胆酸体外神经与血管的保护单位对氧气和葡萄糖通过BDNF-TrkB Deprivation-Induced损伤信号通路

文摘

缺血性中风(是)可以破坏各种类型的大脑细胞在神经血管单元(NVU)在结构和功能水平。因此,NVU被认为是更全面的治疗目标。有必要开发药物针对多个机制和细胞类型NVU反对。胆汁酸作为一个组成部分,胆酸报道能够分散在磷脂影响,进一步穿过血脑屏障(BBB)。然而,施加影响胆酸(CA) NVU卒中后仍不明朗。基于我们之前的研究,我们建立和进一步补充的特点功能体外NVU模型及其oxygen-glucose剥夺和复氧(OGD / R)模型。然后,我们研究了CA的维护后体外NVU OGD / R,并进一步讨论了特定分子靶点CA中扮演了重要的角色。第一次,我们发现CA明显保持BBB的完整性,表达下调细胞凋亡,减轻氧化应激和炎症损伤后OGD / R。同时,CA明显增加脑源性神经营养因子(BDNF)的水平,这主要是由星形胶质细胞分泌,在coculture系统OGD / R。结果表明,CA TrkB的表达明显增加,PI3K / Akt, MAPK / Erk和分子在神经元。 These positive effects on the downstream proteins of BDNF were suppressed by treatment with ANA12 which is an inhibitor of TrkB. In conclusion, the present study demonstrates that CA exerted multiple protective effects on the NVU, mediated by increasing the release of BDNF and further stimulating the BDNF-TrkB-PI3K/Akt and BDNF-TrkB-MAPK/Erk signaling pathways in the context of OGD/R-induced injury. These findings indicate that CA possesses the effect of antagonizing multiple mechanisms of IS and protecting multiple cell types in NVU and may be useful as a treatment for IS.

1。介绍

中风仍然是全世界死亡和残疾的主要原因之一;是占了超过80%的中风1]。溶栓的方法是fda批准的治疗脑缺血;然而,只有大约5%的病人受益于这种治疗(2]。近几十年来,许多研究已经致力于证明神经保护和neurorestorative疗法限制促进卒中后缺血性损伤,结构和功能恢复(3]。然而,大多数代理目标缺血级联的单一事件和有针对性的单一神经元素;overspecifications可能部分解释失败在临床设置(4]。强烈建议中风与多个走近,多方面的神经保护和neurorestorative方法。因此,建立体外器官结构和功能单位是必要的进一步理解大脑功能和促进新的治疗方法,使成本效益和更准确的预测药物功效[4]。

NVU是一个复杂的、综合功能单元由神经元和神经支持细胞、星形胶质细胞、以及组成血管系统包括内皮细胞,细胞,平滑肌细胞和周围的周brain-specific细胞外基质(5]。NVU中的每个细胞类型中扮演着重要的角色,在传输和处理神经信号或维持适当的健康的神经功能(微环境条件5,6]。的发生是可以摧毁NVU在结构和功能水平。NVU的概念作为一个更全面的中风治疗的目标已经出现,而且据报道,体外NVU文化模型概括brain-specific功能。此外,体外NVU模型的一个主要优势在体内模型更大的实验控制的细胞和分子的相互作用研究(7,8]。

先前的研究已经报道体外NVU模型使用Transwell平台、微流体平台,大脑切片,和其他形式由内皮细胞、星形胶质细胞和神经元形成结构更接近体内脑组织的功能(9- - - - - -11]。古典形式的体外NVU,一些团体使用Transwell平台,从他们的研究和数据获取提供了开创性的工作,强调了多细胞信号通路,药物的多目标的治疗效果,药物传递BBB对神经元的影响潜在NVU [12,13]。最常见的和广泛使用的体外BBB模型,Transwell平台可用于研究药物的扩散和药物的疗效BBB神经元(14]。BBB,组织网站广泛分布在大脑,是NVU组件和一个特定的生物屏障系统,抑制和控制运输的内源性和外源性物质进入大脑。中枢神经系统的保护BBB [15]。因此,为了更真实的模拟大脑血管和皮层,更复杂的体外系统,在大脑微血管内皮细胞(BMECs)培养的星形胶质细胞和神经元,建立和使用评估新药对神经系统疾病。我们观察到的保护作用而修建的猪去氧胆酸在体外NVU种植星形胶质细胞,BMECs,神经元在Transwell平台(16]。此外,我们构造了一个体外BBB使用星形胶质细胞和BMECs并观察到京尼平甙的保护作用[17]。

CA的组件胆汁酸的报道能够分散在磷脂双分子层和进一步穿过血脑屏障18]。同时,CA的主要活性成分牛黄一直表现出具有神经保护作用[19,20.]。在我们之前的研究中,钙结合猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子苷预防ischemia-induced脑损伤6小时的时间窗口(21]。

