有肾石疾病组,分别。每天喝茶 毫升(两杯)与肾石疾病的风险较低。这些有益的茶是归因于其活性成分,如下:多糖(PSs)、多酚、生物碱、氨基酸、维生素和无机元素(12]。然而,茶的antistone机制PSs(支持)尚未完全阐明。

在我们之前的研究13),我们调查了四个绿色的抗氧化活动支持与不同分子量(10.88 (TPS0), 8.16 (TPS1), 4.82 (TPS2)和2.31 kDa (TPS3))和修复受损的人肾近端小管上皮细胞(HK-2)。四个TPSs修复线粒体、溶酶体和细胞内DNA HK-2细胞,和TPS2最强的能力。

肾结石的预防比临床治疗更重要(14- - - - - -16]。在先前的研究中,我们发现,从绿茶中提取的多糖(13,17),Porphyra yezoensis(18)修复受损肾上皮细胞的能力。细胞修复由多糖抑制草酸钙晶体的粘附,促进了附着晶体的内吞作用。细胞修复,修复受损肾上皮细胞,防止肾结石的形成,这是一个被动的处理方法。然而,对于未损坏的细胞,保护细胞免受氧化损伤尿微晶或草酸在活的有机体内提前阻止肾结石形成的积极有效的方法,及其临床价值大于被动修复。支持具有良好的抗氧化能力可以保护细胞和提高抗氧化损伤能力。在此基础上,本研究调查了草酸钙晶体的粘附前后肾上皮细胞保护通过与不同分子量的支持,为了提供见解的积极预防肾结石的形成和调查的新antistone药物。

2。实验方法

2.1。试剂和仪器

茶多糖(TPS0)是由陕西Ciyuan生物有限公司,有限公司和它的分子量为10.88 kDa。多糖的降解进行了如前所述[13,17]。TPS1的分子量、TPS2 TPS3分别为8.16,4.82和2.31 kDa,分别。

一水草酸钙(COM)根据前面的合成文献[19]。SEM和XRD表明,这是一个目标晶体大小约100海里。

人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)购自上海细胞库,中国科学院(中国上海)。胎牛血清和细胞培养基(DMEM-F12)从HyClone购买生化制品有限公司有限公司(中国,北京)。细胞增殖测定工具包(细胞计数Kit-8, CCK-8)从Dojindo购买实验室(熊本、日本)。吖啶橙(AO)、苏木精和伊红染色设备,活性氧检测设备(DCFH-DA)、乳酸脱氢酶(LDH)工具包,5、5 ,6、6 - - - - - -tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine碘(JC-1),主要骨桥蛋白(OPN)抗体,兔子anti-rat (FITC-IgG),膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测装备,细胞膜红色荧光探针(DiI)和4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)都购自上海Beyotime生物科技有限公司(上海,中国)。多聚甲醛和乙醇为分析纯(广州化学试剂厂)。

装置包括一个激光共焦显微镜(LSM510元DuoScan、蔡司、德国)、光学显微镜(奥林巴斯、CKX41、日本),标(SafireZ、Tecan、瑞士)、多功能酶标仪(美国BioTek协同H1M)和流式细胞分析仪(美国BD FACSAria)。

2.2。细胞培养和实验模型

根据我们之前的研究17],HK-2细胞培养DMEM-F12培养基中含10%胎牛血清和100 U /毫升青霉素- 100μ与pH值7.4 g / mL链霉素抗生素37°C公司5%2湿润的环境。在达成80% - -90%汇合的单层,细胞被轻轻胰蛋白酶消化后形成后的细胞悬液细胞实验。

细胞浓度的细胞悬液 细胞接种200 /毫升μL, 1毫升,2毫升/在96 - 12 -,和6-well板块,分别和孵化24小时DMEM-F12培养基。这些细胞被分为三组:(1)正常对照组,只添加了一个无血清培养基(2)损伤对照组,与200年的无血清培养基μg / mL COM添加和孵化6 h(3)保护组,水晶是使用80年μg / mL茶多糖1 h,那么200年的无血清培养基μg / mL COM是添加到细胞6 h

2.3。细胞生存能力CCK-8的检测

实验模型是一样的2.2。到达时间后,加10μL CCK-8试剂的96孔板和孵化4 h。OD值是使用标仪测量的仪器在450纳米检测多糖的修复能力。

2.4。乳酸脱氢酶(LDH)释放试验

将细胞分成以下组:(1)颗粒介质(背景空白井)(2)未经处理的细胞井后续裂解(样本最大酶活性控制井)(3)正常对照组,只添加了一个无血清培养基(4)损伤对照组,与200年的无血清培养基μg / mL COM添加和孵化6 h(5)保护组,水晶是使用80年μg / mL茶多糖1 h,那么200年的无血清培养基μg / mL COM是添加到细胞6 h

