文摘

心磷脂(CL)是一种多功能二聚的磷脂,物理与电子传递链复合物,III, IV, ATP合酶(复杂V)的心磷脂酶ALCAT1催化转换将多不饱和脂肪酸纳入心磷脂。结果氯物种更容易受到氧化损伤。这被认为负面影响心磷脂和电子传递链复合物的相互作用,导致增加生产活性氧和线粒体功能障碍。此外,讨论的是ALCAT1本身是由于氧化应激调节。在这里,我们调查的影响,过度的ALCAT1不同代谢条件下。ALCAT1位于ER和线粒体,可能在接触网站。我们发现呼吸刺激由半乳糖供应提升supercomplex大会也导致增加线粒体ROS水平。内生ALCAT1蛋白质表达水平表现出相当高的变化。人工诱导ALCAT1过度降低supercomplex形成,进一步促进活性氧的生产,避免upregulation耦合的呼吸。综上所述,我们的数据表明,CL转换酶的数量ALCAT1对线粒体呼吸和代谢耦合塑性至关重要。

1。介绍

心磷脂(CL)是一个独特的磷脂,于1947年首次发现在牛肉的心1]。它也被称为线粒体脂质(签名2- - - - - -4]。大约75%的氯含量存在于线粒体内线粒体膜(IM),其生物合成发生(5,6]。CL是线粒体功能和重要活动和影响在其他电子传递链(等)。因此,毫不奇怪,CL改变或CL损耗是许多疾病的一部分。TAZ1基因的突变,一种蛋白质,它是重要的CL最后酰基链组成,导致x染色体疾病,叫做巴斯综合症。这种疾病的特点是骨骼和心脏肌肉疾病和循环嗜中性白血球减少症,而心脏缺陷和机会性感染是死亡的主要原因2,7]。CL负电荷磷脂二聚体是由两个通过甘油磷脂酸分子连接。事实上每个CL分子有四个酰基链区分它和所有其他磷脂(8,9]。

CL是一个多功能的磷脂,在非病理性条件,建议参加不同的线粒体凋亡细胞死亡信号等机制,氧化磷酸化(OXPHOS)和聚变和裂变的事件10,11]。它与膜间隙(IMS)或膜结合蛋白,如电子传递链(等)复合物以及可溶性蛋白质,例如,IMS的磷酸转移酶,NDPK-D (nucleoside-diphosphate kinase-D),和MtCK(线粒体肌酸激酶)11,12]。CL的交互与复杂的我(CI),三世(CIII)和IV(文明)等建议来支持他们的组装呼吸道supercomplexes (SCs),有利于降低ROS讨论生产(13,14]。的脂质成分IM SC组装(可能是重要的13]。研究SC安排提出结合位点的松散和紧密地绑定CL (15]。CL所示是紧密地绑定到CI和被这个复杂的电子传递所需16,17]。氧化氯和CL水平下降导致更少的SC形成(15,18]。管制等被视为活性氧的主要来源(19- - - - - -21]。CL也与复杂的V, ATP合酶。CL建议促进ATP合酶二聚作用,有关嵴架构(22,23]。CL不足导致果蝇的单体的ATP合酶水平增加(22]。

定酰基链组成的CL postsynthetic修改步骤生成分子,称为改造(9]。改造增加的量不饱和酰链在CL (9,24和是CL成熟过程的一部分25)涉及三个酶:tafazzin小胡子,monolysocardiolipin酰基转移酶1 (MLCLAT1)和酰coa: lysocardiolipin酰基转移酶1 (ALCAT1) [8,26]。建议CL的重塑小胡子是重要的维持正常的酰基链组成。ALCAT1酰coa: lyso-CL MLCLAT1[的酰基转移酶和一个对碘氧基苯甲醚8]。CL物种细胞overexpressing ALCAT1增加水平的多不饱和脂肪酸,尤其是DHA (C22:6n3)和数量显著降低的C16-C18脂肪酸(27]。

在这里,我们着手调查是否ALCAT1水平变量不同代谢条件下。此外,我们想要确定人为的影响中ALCAT1糖酵解和呼吸半乳糖的条件下。我们没有发现显著差异ALCAT水平不同呼吸条件下由于内生ALCAT1水平高的变化。ALCAT1当时局部ER和线粒体,可能联系网站。人为ALCAT1水平升高阻碍supercomplex形成和促进活性氧的生产。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