BDNF,分布最广泛,广泛学习神经营养因子,发挥对缺血性脑损伤神经保护作用,是最重要的信号分子适应大脑可塑性卒中后(22]。脑源性神经营养因子与tropomyosin-related激酶受体B型(TrkB),随后激活PI3K / Akt和MAPK / Erk信号通路与各种功能包括prosurvival活动,antiapoptosis,抗炎和增强的树突增长和分支(23]。

在这里,我们建立了一个功能性的coculture NVU神经元,星形胶质细胞,BMECs,旨在模拟脑组织,并分析了BBB NVU模型的功能和神经形态学表型正常,OGD / R条件下。第一次,我们调查了潜在的保护作用所CA NVU系统使用一个OGD (1 h) / R(24小时)模型。CA的影响血脑屏障(BBB)的完整性,细胞凋亡,氧化应激,炎症,BDNF水平,和表达TrkB, PI3K, Akt, MAPK和Erk测量。我们假设CA产生神经保护对缺血NVU通过BDNF-TrkB-PI3K / Akt信号通路和BDNF-TrkB-MAPK / Erk信号通路。

2。材料和方法

2.1。动物

新生儿Sprague-Dawley (SD)老鼠表示天从北京购买Weitong利华国际实验动物技术(许可证号。SCXK 20160006,北京,中国)。动物福利和实验过程进行了符合美国国立卫生研究院指导实验室动物保健和使用的,实验动物伦理委员会批准的北京中医药大学(中医药大学- 3 - 2016040201 - 2003)。

2.2。隔离和文化的初级神经元

主要神经元得到我们之前研究[16]。大脑进行解剖,从0到老新生SD大鼠24小时。大脑矢状切成两半,用镊子脑膜被移除。皮质的解剖,已被删除的白质。大脑皮层是20分钟消化在37°C 0.125% trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。皮质组织均质单一细胞悬浊液中含10%胎牛血清(美国纽约的边后卫,Gibco-BRL大岛)。然后,暂停过滤是一个70年μm细胞过滤器在800转离心5分钟。沉淀是resuspended Neurobasal-A介质(Gibco-BRL)含有10%的边后卫,2% B27(表达载体;热费希尔科学,Inc .), 0.25% GlutaMAX (Gibco-BRL),和1%的青霉素和链霉素(P / S, Gibco-BRL)。细胞被播种密度 细胞/毫升0.01% poly-L-lysine(锁相环,Sigma-Aldrich)预镀菜肴在37°C和5%的公司₂。媒介是播种后改为nonserum公式4 h,和50%的媒介是每2天更换一次。

2.3。隔离和文化主要星形胶质细胞

主要研究了星形胶质细胞我们之前研究[17]。脑星形胶质细胞取自2-3-day-old SD大鼠的大脑皮层。短暂,脑膜和脑白质切除后,大脑皮层是消化第一次0.125% trypsin-EDTA 37°C 10分钟和转移到杜尔贝科修改鹰的媒介DMEM / F12与青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。暂停是过滤使用70年μm细胞的过滤器。滤液离心机在800转3分钟,然后用DMEM / F12 resuspended包含10%的边后卫和1% P / S。细胞被镀的密度 细胞/厘米²在75厘米²烧瓶预镀与锁相环和放置在一个有限公司₂孵化器有限公司5%₂气氛在37°C。6天后,星形胶质细胞在coculture实验使用“新鲜”的星形胶质细胞。

2.4。隔离BMECs

主要BMECs得到我们之前研究[17]。总共BMECs是从枚SD大鼠两星期准备和修改如前所述。脑膜和脑白质切除和大脑皮层被孤立。在800转3分钟,离心后沉淀层添加同等体积的25% BSA和resuspended是离心机在3000转4次5分钟。获得的微血管被消化在胶原酶II型(1.0毫克/毫升,Sigma-Aldrich) 37°C 1 h。的悬挂在800转离心5分钟和resuspended DMEM / F12 P / S的边后卫20%和1%。BMECs播种在75厘米²预镀2%明胶塑料盘子。文化是保持在37°C孵化器湿润5%有限公司₂空气/ 95%。培养基是改变每2天前使用体外NVU模型。

2.5。免疫荧光染色法和图像采集

与0.01细胞被洗了三次磷酸盐(PBS)和4%多聚甲醛固定30分钟。删除多余的多聚甲醛后,细胞被封锁和permeabilized 1 h中混合使用0.1% Triton x - 100(费舍尔科学)和PBS山羊血清(σ)10%。在4°C细胞分别孵化一夜之间不同主要抗体;的主要抗体神经元、星形胶质细胞和BMEC检测anti-microtubule相关蛋白2 (MAP2 Abcam,剑桥,英国),anti-glial原纤维酸性蛋白(GFAP Abcam)和anti-von血友病因子(VWf Abcam),分别。紧密连接蛋白是贴上anti-zonula occludens-1(美国ZO-1 Proteintech,芝加哥,IL)抗体在一夜之间在4°C。第二天,细胞被孵化与二次抗体1 h (Alexa萤石647 -共轭山羊anti-chicken IgY, Abcam;Abcam FITC-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白;Alexa萤石555 -共轭驴anti-rabbit免疫球蛋白,Abcam;和488 -共轭山羊anti-rabbit, Alexa萤石Proteintech)。细胞细胞核染色了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (Solarbio,北京)浓度为0.5μ克/毫升10分钟。荧光图像捕获与荧光显微镜(FluoView 1000年,奥林巴斯,东京,日本)。