损害已经完成后,每组96 -孔板化验了OD使用微型板块读者根据LDH装备试验方法来确定多糖的修复能力。具体操作如下:添加60μL LDH检测解决每一个好工作,在黑暗中拌匀,孵化(约25°C) 30分钟(可以在铝箔包装和放置在一个水平摇动或震动在摇床上)。吸光度测量490海里。双波长测量执行使用任何波长600 nm或大于600纳米波长作为参考。每组的测量吸光度应减去背景空白的吸光度控制井。结果是计算如下:LDH释放(%)=(处理样品的吸光度−样品的吸光度控制)/(细胞的最大吸光度酶活性−样品的吸光度控制)×100。

2.5。苏木精和伊红染色(他)

根据我们之前的研究13),由他染色观察细胞形态。实验模型是一样的2.2。治疗时间后,12-well板与4%多聚甲醛固定细胞在室温下15分钟。然后,苏木精染色的细胞被染色和孵化15分钟。然后,细胞用蒸馏水洗净2分钟以去除多余的染色。之后,这些细胞被沾染了曙红染色解决方案5分钟。2分钟的细胞用蒸馏水洗净,去除多余曙红。12-well板处理后,细胞在光学显微镜下观察:细胞核染色紫色或蓝色,细胞质染色粉红色或红色。

2.6。活性氧(ROS)检测

根据我们之前的研究13分析了],ROS水平DCFH-DA染色。实验模型是一样的2.2。达到培养时间后,细胞与500年被染色μL DCFH-DA稀释比例为1:1000年的无血清培养基和培养30分钟,然后用PBS洗两次;幻灯片的细胞12-well板和荧光显微镜观察细胞的荧光强度在96孔板是用多功能微型板块探测器探测到。

2.7。线粒体膜电位的测量(ΔΨ米)

根据我们之前的研究13),ΔΨ分析了m JC-1染色。实验模型是一样的2.2。达到培养时间后,上层清液吸气,细胞与PBS洗两次。最后,样本沾JC-1 15分钟。然后,细胞与PBS洗两次。12-well细胞板与光学显微镜观察,细胞的荧光强度在96孔板是用多功能微型板块探测器探测到。

2.8。溶酶体完整性试验

根据我们之前的研究13),溶酶体完整性被荧光染色检测。细胞后被装满5μg / mL AO DMEM 15分钟,实验模型是一样的部分2.2。损伤后完成,12-well板与荧光显微镜观察和96孔板检测微型板块与激发读者在485 nm和排放530(绿色细胞质AO)和620海里(红色溶酶体AO)。

2.9。骨桥蛋白(OPN)表达检测

根据我们之前的研究17),OPN的表达被荧光染色检测。实验模型是一样的部分2.2。达到破坏时间后,4%多聚甲醛添加修复细胞10分钟。随后,羊血清添加了20分钟。OPN的第一抗体(1:100)是掉进这个示例中,它仍然是在一夜之间在4°C。之后,这些细胞被冲洗三次与PBS的FITC-IgG在黑暗中(1:100)。这些细胞被冲洗三次后再与PBS孵化为0.5 h在37°C。最后,细胞与DAPI染色。12-well板使用激光共焦荧光显微镜观察。核的颜色是蓝色,OPN是绿色的。

2.9.1。定量检测OPN

指的是上面的方法,一个96孔板被用来定量检测荧光强度与多功能微型板块读者。

2.10。磷脂酰丝氨酸(PS)外翻检测

根据我们之前的研究18),PS外翻被流式细胞仪检测。实验模型是一样的2.2。在损伤时间结束后,100年μL(绑定缓冲和10μL (FITC-labeled膜联蛋白V增加,细胞被蒙在鼓里的在室温下30分钟。治疗后,细胞的6-well板被流式细胞仪检测。

2.11。通过SEM观察晶体的粘附

根据我们之前的研究18),扫描电镜观察晶体粘附。实验小组在部分是一样的2.2。与晶体细胞孵化后6 h,它们与2.5%戊二醛固定在4°24 h,与PBS溶液洗3次,脱水与梯度乙醇(30%,50%,70%,90%,100%),干临界点的有限公司2,喷金。电子显微镜下观察细胞形态及晶体粘附。