海拉WT细胞培养基本媒介厄尔的盐(5.6毫米葡萄糖+谷酰胺)补充10% FCS(胎牛血清),消息灵通的1%,1% NEAA(不必要的氨基酸),和1%的青霉素和链霉素在37°C和5%的公司2。细胞分裂时汇合的使用胰蛋白酶/ 80 - 100% EDTA对细胞分离。细胞呼吸化验,细胞培养XF基地中包含10毫米D-galactose最小DMEM(海马生物科学、太和D-Glc禾谷酰胺,酚红,我们NaHCO3FCS)补充10%,1%的玫瑰,1% NEAA(不必要的氨基酸),1%的青霉素和链霉素,mL NaHCO alanyl-L-glutamine 2%,和2875%3。海拉细胞被从莱布尼兹研究所购买DSMZ-German收集微生物和细胞培养和转染钙瞬变转染的方法如果需要。转染细胞转染48 - 72 h后使用。

下面的质粒用于转染:pSems-ALCAT1-2A-GFP-NLS pSems-ALCAT1-HA, pSems-ALCAT1-mCherry。表示序列的质粒所示的补充材料。pSems-ALCAT1-2A-GFP-NLS表达式的结果未加标签的ALCAT1与nuclear-targeted GFP转染成功的记者。此外,我们使用了质粒CoxVIIIa-sEcGFP和CoxIV-sEcGFP28]。

2.2。海马XF细胞水压力测试工具

海马XF细胞水压力测试套件使线粒体代谢分析测量耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。顺序注入抑制剂和OXPHOS解偶联剂(寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A)用于确定基底呼吸、质子漏,ATP生产,nonmitochondrial呼吸(补充图。S1)。在测量前,~ 30000细胞/被播种在海马XF细胞培养微型板块和37°C和5%孵化有限公司2。180年μL XF Calibrant被添加到每个传感器的校准水合物盒和37°C和0%孵化有限公司2。第二天,这些细胞被洗与PBS和孵化试验介质1 h在37°C和0%的公司2。抑制剂股票的解决方案与XF基地准备和混合介质(5.6毫米,葡萄糖或半乳糖10毫米,4毫米谷氨酰胺,pH值7.4)获得恒定的化合物浓度:1μM寡霉素,1μ0.5 M FCCP,μ米鱼藤酮/抗霉素A抑制剂的解决方案被加载到港口的水合物传感器盒(寡霉素,B: FCCP C:鱼藤酮/抗霉素A)。校准后的海马水合物传感器盒、基底和ATP synthesis-linked呼吸、质子漏,最大呼吸,nonmitochondrial呼吸测定了18分钟。与海马XF压力测试结果分析报告生成器(XF细胞水压力测试工具箱用户指南)。

2.3。免疫印迹

细胞,生长在葡萄糖或半乳糖媒介48 h,是从T25-flask菜在SDS样品缓冲用细胞刮板和转移到1.5毫升反应管。涡流后,细胞溶解产物在冰上孵化了10分钟,然后在95°C煮5分钟。SDS样本存储在-20°C。sds - page运行了60 V。当样品到达分离胶,增加到100 - 150 V电压。PageRuler Prestained蛋白质梯(产品# 26619,ThermoFisher科学)作为标记。蛋白质转移到PVDF膜,和印迹进行半干的方式为2 h 100 mA。吸水后,细胞膜被孵化与朱红色年代10分钟来控制蛋白质转移。朱红色年代与MilliQ冲走,膜被10毫升的10%脱脂奶/ TBST(20毫米三;0.137 M氯化钠,0.1%渐变20)1 h,以防止非特定的绑定的主要抗体。 The primary antibody was diluted in 1% skimmed milk/TBST and was added to the membrane overnight at 4°C. Then, the membrane was washed three times with TBST for 15 min and incubated for 1 h with the secondary antibody, also diluted in 1% skimmed milk in TBST. Again, the membrane was washed three times with TBST for 15 min. Finally, SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate 1 : 1 (ThermoFisher Scientific) were added to the membrane and the fluorescent signal was detected with the ChemiDoc MP Imaging System (BIO-RAD). The primary antibodies that were used for the protein expression analysis are listed in Supplementary Table1。的peroxidase-conjugated AffiniPure山羊Anti-Rabbit免疫球蛋白(H + L)(杰克逊ImmunoResearch Dianova)被用作二次抗体的最终稀释1:2000。