2.6。建立体外NVU

在开始coculture之前,神经元培养Transwell盘子的底部(康宁,3460,0.4μm,纽约,纽约,美国),和文化保持B27 Neurobasal-A中含2%,0.25% GlutaMAX, 1% P / S至少48小时。融合逐渐增加到80%时,星形胶质细胞和BMECs用于建立模型。星形胶质细胞( 细胞/厘米²)被播种到匹配下插入膜在培养皿中44 h。4 h后,Transwell插入被颠倒在细胞培养板。BMECs被播种内一侧插入涂上一层凝胶密度 细胞/厘米²在0.5毫升中52小时。镀时神经元在体外被定义为零。在172 h,实验进行。建立的过程模型如图1。控制、BMECs或神经元也培养独自Transwell室B组和组N,分别。BMECs被培养的星形胶质细胞和神经元为B + A组和B + N组,分别。神经元与星形胶质细胞培养+ N组。神经元与星形胶质细胞培养和BMECs B + + N组。

2.7。荧光素钠渗透性测量

我们评估了渗透系数对小分子(376 Da)荧光素钠。荧光素钠在100年参议院(添加μg / mL), 100年μL整除则来自于众议院微型板块,体积是取代preequilibrated空白培养基在15日,30日,52岁,67分钟。样品的吸光度测量使用fluorospectrophotometer (FLUOstarω,BMG LABTECH Offenburg,德国)。视渗透率(Papp)计算每组的应用 ,在哪里 累积测量荧光强度在众议院每单位时间纠正由于采样稀释,插入膜的表面积(1.12厘米²),是参议院的荧光强度。

2.8。Transendothelial电阻测量

描述的内皮细胞单层的形成,te获得使用一个上皮volt-ohm电阻计(ERS-2、微孔、德国)和整体抗电极之间的电流测量。空白插入处理明胶的电阻值是减去总电阻的测量。t值表示为 通过乘以Transwell插入的表面积。

2.9。OGD / R侮辱NVU药品监督管理局

如图1模拟缺血环境,OGD / R是用于体外NVU模型。简单,介质取代缺氧厄尔的平衡盐溶液(ebs, Leagene生物科技有限公司、北京、中国)在196 h。然后,NVU模型放入密封Anaero容器和一个Anaero包(三菱、东京、日本)1小时启动OGD侮辱。OGD被完全培养基终止,cocultures在37°C在常氧条件下培养24小时模仿再氧化。cocultures与上述治疗被定义为模型组。对照组被孵化的cocultures DMEM / F12有20%的边后卫和1%青霉素和链霉素没有上述OGD / R治疗。

CA购买从国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。CA和10%氢氧化钠溶解在细胞培养基CA方案做准备。CA的解决方案(3.0毫克/毫升)准备在缺氧glucose-free ebs和DMEM / F12包含20%的边后卫和1% P / S。文化被随机分为四组:对照组(1);(2)模型组;(3)CA-H组(93.75μg / mL);和(4)CA-L集团(11.72μg / mL)。对照组在完全培养基培养。CA-H组和CA-L组的细胞治疗与CA之前24小时OGD / R,然后下OGD条件1 h。OGD终止,进一步的细胞培养24小时在常氧条件下的CA。cocultures CA-H和CA-L组治疗24 h CA之前OGD / R和整个OGD / R的过程。

2.10。流仪分析细胞凋亡

分析细胞凋亡是由流式细胞术使用膜联蛋白V凋亡检测设备。细胞与EDTA-free酶消化,用PBS收获,洗两次,然后在500年resuspendedμL绑定缓冲。这之后,细胞染色在5μL膜联蛋白V FITC和5μLπ(注册机、南京、江苏、中国),和resuspended细胞培养在黑暗中10分钟。最后,细胞被立即检查FACSCalibur (BD生物科学,富兰克林,新泽西,美国)流式细胞分析仪,和数据分析与CellQuest软件(BD生物科学)。