2.12。定量分析细胞粘附的百分比的晶体通过流式细胞术

根据我们之前的研究18),细胞的百分比坚持晶体被流式细胞术进行评估。实验模型是一样的2.2。6-well板预冻了30分钟在4°C, 200μg / mL FITC-labeled nano-COM晶体了。在4°C 6 h后,细胞培养,用冷PBS洗两次,和细胞的百分比坚持晶体被流式细胞仪检测。

2.13。统计分析

实验数据被表示为 至少有三个独立的实验。实验结果使用SPSS 13.0软件进行统计分析,和图基测试是用于分析之间的差异意味着每个实验组和对照组。如果 ,有显著差异;如果 ,差异非常显著;如果 ,没有显著差异。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力和乳酸脱氢酶(LDH)释放

COM晶体HK-2细胞毒性的治疗前后的支持(TPS0, TPS1、TPS2 TPS3)分子量为10.88,8.16,4.82,和2.31 kDa,分别进行了比较。细胞生存能力的变化如图所示1(一)。6小时孵化nano-COM晶体后,细胞生存能力显著下降(54.34%)。TPS的治疗减毒COM晶体对细胞的毒性。TPS2最强大的防护能力,细胞的可行性TPS0, TPS1, TPS2,和TPS3保护组为67.35%,80.03%,86.80%,和74.13%,分别。

(一)
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(b)
(b)
图1
nano-COM晶体对HK-2细胞生存的影响(a)和LDH释放(b)之前和之后的TPS的保护。NC:正常对照组;DC:损伤对照组。多糖浓度:80μg / mL;保护时间:1小时。Nano-COM浓度:200μg / mL;晶体损伤时间:6小时。与直流组相比, 显示显著差异; 表明一个非常显著的差异。

LDH释放作为细胞膜完整性的一个重要指标,被广泛用于细胞毒性试验(20.]。图1 (b)显示COM晶体的影响从HK-2细胞LDH释放治疗前后有四个支持。LDH释放TPS保护组(9.48% - -18.03%)大于正常组(5.18%),但低于损伤组(25.50%),从而表明HK-2细胞造成的损害可以显著抑制nano-COM支持。

3.2。细胞形态

图2显示的效果nano-COM晶体的形态HK-2细胞治疗前后的支持。正常细胞的细胞核是统一的,细胞之间的连接完成。COM晶体损伤后6 h,细胞的数量明显减少,细胞核固缩的,形态是无序的,和细胞之间的连接被毁。然而,TPS治疗后细胞损伤的程度降低。保护组的细胞的数量明显高于损伤组。有核细胞的数量低于损伤组。


图2
nano-COM晶体对TPS前后HK-2细胞形态学的保护。白色箭头是浓缩的核。图的实验条件是一样的1。
3.3。ROS水平

图3显示的效果nano-COM晶体HK-2细胞ROS水平TPS之前和之后的治疗。ROS荧光的正常组低。ROS损伤后荧光显著增加,从而表明活性氧水平升高。ROS荧光强度之间的保护组的正常和损伤组,表明支持可以保护细胞免受伤害。荧光强度量化结果(图3 (b))与荧光显微镜的结果相一致。

(一)
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(b)
(b)
图3
nano-COM晶体对TPS前后HK-2细胞ROS水平保护:(一)荧光观察;(b)量化直方图。实验条件是一样的图1。
3.4。线粒体膜电位(ΔΨ米)

图4显示了ΔΨm HK-2细胞TPS治疗前后的变化。ΔΨm正常组织细胞的高,荧光探针分子JC-1是线粒体基质的聚合,形成一个聚合物(J-aggregates),从而产生红色荧光。ΔΨm受损细胞明显减少,JC-1主要存在单体,产生绿色荧光。TPS治疗抑制的减少ΔΨCOM晶体所致。ΔΨm保护细胞之间的正常和损伤组。TPS2 TPSs中最强大的防护能力。

(一)
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(b)
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图4
nano-COM晶体对线粒体膜电位的影响HK-2细胞前后TPS保护:(一)荧光显微镜;(b)量化直方图。实验条件是一样的图1。
3.5。溶酶体的完整性

弱基本吖啶橙可以通过细胞膜进入溶酶体。它结合酸水解酶产生橙红色荧光,在细胞质中发出绿色荧光。溶酶体的完整性可以通过测量发现红色和绿色荧光的强度比21]。低的红色荧光显示更严重的溶酶体损伤和更高程度的细胞坏死。