免疫印迹结果的图像处理Adobe Photoshop,和蛋白质含量的定量分析执行ImageJ™(MacBiophotonics)。均值和集成密度灰色值感兴趣的蛋白质与VDAC规范化(压敏电阻器阴离子通道),线粒体膜蛋白与线粒体质量。两个示例,两面 - - - - - -测试统计分析,起源(OriginPro 2016, OriginLab)使用。

2.4。显微镜

显微镜的细胞被播种在盖玻片上3厘米菜(confluency 70%)与葡萄糖或半乳糖糖源介质48 h。成像,盖玻片是安装在一个细胞室提供1毫升的媒介。使用一个倒置的共焦显微镜的细胞成像(TCS SP8 SMD,徕卡)配备了63 x水客观附加说明(1.2)和Time-Correlated单光子计数(TCSPC)设备。活细胞成像在37°C提供5%的股份有限公司2。荧光寿命的记录兴奋CoxVIIIa-sEcGFP CoxIV-sEcGFP TCSPC执行的。海德拉巴的GaASP光电阴极被用作双颜色探测器记录和这部电影(荧光寿命成像显微镜)。对于这部电影,排放限制在525/50 nm(例488海里,20 MHz)。至少要到1000年收购了光子在最亮的像素。数据分析与软件(64位)和biexponential SymphoTime荧光衰变曲线的拟合(对照组IRF)从roi的线粒体的细胞网络。从biexponential合适,平均寿命 计算了。为标准的显微镜,海拉与ALCAT1-2A-GFP-NLS WT暂时细胞转染质粒DNA,除了ALCAT1的本地化。对于这部电影,海拉暂时WT细胞转染ALCAT1-mCherry和CoxVIIIa-sEcGFP或CoxIV-sEcGFP。

2.5。线粒体膜电位、线粒体足迹和ROS的决心

确定形态在不同的营养条件下,海拉WT ALCAT1-2A-GFP-NLS表达细胞在葡萄糖和半乳糖培养基培养48 h和沾有100海里MitoTracker红在正常生长条件下(37°C, 5%的公司230分钟)。然后,细胞被洗两次与PBS和一次性去除染料的媒介。~ 45细胞的荧光与荧光显微镜检查(TCS SP8徕卡)63 x水浸的目标。励磁电源是脉冲supercontinuum白光激光器(徕卡微系统,在80 MHz)。nuclear-targeted GFP的排放是设置为510 - 540海里(488海里),和MitoTracker红色的发射是留念在600 - 700海里(561海里),记录下混合探测器。最后,线粒体形态(意味着分支长度和线粒体足迹)进行了分析与ImageJ™插件“米娜”(Valente et al ., 2017)。ROS的决心,MitoTracker使用红色。MitoTracker红色是减少,nonfluorescent版MitoTracker红(m - 7512, ThermoFisher)迅速氧化。Z-stacks 7片(360 nm的步长)MitoTracker红染色细胞相同的记录设置如上所述。分析了荧光强度与ImageJ (MacBiophotonics)。 To exclude the background intensity, the Otsu mask was used for thresholding. A higher grey value corresponds to a higher ROS level, respectively mitochondrial membrane potential. For determination of the mitochondrial membrane potential, the cells were stained with 7 nM TMRE instead of 100 nM MitoTracker Red CM-H2XRos.

2.6。的本地化ALCAT1

海拉WT细胞cotransfected ALCAT1-mCherry质粒和CoxIV-sEcGFP质粒DNA。抗体anti-KDEL从圣克鲁斯生物技术(10 c3;1:50)作为标记的ER。二次抗体,山羊anti-mouse免疫球蛋白g h和l (Alexa萤石®647;1:500)是使用。短暂,抗体染色进行细胞用4%多聚甲醛固定后,以0.1% Triton-X透化作用,阻止2% BSA,和洗Tween-20 0.01%, PBS。细胞进行荧光显微镜(TCS SP8徕卡mCherry:交货。561海里,em。585 - 605海里;mEGFP:例488海里,em。510 - 530海里;Alexa 647:交货。633海里,em。720 - 800 nm)。另外,海拉WT细胞cotransfected ALCAT1-mCherry质粒和CoxIV-sEcGFP沾LysoTracker蓝色™(LysoTracker蓝™:交货。405海里,em。420 - 460海里; mCherry: ex. 580 nm, em. 610-630 nm; mEGFP: ex. 488 nm, em. 500-535 nm). Scatterplots with linear regression as well as Pearson’s and Manders’ coefficients were determined with the ImageJ™ plugin “colocalization threshold.”