2.11。试验对炎症、神经营养因子和氧化压力的活动

Interleukin-1β(il - 1β;武汉六合生物科技有限公司、武汉、中国)、白细胞介素- 6 (il - 6;武汉六合生物技术有限公司)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α;Proteintech)、脑源性神经营养因子(BDNF;武汉六合生物技术有限公司),神经胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF;ayBiotech、广州、中国)评估使用ELISA包根据制造商的指示。光密度测量的波长450 nm使用标(BioTek Winooski,佛蒙特州,美国)。丙二醛(MDA);南京建成,中国)、超氧化物歧化酶(SOD);建成)、乳酸脱氢酶(LDH);建成),gamma-glutamyl转肽酶(γgt;建成)测量使用商业套装根据制造商的指示。

2.12。免疫印迹(WB)分析

蛋白质含量的变化是使用世行分析量化。细胞被洗PBS。蛋白质获得使用分钟™等离子体膜蛋白分离和细胞分离设备(发明生物技术)根据制造商的指示。resuspended的上层清液是蛋白质浓度用BCA的量化分析工具(注册机)。蛋白质样品(30毫克/样本)是解决使用三/甘氨酸10% sds - page凝胶,然后转移到一个聚乙二烯二氟化物膜。膜被孵化PBST含有5%脱脂奶30分钟。孵化后与主含5% BSA抗体PBST / TBST承认anti-cysteinyl天冬氨酸特定proteinase-3 (caspase-3 Proteintech) anti-cysteinyl天冬氨酸特定proteinase-9 (caspase-9 Proteintech) anti-B-cell淋巴瘤2 (bcl - 2,亲和力),anti-Bcl-2-associated X蛋白(伯灵顿,Proteintech) anti-ZO-1 (Proteintech) anti-claudin-5(亲和力生物科学,哦,美国),anti-occludin (Abcam) anti-TrkB(亲和力),anti-p-TrkB(亲和力),anti-cAMP反应元件结合蛋白(anti-CREB亲和力),anti-PI3K (p85亲和力),anti-p-PI3K (p85亲和力),anti-Akt (Ser473亲和力),anti-p-Akt (Ser473亲和力),anti-MAPK (p38,亲和力),anti-p-MAPK (p38,亲和力),anti-Erk1/2(亲和力),anti-CREB(亲和力),anti-p-Erk1/2(亲和力),和anti-GAPDH或反β肌动蛋白在4°C在一夜之间,这些墨迹洗然后孵化anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 2000 - 1: 4000) 1 h在25°C。随后在TBST洗后,发现immunolabeling使用增强化学发光试剂(PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。

2.13。统计数据

所有的实验进行了一式三份或更多。所有的数据表示为 。多个比较进行使用单向方差分析(方差分析),和每组数据受到最显著差异(LSD)测试使用SPSS 20.0(美国SPSS,芝加哥,IL)。的值 被认为是显著和 高度显著差异。

3所示。结果

3.1。BBB功能和神经生物学行为NVU模型

纯度的神经元、星形胶质细胞和BMECs 93年>,> 99,分别为和100%(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。然后,我们建立了体外NVU模型与上述主细胞和检查BBB功能和神经形态。首先,我们评估BBB函数(数字2 (d)- - - - - -2 (h))紧密连接蛋白的表达、渗透率、代谢酶活性和电阻。BMECs形成的单层细胞边界和表达ZO-1通过免疫荧光分析。免疫荧光和免疫印迹结果显示紧密连接蛋白表达与神经元和星形胶质细胞培养时以120 h与单一BMECs相比,和表达最丰富的星形胶质细胞和神经元(数字2 (e)和2 (f))。体外BBB的特性模型评估通过测量三通或评估渗透系数24,25]。我们第一次使用三通来衡量联接的气密性检测t值的变化由于不同cocultures BMECs和/或星形胶质细胞与神经元。三细胞coculture模型产生了三通,明显不同于单一控制和coculture控制和达到最大(图5 d三通2 (d))。如图2 (g)科幻的渗透系数的三细胞cocultures最低的价格相比单一BMECs或BMECs cocultured星形胶质细胞和神经元。的γgt的活动,这是一个可靠的标志的BBB和大量出现在顶端表面内皮细胞(12),达到最高的价值三重细胞coculture模型比其他文化系统(图2 (h))。如图2 (j),获得一个更成熟的神经元形态学表型coculture星形胶质细胞和BMECs比其他文化系统。MAP2,特定标记的神经元树突和细胞的身体,被用来观察神经元形态变化在不同的文化系统(26]。世行结果表明MAP2水平在体外NVU模型显著高于单作,cocultured BMECs或星形胶质细胞(图2(我))。神经元轴突完全伸展,形成了一个独特的网络coculture三细胞模型。这些结果表明BMECs和星形胶质细胞有促进神经突的影响结果,神经网络形成和平稳的发展,圆的细胞体。我们得出的结论是,体外NVU模型成功建立,优于其他文化系统。体外NVU模型更适合理解细胞的功能和交互NVU。