如图5正常组为100.01%,溶酶体的完整性和损害减少到60.97%。细胞的溶酶体完整性保护组的改善,达到71.38% - -87.32%。

(一)
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图5
nano-COM晶体对TPS前后HK-2细胞的溶酶体完整性保护:(一)荧光观察;(b)量化直方图。实验条件是一样的图1。
3.6。骨桥蛋白(OPN)表达

图6显示COM晶体的作用前后细胞OPN表达HK-2 TPS治疗。正常组不明显的绿色荧光,而在损伤组明显增强,从而表明OPN的表达受损细胞显著增加。OPN表达在细胞表面TPS治疗后高于正常组,但低于损伤组和OPN表达TPS2集团是最少的。同时,正常组的原子核,原子核损伤组的变形,保护集团的细胞核大多是圆的,部分变形。这些结果与细胞形态学观察图一致2。

(一)
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(b)
(b)
图6
nano-COM晶体对TPS前后HK-2细胞OPN表达保护:(一)荧光观察;(b)量化直方图。实验条件是一样的图1。

OPN表达(图的定量检测结果6 (b))与定性的观察一致。正常组的OPN的平均荧光强度大约是29000年,而它在伤害增加到62000组。保护团体的平均荧光强度(47500、38700、33600、43000)之间的正常和损伤组。

3.7。PS外翻

图7显示了COM晶体对细胞表面的影响PS外翻TPS之前和之后的治疗。PS外翻的数量在正常组低(1.67%),并显著增加损伤组(27.8%)。PS外翻保护细胞的15.9%,12.8%,10.6%,和14.2%,这些值之间的正常和损伤组。

(一)
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(b)
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图7
nano-COM晶体对PS外翻HK-2细胞前后TPS保护:(一)量化直方图;(b)统计直方图。实验条件是一样的图1。
3.8。扫描电镜观察细胞表面附着的晶体

图8显示了扫描电镜图像的COM晶体的粘附细胞TPS治疗前后不同的分子量。一些COM晶体坚持正常细胞的表面。受损的细胞显示下降形态,许多晶体表面被发现这些细胞,从而导致严重的晶体聚合。细胞形态在TPS保护团体逐渐恢复,和粘附数量和聚合程度的晶体在细胞表面低于损伤组。TP2保护组,其细胞形态恢复类似于正常细胞几乎粘水晶,虽然坚持晶体不聚合。


图8
SEM图像nano-COM水晶粘附在细胞前后TPS保护有不同的分子量。实验条件是一样的那些图1。
3.9。粘附细胞的百分比晶体

图8显示晶体粘附细胞的百分比TPS之前和之后的治疗。损伤组细胞的比例是48.7%,而在TPS0细胞的百分比,TPS1, TPS2, TPS3组分别为42.8%,25.4%,21.6%,和31.4%,分别为(图9 (b))。换句话说,TPS治疗可以抑制COM晶体的粘附细胞。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
细胞的百分比坚持nano-COM晶体前后TPS保护:(一)量化直方图;(b)统计直方图。实验条件是一样的图1。

4所示。讨论

4.1。COM晶体的减少细胞毒性治疗后的支持不同的分子量

肾上皮细胞损伤是一个关键因素,导致肾结石的形成。正常肾组织有一个有效的抗氧化防御系统,如超氧化物歧化酶(SOD)和其他的酶可以清除自由基及其代谢物和保护身体免受氧化损伤。在病理状态,体内自由基产生过多导致氧化损伤肾组织,导致疾病的形成,如肾结石(22]。支持有良好的抗氧化能力,和TPS的治疗可以改善肾上皮细胞抗氧化损伤的能力(23,24]。

结果表明,支持保护HK-2细胞造成的损害nano-COM晶体通过减少活性氧的生产。TPS的治疗后,线粒体膜电位和溶酶体完整改善,细胞膜损伤减少,细胞形态学修复。

许多研究证明了PSs对细胞的保护作用。例如,贾庆林等。14)观察到低分了重量(7 kDa)摘要研究可以从白蛋白过载保护肾功能和管状细胞造成的损伤和抑制ROS水平的增加。李等人。15)表明,枸杞PS (LBP-4a)展品对凯擘引起的肾损害保护作用3。其机制是密切相关的降低脂质过氧化水平和增加抗氧化酶的活动在肾组织,缓解DNA损伤和肾细胞线粒体膜电位增加。Zhang et al。16)表明,生存能力和形态后的大鼠骨髓内皮祖细胞减少凝血酶破坏,和黄芪PS (APS)抑制这种损伤。