2.7。统计数据

比较的样本具有相同的样本大小,我们使用方差分析与事后图基测试;对样本的样本大小的比较,我们使用方差分析与事后矫正或Fisher LSD进行统计分析。盒子和须情节显示25th到75年th%百分比在盒子里。平方均值;盒子里的水平线是队列的相应值。曼德和皮尔森系数计算描述ALCAT1信号的重叠程度与线粒体和溶酶体,分别。

3所示。结果

3.1。ALCAT1是局部ER和线粒体

据报道,FLAG-tagged ALCAT1是局部ER (8),而另一项研究报道,ALCAT1主要是局部mitochondrial-associated膜(27]。测试colocalization ALCAT1之间,呃,线粒体,海拉细胞转染对线粒体染色和ALCAT1-mCherry CoxIV-sEcGFP。ER形象化,我们执行immune-staining KDEL, ER-localized蛋白,此外。Alexa萤石®647年作为二次抗体。我们进行三色分析细胞与温和的(图1(一)(图)和高1 (b))ALCAT1表达式。有趣的是,我们不仅发现了高重叠ALCAT1和KDEL还相当高重叠ALCAT1 CoxIV-sEcGFP,证明了二维直方图(散点图),其中两个为每个像素强度值(体素)绘制。相关性是信息可视化的云中间的散点图,配备了一个线性回归。颜色越亮,越高强度值的相关性两个渠道(数字1 (c)和1 (d))。这些数据清楚地表明,ALCAT1不仅是局部ER (colocalization图中可以看到1 (f)),而且在线粒体。然而,为了揭示这种重叠是否确实表明ER-mitochondria联系网站,使用超限分辨显微镜需要进一步的研究。

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图1
过表达ALCAT1局部ER和线粒体。荧光显微镜分析瞬变转染细胞表达CoxIV-sEcGFP ALCAT1-mCherry沾抗体对ER KDEL标志。(一)低ALCAT1-mCherry表达式。(b)高ALCAT1-mCherry表达式。箭头在放大图像之间指着ALCAT1-mCherry本地化ER和线粒体的,换句话说播出。(c)合并双色ROI (a)所示的图像。(d)合并双色缩放的图像ROI (b)所示。(e, f) Colocalization分析显示设定阈值后的散点图的颜色通道。(e) Colocalization分析该地区(a + c)所示,(f) Colocalization分析区域(b + d)所示。左上象限= Ch2高于阈值;Ch1低于阈值;左下象限= Ch1低于阈值; Ch2 below threshold; lower right quadrant = Ch1 above threshold; Ch2 below threshold; upper right quadrant = Ch1 above threshold; Ch2 above threshold; with linear regression; channel 1 (Ch1) =  - - - - - -轴,通道2 (Ch2) = - - - - - -轴。为每个通道自动确定阈值的散点图(ImageJ插件“colocalization阈值”),而图像展示手工处理ImageJ提高对比度。规模的酒吧:10μM (a, b)。

很大一部分的过表达ALCAT1-mCherry转染海拉细胞被发现在核附近的点状结构类似于溶酶体(图1)。溶酶体中蛋白质的定位并不罕见。检查是否ALCAT1本地化在溶酶体的一部分,我们进行了三色荧光colocalization与基因编码荧光显微镜和葡萄糖条件下细胞内溶酶体标记。图片拍摄的细胞表达ALCAT1-mCherry CoxIV-sEcGFP和沾LysoTracker蓝色™(补充图。1)。事实上,大量ALCAT1在溶酶体中找到。的定量colocalization分析表明,分数ALCAT1 colocalizing与溶酶体的colocalization高于ALCAT1和线粒体(补充图。1 b- - - - - -c)。在一起,这些数据表明,人工诱导ALCAT1与不同的细胞溶酶体等细胞器。这是否反映了ALCAT1必须显示的自然分布在未来的研究适合immune-staining ALCAT1抗体是可用的。

3.2。人工诱导内生ALCAT1 ALCAT1适度过表达和压制

细胞是暂时性的表达标记ALCAT1在平均总ALCAT1水平的2 ~ 3倍高于控制(图2(一个))。这根据观察不同的细胞系,早些时候在mRNA水平增加三倍(29日]。有趣的是,人为地诱发ALCAT1过度导致明显降低内生ALCAT1水平(图3(一个))。在这个阶段,我们不能排除一种反馈机制,抑制内源性ALCAT1的转录。同样的已经被证明ALCAT1 overexpressing COS7细胞,但不评论(8]。