3.2。BBB函数和神经细胞凋亡NVU暴露OGD / R

为了确定3个手机的优点coculture系统,我们调查的影响OGD / R BBB函数和神经元在不同的文化系统。OGD / R后,与对照组相比,t值(图3(一个)),γgt(图3 (b))活动显著减少,而科幻(图的渗透系数3 (c))显著增加,表明BBB毁于各种文化系统的完整性(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。然而,相比之下,coculture组与单个细胞和两种类型的脑细胞,NVU组t值最高γgt活性和渗透系数最低的科幻小说。Nimodipine治疗显著逆转BBB的变化引起的OGD / R的函数。此外,结果表明,OGD / R诱导显著的神经细胞凋亡,凋亡神经元的数量在B + + N组明显低于N组(图3 (d))。明显高于神经保护检测NVU模型相比单一模型。因此,体外NVU模型更适合评估药物的疗效比单一神经元培养神经元常用的先前的研究。

3.3。在体外NVU CA模型的影响后,OGD / R

如数据所示4(一)- - - - - -4 (c)、治疗与CA导致科幻(图的渗透系数下降4(一)(图)和te增加价值4 (b)),γgt活性(图4 (c)与模型组相比)。结果表明,CA治疗改善了BBB功能显著。此外,检测CA的功能作用在调节神经元形态,如图4 (d),数据显示,神经元模型领域的数量远远小于对照组,和细胞尸体被中断,和探明缩短和减少模型组;CA在损伤有显著的保护作用和神经突神经元细胞体。CA对BBB特征有显著的保护作用和神经元后NVU OGD / R。

3.4。CA的影响在炎症和氧化损伤OGD / R的体外模型

越来越多的证据表明,提高氧化应激参与的病理生理学是(27]。如数据所示5(一个)- - - - - -5 (c)缺氧-复氧后,MDA(图5(一个))和(图5 (b))显著增加,SOD(图5 (c))与对照组相比明显减少,这表明,自由基引起的细胞损伤,脂质过氧化反应和氧化应激。CA治疗后,这四个参数有显著改善,表明CA对细胞损伤的有效性。此外,以往的研究表明,炎性细胞因子的水平提高后是28]。我们测量了CA对炎性细胞因子水平的影响,例如,TNF -α,il - 1β,和il - 6在当下研究。结果表明,il - 1的水平β(图5 (d)),il - 6(图5 (e))和肿瘤坏死因子-α(图5 (f))后被显著增加OGD / R, CA组显著降低il - 1β、il - 6和TNF -α与模型组相比的水平。炎性细胞因子的释放是通过CA抑制治疗。

3.5。CA后细胞凋亡的影响OGD / R

之前的研究表明,神经细胞凋亡参与了发生的是29日]。流式细胞仪是用来检测细胞凋亡神经元的实验小组,如图6(一)。结果表明,细胞凋亡的差异百分比OGD / R组和其他组之间有统计学意义重大,OGD / R组的细胞凋亡比例更高的CA组相比。CA预处理完全逆转OGD / R-induced细胞凋亡神经元(图6(一))。凋亡蛋白的表达在体外NVU系统检查。如图6 (b),bcl - 2表达OGD / R组明显低于对照组,而CA组演示bcl - 2表达高于OGD / R组。然而,在bcl - 2表达相比,伯灵顿,caspase-3,和caspase-9模型组显著高于对照组,而低表达的伯灵顿,caspase-3, caspase-9观察治疗组比模型组。此外,我们使用诊断工具来衡量的LDH泄漏释放细胞损伤或死亡的一项指标。缺氧-复氧后,LDH(图6 (c))与对照组相比显著增加,这说明有炎症引起的细胞损伤,自由基、脂质过氧化反应和氧化应激。CA治疗后,LDH明显减少,表明CA对细胞损伤和死亡的有效性。

3.6。CA提高BDNF和触发器TrkB / PI3K / Akt信号和TrkB / MAPK / Erk1/2信号后OGD / R

有大量的证据支持,BDNF是重要的贡献者中风的保护神经元损伤。因此,我们研究了BDNF的表达及其特定的受体tropomyosin-related激酶B (TrkB),连同他们的下游信号通过MAPK / Erk1/2和PI3K / Akt介导的。研究发现,BDNF(图的水平6(一))最高的NVU模型,星形胶质细胞和神经元单独培养时,脑源性神经营养因子的水平低于coculture。此外,我们发现,脑源性神经营养因子(图6 (b))是合成更多的比在对照组,模型组和CA治疗进一步促进了这一进展。在最近的研究中,TrkB蛋白质(图7 (c))相比显著增加了OGD / R与控制,而CA可以增加更多TrkB基于OGD / R的表达。此外,我们发现CA治疗调节分子(图7 (c)),PI3K(图7 (d)),一种蛋白激酶(图7 (d)),MAPK(图7 (e)),Erk(图7 (e))磷酸化。此外,作为TrkB受体的拮抗剂,ANA12被用来阻止TrkB激活治疗NVU系统。然而,这些积极影响下游蛋白的BDNF被治疗ANA12镇压。