的分子量TPSs在HK-2细胞保护作用的影响。不能穿过细胞膜TPSs的分子量大时(例如,10.88 kDa TPS0) [25,26]。然而,氢链很软弱,而积极的螺旋结构不是因为短糖链的形成27,28)当TPSs的分子量很小(比如2.31 kDa TPS3),从而导致减少的保护作用。因此,TPS2中等分子量(4.82 kDa)是最活跃的。不同PSs的分子量范围显示强大的生物活性不同,因为他们的单糖组成、酸性类物种,和内容。例如,元et al。29日]表明,纯化得到PSs当归chuanxiong如果短(LCB LCA, LCC约 , ,和 分别为Da)表现出抗氧化特性的生化和细胞毒性。其中,LCB抗氧化和细胞毒性最高的活动。你等。30.调查的保护作用香菇PSs分子量为25.5、306.2和605.4 kDa D-galactose-induced氧化应激心肌细胞在小鼠和显示,PSs与中等分子量最强的保护作用。

4.2。抑制COM晶体HK-2细胞粘附的TPS治疗后

微晶是常见的用石头相比,从而表明晶体粘附是肾结石的形成的关键(31日,32]。微晶是尿液中而不是坚持肾上皮细胞,不形成肾结石。尿微晶坚持肾上皮细胞表面的生长或聚集在细胞表面形成大型水晶,导致肾结石的形成(33]。

形成结石的风险增加,因为细胞损伤促进细胞粘附公司晶体。例如,COM晶体表面的附着力正常Madin-Darby狗肾细胞(MDCK) μ克/厘米2的表面损坏MDCK增加 μ克/厘米2,> 90%的COM晶体坚持受损细胞。受损细胞的修复后,附着力降低 μ克/厘米2(34]。

TPS治疗后,带负电的表达粘附分子,如OPN(图6)和PS(图7),是抑制由于抑制细胞损伤(35,36),从而减少纳米晶体的粘附(数字7和9)。印度的七弦琴et al。37发现摘要研究可以保护小鼠的肾脏高草酸的酸尿免受损害;增加SOD的活性,猫,GPX;防止肾细胞膜损伤;抑制公司的附着力晶体;在老鼠身上,减少公司晶体的沉积。

酸group-rich TPSs可以在COM晶体表面的吸附,从而提高ζ电位的绝对值在晶体表面的附着力,减少晶体的表面带负电荷的细胞表面。Verkoelen et al。38)观察到自然葡糖氨基葡聚糖和半合成PSs能抑制COM晶体的绑定层的MDCK细胞。de Cogain et al。39)确认的提取木香arabicusl . (c . arabicus),它包含一个PS作为它的活性成分,对MDCK细胞的预处理没有影响晶体粘附,以及COM晶体的预处理能显著降低晶体粘附浓度的方式。粘附数量是 时的浓度c . arabicus是1μ克/毫升与正常组相比,而粘附数量降低了 当浓度增加到1000μ克/毫升。这种情况类似于肝素的抑制作用的阳性对照组。

图10显示HK-2细胞粘附的抑制模型nano-COM晶体TPS治疗后。TPS治疗可以减少电动电势的晶体表面,暴露了Ca的数量2 +的粘附,从而抑制晶体表面带负电荷的细胞。此外,PSs可以抑制细胞膜损伤通过消除多余的活性氧,增加线粒体膜电位,提高溶酶体的完整性,修复细胞形态,减少OPN的表达,抑制PS外翻,抑制晶体粘附。


图10
抑制粘附TPS HK-2细胞nano-COM晶体的保护。

5。结论

治疗与支持不同的分子量可以抑制nano-COM晶体的损伤HK-2细胞,提高细胞活力,减少LDH释放,恢复细胞形态,减少ROS水平,改善线粒体膜电位,提高溶酶体的完整性,减少OPN的表达,抑制PS外翻,并减少晶体粘附。支持的保护作用与其分子量有关。TPS2中等分子量的防护效果最好,是一个潜在的药物预防的石头。

数据可用性

所有的数据支持结果摘要所示,可以得到相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作被授予由中国国家自然科学基金(21975105和21975105号)和湖南省自然科学基金(2017号jj2139)。我们感谢湖南急诊医学重点实验室科研平台为儿童(2018 tp1028)。