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图2
人工诱导和内源性ALCAT1水平。(a)测定相对ALCAT1水平在海拉细胞暂时提供不同的糖和细胞转染ALCAT1-EGFP和ALCAT1-HA-tag分别转染后48 h。转染效率通常是~ 60%;数据显示不正确。上带显示了标记ALCAT1版本,带内生ALCAT1越低。VDAC线粒体蛋白,用作加载控制。量化,ALCAT1在VDAC规范化水平。总ALCAT1和内源性ALCAT水平测定。A-GFP: ALCAT1-2A-GFP-NSL,啊哈:ALCAT1-HA-tag。 生物复制。离开图:总ALCAT水平,平均值表示。正确的图:只有内生ALCAT水平显示。盒子,晶须的情节。统计:方差分析与事后图基。(b)代谢的影响条件对内源性ALCAT1水平。从(a)量化包含值。 技术复制 生物准备ALCAT低葡萄糖(LGlc;5.6毫米), 2 d半乳糖(加); 半乳糖4 - 5 d; 高葡萄糖(HGlc, 25毫米)。VDAC被用作加载控制。统计:SD,方差分析和LSD事后费舍尔测试。n。:没有显著差异的平均值。
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图3
线粒体形态的分析ALCAT1 overexpressing细胞。暂时性的转染ALCAT1-2A-GFP-NLS (tr。ALCAT1)和海拉WT细胞提供5.6毫米10毫米半乳糖和葡萄糖,分别为48 h。线粒体网络形态的定量分析ImageJ™插件米娜。MitoTracker红染色线粒体进行了分析。从MiNA-processed形态学数据提取(=对比增强)图像。(a) MiNa-processed图像(红色)线粒体骨架的海拉细胞经过MitoTracker红染色的海拉WT和ALCAT1 overexpressing细胞、相关和加(规模酒吧:10μ米)。(b)定量米娜分析意味着分支长度的线粒体。(c)定量米娜分析线粒体的足迹。足迹是积极的和像素每个细胞和代表线粒体区。 生物复制。每个数据点代表数据从一个细胞。统计数据:数据分析了单向方差分析和LSD事后费舍尔( ; ;和 ),SD所示。
3.3。自然ALCAT1水平不同

自然ALCAT1水平增加在病理条件下,糖尿病,肥胖,心肌病(8,27]。我们问是否ALCAT1水平非病理性条件下也会改变。线粒体的活性变化不同代谢条件下(30.),包括OXPHOS系统的改造。它可以假设这也担忧心磷脂及其重构。在这里,我们审查是否改变引起的代谢变化的糖源对ALCAT1水平产生影响。我们没有发现显著变化在ALCAT1水平细胞提供半乳糖或高葡萄糖水平而不是葡萄糖糖摄入量(图2 (b))。然而,我们发现高变异的内生ALCAT1内容在所有情况下。

3.4。ALCAT1对线粒体形态的影响

分析不同ALCAT1水平是否会影响线粒体形态、我们与ALCAT1-2A-GFP-NLS瞬变转染希拉WT细胞,染色的细胞MitoTracker红™(图3(一个))。每个细胞线粒体区决定使用一个自动分析工具(ImageJ™插件米娜)。形态学数据提取生成的二进制图像通过一个自动阈值。二进制图像的一个副本被叠加到原始图像。从形态学骨架分支长度的平均值和标准偏差在每个网络确定。足迹计算的和积极的像素(二进制图像)的每个细胞,代表了线粒体。细胞提供半乳糖显示更高的分支长度相比glucose-fed细胞( )。细胞表达ALCAT1瞬变也有更高的半乳糖的分支长度比葡萄糖( )见图3 (b)。在葡萄糖,ALCAT1 overexpressing细胞没有显示显著改变线粒体分支长度相比,控制细胞。没有区别的线粒体区(足迹)被发现之间的半乳糖和葡萄糖供应细胞。然而,细胞被人为overexpressing ALCAT1显著降低线粒体区(μ米2)相比,控制细胞( )在葡萄糖和ALCAT1 overexpressing细胞( )在半乳糖(图3 (c))。总之,我们没有发现关系ALCAT1超表达相同的代谢条件下和线粒体的形态。