4所示。讨论

神经元、星形胶质细胞和微血管内皮细胞的主要组件是NVU扮演多个角色,积极调节血管和神经功能。比较有趣的是,单一栽培,BMECs BMECs了神经元和星形胶质细胞在低舱显示显著增强屏障的完整性。此外,BMECs和星形胶质细胞对诱导有显著的促进作用显著增强神经突的产物和神经网络形成和光滑、圆形的细胞体。星形胶质细胞造成的推广效果更明显。许多哺乳动物大脑细胞、星形胶质细胞扮演着许多重要的角色在维持正常的脑功能,包括支撑结构、BBB形成和维护、神经元代谢,细胞外环境的维护,脑血流量的调节,稳定细胞通讯、神经递质合成、和抗氧化应激防御(30.- - - - - -32]。因此,星形胶质细胞在NVU也扮演着重要的角色。(1)星形胶质细胞代谢和结构支持角色和贡献BBB的完整性,神经元之间的联系沟通和内皮(33,34]。(2)星形胶质细胞已经清楚地显示,协助改善BMECs的紧张和诱导蛋白在细胞膜,可用于建立一个体外BBB SD模型和复制大脑内在。(3)星形胶质细胞促进神经元生长、分化成熟,轴突生长,连接,和维护和维持神经元的微环境,神经可塑性,生存和功能(33,35]。这表明,星形胶质细胞对神经元和BBB成熟在不同的时尚。此外,与单一的培养神经元或BMECs相比,NVU更能够抵抗OGD / R-induced受伤。总之,与BMECs或神经元只相比,NVU更成熟的BBB和神经元,作为一个完整的结构和功能单位,更具代表性的脑功能的完整性。

据我们所知,目前的研究是第一个显示CA在缺血性脑的神经保护效应是由于它能够稳定保持NVU完整性的BBB和保护神经元,使用一个OGD / R模型。CA保护BBB和神经元缺血性损伤减少整体NVU凋亡水平,氧化应激,炎症和神经损失。CA的组件胆汁酸的报道能够分散在磷脂双分子层和进一步穿过血脑屏障18]。同时,为主要活性成分的中药牛黄,CA已经证明降低炎性损伤和凋亡和抗炎作用19,20.]。此外,CA保护老鼠BMECs从体外缺血-再灌注损伤诱导的36]。更重要的是,我们发现BDNF在NVU最丰富的,主要是后星形胶质细胞释放的OGD / R,与CA和治疗显著提高BDNF的表达较模型组。脑源性神经营养因子对神经元生长至关重要、成熟和维护,以及神经可塑性,参与轴突和树突分化,提高神经细胞生存(37,38]。先前的实验和临床研究表明,脑源性神经营养因子是参与缺血性损伤后修复机制(39]。BDNF改善生存和神经保护功能通过绑定TrkB形成一个复杂的(23]。下游信号引起的BDNF-TrkB有许多复杂的受体酪氨酸激酶的特征,包括激活MAPK / Erk和PI3K / Akt通路(22]。在当前的研究中,我们发现CA移植治疗,分子PI3K, Akt, MAPK和Erk的磷酸化。结果证实了ANA12的应用。抑制PI3K / Akt通路和MAPK / Erk途径ANA12逆转p-PI3K的增加,p-Akt, p-MAPK, p-Erk水平。PI3K / Akt通路介导凋亡和prosurvival活动尤为必要和增强树突增长和分支以各种各样的方式(23]。MAPK / Erk通路对调节神经元的生存很重要,促进神经元分化和生存在各种各样的情况下(23,40]。PI3K / Akt和MAPK / Erk信号通路参与扩散,氧化应激,炎症和细胞凋亡在缺血性中风(22,41]。的重要转录因子介导脑源性神经营养因子转录监管是营BDNF转录调控是分子,这是必要的脑源性神经营养因子诱导的神经元树突分支和受损神经元的再生42]。我们的数据提供了证据表明CA可能起到神经保护作用通过BDNF-TrkB-PI3K / Akt通路和BDNF-TrkB-MAPK / Erk通路。综上所述,CA是通过调节神经炎症,氧化损伤,和增长因素,特别是通过触发BDNF-TrkB-MAPK / Erk和BDNF-TrkB-PI3K / Akt信号,最终导致经济复苏NVU BBB神经元功能和表型。显著改善BBB完整性和神经元生存在NVU显示更强的治疗潜力在未来人类的CA患者。

5。结论

NVU被认为是更全面的治疗目标。我们成功地建立了体外NVU之前,执行进一步的识别研究。体外NVU模型更适合理解细胞的功能和相互作用和药物在多个细胞的保护作用。研究表明,CA是通过调节神经炎症,氧化损伤,最终生长因子导致的恢复BBB NVU神经元功能和表型。CA可能起到神经保护作用通过BDNF-TrkB-PI3K / Akt通路和BDNF-TrkB-MAPK / Erk通路。因此,CA拥有得罪多个缺血性中风的机制的影响和保护在NVU多种细胞类型,可能是有用的作为一个治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81973789)和重大科技项目“重大新药创造”zx09301(批准号2019 - 173)。

引用

1. 组织者h·e·Marei a·哈桑·r·Rizzi et al .,“干细胞治疗缺血性中风的潜力。”神经学前沿,9卷,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 刘z和m . Chopp星形胶质细胞、神经保护治疗目标和neurorestoration在缺血性中风,”神经生物学的进展卷,144年,第120 - 103页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. a·施密特和j . Minnerup“促进缺血性中风的康复,”专家审查的神经病治疗,16卷,不。2、173 - 186年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. n . l .呻吟,p . y .梁:罗斯特,j . A .边锋A . Krtolica s p·卡里,“一个新的模式在保护缺血的大脑:保存再灌注前神经血管单元,”神经保护治疗中风和缺血性疾病施普林格,可汗,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. Abbott n, l . Ronnback和e·汉森,“Astrocyte-endothelial交互在血脑屏障,”神经系统科学自然评论。,7卷,不。1,41-53,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 铃木,斯特恩,o . Bozdagi et al .,“Astrocyte-neuron乳酸运输需要长期记忆的形成,“细胞,卷144,不。5,810 - 823年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. h . Uwamori t Higuchi, Arai k和r . Sudo,”神经发生和血管生成模型的集成构建神经与血管的组织,”科学报告,7卷,不。1,第17349条,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. t . Dalkara、l . Alarcon-Martinez和m . Yemisci“神经血管单元周围的周和中风的角色,”施普林格系列平移中风的研究施普林格,可汗,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. g . Adriani d, A . Pavesi r·d·卡姆和e . l .吴作栋”组成的三维血管微流体模型神经元,星形胶质细胞和脑血脑屏障内皮细胞,”芯片上的实验室,17卷,不。3、448 - 459年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. c . m . Zehendner r .白色,j . Hedrich和h . j . Luhmann“神经血管体外血脑屏障模型,”分子生物学方法卷,1135年,第413 - 403页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. p . j .罗克·l·g·科斯塔,“共培养的神经元和小胶质细胞当前协议毒理学,卷74,不。1,11.24.1-11.24.17,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. t·t·r . Liu, c . x, x局域网,和g·h·杜”针对神经血管单元:开发新的模型和考虑新策略对阿尔茨海默氏症,”大脑研究公告。,卷86,不。1 - 2,13-21,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. x, j .彭j .钟等。”β石竹烯保护在体外神经与血管的单位对oxygen-glucose剥夺和re-oxygenation-induced受伤。”神经化学杂志,卷139,不。5,757 - 768年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Naik c a Palmiotti, s·普拉萨德,p . et al .,”在体外在21世纪脑血管建模:当前和未来的技术,”医药研究没有,卷。31日。12日,第3250 - 3229页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. g·a·格兰特,n . j .雅培,d . Janigro”理解血脑屏障的生理学:体外模型,”生理学13卷,第293 - 287页,1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. C.-X。李,X.-Q。王之。程,x, j·罗和Q.-G。王,”猪去氧胆酸可以防止神经血管单元oxygen-glucose剥夺以及reoxygenation-induced受伤在体外”,神经再生研究,14卷,不。11日,第1949 - 1941页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. f·c·李x Wang程et al .,“京尼平甙预防缺氧/ reperfusion-induced血脑屏障损伤的增加紧密连接蛋白表达和减少炎症,氧化应激,和细胞凋亡在体外系统,”欧洲药理学杂志》上。卷,854年,第231 - 224页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. k·l·莫顿a . Kalsbeek m . r . Soeters和h . m . Eggink”胆汁酸肝肠循环的信号通路中枢神经系统,”神经科学前沿2017年,卷。11日。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. n张”,胆酸、栀子苷对内容的影响TNF -α,il - 1β和ICAM-1老鼠大脑损伤的脑缺血和再灌注,”中国中药杂志和药房。,18卷,不。8,463 - 465年,2003页。视图:谷歌学术搜索
20. z . w . c . x, z . Wang Jing,和z . j .,“药理通路Qingkailing有效成分的差异,”中国药理学通报,26卷,不。4、547 - 551年,2010页。视图:谷歌学术搜索
21. f . Cheng钟x, y陆et al .,“精制Qingkailing保护MCAO老鼠从内质网应激细胞凋亡与广泛的时间窗口,“以证据为基础的Complementray和替代医学第567872条,卷。2012年,页1 - 12,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. m . w . Liu x Wang奥康纳,g . Wang和f·汉,“脑源性神经营养因子在中风并发症及其潜在的治疗作用,”神经可塑性ID 1969482条,卷。2020年,13页,2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. p . Kowiański g . Lietzau e . Czuba m . Waśkow a . Steliga和j . Moryś“脑源性神经营养因子:与多功能的关键因素对大脑信号传导和突触可塑性的影响,“细胞和分子神经生物学。,38卷,第593 - 579页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. j .争吵g·阿尔维斯,a .命运,法尔考,“血脑屏障模型及其相关性对于一个成功的发展中枢神经系统的药物递送系统:复习一下,”欧洲医药、生物药剂学杂志》上,卷87,不。3、409 - 432年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. n·j·阿伯特”,血脑屏障结构和功能、中枢神经系统药物输送的挑战,”遗传性代谢疾病杂志》上。,36卷,不。3、437 - 449年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. k . Melkova诉Zapletal,美国纳史木汗et al .,“微管相关蛋白的结构和功能τ和MAP2c:异同,”生物分子,9卷,不。3,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. m . s .阳光、h·金太阳x et al .,“自由基损伤在缺血再灌注损伤:一个障碍在急性缺血性中风后血管再生疗法,”氧化医学和细胞寿命ID 3804979条,卷。2018年,17页,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. r . l . Jayaraj s Azimullah r . Beiram f . y .塔拉和g·a·罗森博格“缺血性中风神经炎症:朋友和敌人,”《神经炎症,16卷,不。1,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. d . Radak n . Katsiki i Resanovic et al .,“细胞凋亡和急性脑缺血在缺血性中风,”当前心血管药理学,15卷,不。2、115 - 122年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. y . c . y . Liu Yang w . n . Ju x Wang和h·l·张,“新兴角色的星形胶质细胞在neuro-vascular单元和三方突触的上下文中强调反应性胶质增生阿尔茨海默氏症,”细胞神经科学前沿,12卷,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. r . Eilam m·西格尔,r . Malach m·塞拉r·亚嫩河和r·爱“星形胶质细胞神经与血管的通信中断与皮层损伤的多发性硬化的动物模型,”神经胶质,卷66,不。5,1098 - 1117年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. b . r .赎金和c b赎金,“中央神经系统,星形胶质细胞:多才多艺的明星”分子生物学方法。卷,814年,页3 - 7,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. y . c .郭c·l·李和r·拉杰什”的监管人类大脑血管周和星形胶质细胞在血脑屏障模型使用人脑微血管内皮细胞:表达TGF -β1、VEGF MMP-9, P-gp。”台湾化学工程师学会杂志》上卷。86年,上行线,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
34. a . Becerra-Calixto r . Posada-Duque, g . p . Cardona-Gomez”复苏的神经血管单元的完整性CDK5-KD星形胶质细胞移植在全球脑缺血模型中,“分子神经生物学,55卷,不。11日,第8585 - 8563页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
35. a . v . Molofsky r . Krenick大肠Ullian et al .,星形胶质细胞和疾病:神经发育的角度来看,“基因与发展,26卷,不。9日,第907 - 891页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
36. 黄懿慧高,z z元,f . l .妞妞w . Gui, l .问:朱和s . r . Wang“胆酸在体外的保护作用在脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤模型,”中国《本草书。,30卷,第932 - 930页,2005年。视图:谷歌学术搜索
37. m . Choo t .宫崎骏,m .山崎et al .,“逆行BDNF TrkB信号促进小脑突触消除发展中,“自然通讯,8卷,不。1,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
38. b·w·吴,吴m . s . j . d .郭”microRNA-10a对海马神经元的突触重构的影响并通过BDNF-TrkB神经元细胞增殖和细胞凋亡信号通路在阿尔茨海默病大鼠模型,”细胞生理学杂志》上。,卷233,不。7,5281 - 5292年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
39. 李x, j·b·钟,s m .钟j . d . Liu c·b·陈,吴x y,”击倒长非编码反义RNA脑源性神经营养因子变弱缺氧/ reoxygenation-induced神经细胞凋亡通过BDNF-TrkB-PI3K / Akt信号通路,”Neuroreport,28卷,不。14日,第916 - 910页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
40. g . s . Tejeda和m . Diaz-Guerra积分表征缺陷BDNF / TrkB信号在神经和精神疾病新疗法,”国际分子科学杂志》上,18卷,不。2、2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
41. 罗,h . Li z莫et al .,“连接地图标识毛地黄黄酮抑制缺血性中风的治疗选择MMP9和PI3K / Akt信号通路的激活,“实验与分子医学,51卷,不。3、1 - 11,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
42. a·冈萨雷斯,g . Moya-Alvarado c Gonzalez-Billaut, f·c·布朗”调节神经元生长的细胞和分子机制脑源性神经营养因子,”细胞骨架,卷73,不。10日,612 - 628年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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