3.5。ALCAT1对线粒体生物能学的影响

分析可能改变线粒体呼吸和ATP合成(氧化磷酸化,OXPHOS)对ALCAT1超表达,我们确定线粒体耗氧速率(OCR)和并行细胞外酸化率(ECAR)的自动流量分析仪(海马/安捷伦XF 96)。我们使用了压力测试中描述的材料和方法的后续补充ATP合酶抑制剂寡霉素,的解偶联剂carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)和复杂的我和III抑制剂鱼藤酮/抗霉素A(补充图S2)。此外,我们比较了OCR和ECAR葡萄糖或半乳糖的细胞培养48 h。海拉野生型(WT)细胞显示增加基底和ATP合成——(CV) OCR半乳糖(数据有关4(一)和4 (b))。与半乳糖糖供应,细胞被氧化磷酸化被迫依赖ATP合成(OXPHOS)如前所述30.),如图所示基底,CV-linked呼吸显著增加。ALCAT1过度阻止galactose-induced增加呼吸。

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图4
在线粒体生物能疗法ALCAT1水平升高的影响。自动流量分析的耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的海拉WT提供葡萄糖和半乳糖48 h和ALCAT1 overexpressing细胞在相同的条件下。(a)耗氧率(OCR)海拉WT和暂时性的转染ALCAT1 overexpressing细胞。ocr (ECAR)进行了分析与海马XF细胞水压力测试工具的顺序注射寡霉素(2μFCCP(1米)μ米),鱼藤酮/抗霉素A (0.5μ米)。5.6毫米提供的细胞葡萄糖或10毫米半乳糖测量前48 h。 为每个条件复制30井。(b)基底和最大呼吸,呼吸产能,CV-linked呼吸、质子漏,nonmitochondrial呼吸从ocr (a)所示。一维方差分析与事后矫正人员( ; ;和 )。(c)相应的细胞外酸化率(ECAR)。

接下来,ALCAT1进行靶向治疗对糖酵解的影响。海拉控制和ALCAT1 overexpressing细胞表现出细胞外高酸化率比半乳糖(ECAR)葡萄糖供应,这是一个衡量增加糖酵解(图5(c))。这反过来意味着刺激诱发的呼吸半乳糖是糖酵解的牺牲。ALCAT1超表达无显著影响糖酵解的galactose-induced减少。在一起,这些数据表明,高ALCAT1水平干扰OXPHOS刺激引起的开关从葡萄糖、半乳糖,但对糖酵解率没有影响。

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图5
线粒体ROS水平ALCAT1 overexpressing细胞在不同的营养条件下。(a)双彩色图像显示ROS形成细胞与正常ALCAT1水平和细胞与人工ALCAT1水平升高(tr。ALCAT1:暂时性的转染细胞表达ALCAT1-2A-GFP-NLS)。转染细胞被确定绿核(GFP:: NLS)。细胞提供不同的糖表示之前48 h。与MitoTracker红染色后,分析了细胞荧光显微镜(MitoTracker红色: 561海里, 600 - 700 nm, GFP: 488海里, 510 - 540 nm)。(b)定量分析活性氧形成MitoTracker红色荧光强度信号(任意单位,a.u)。与测量结果提出了箱形图~ 45测量细胞的荧光强度。数据分析与事后矫正单向方差分析( ; ;和 ),SD所示。
3.6。线粒体ROS水平增加ALCAT1水平升高

在孤立的线粒体活性氧(ROS) H2O2增加ALCAT1 overexpressing细胞(29日]。然而,分离线粒体往往失去ROS排毒系统,可能会导致更高的ROS水平(31日]。我们这里确定影响呼吸的增加会对活性氧(ROS)水平在完整细胞与正常和ALCAT1水平升高。葡萄糖和半乳糖提供海拉控制和ALCAT1 overexpressing细胞沾MitoTracker红色,ROS指标,研究ALCAT1对活性氧的影响在不同的营养条件下生产。ROS水平显著增加野生型和ALCAT1 overexpressing细胞提供半乳糖(呼吸道条件)(图5)。只有在半乳糖,ALCAT1 overexpressing细胞ROS生成显示高于细胞与正常ALCAT1水平。线粒体膜电位略增加ALCAT1 overexpressing细胞在两种营养条件下相比,海拉控制葡萄糖(补充图。S3)。在一起,这些数据表明,呼吸条件下ALCAT1水平升高与ROS水平也增加在cellulo。

3.7。ALCAT1对呼吸的影响Supercomplex形成

CL的交互与复杂的我(CI),复杂的三世(CIII),复杂的IV(文明)等建议来支持他们组装到呼吸道supercomplexes (SCs)。氯氧化,增加从未CL和CL总水平下降导致SC形成减少,这种现象与描述巴斯综合症(32]。我们想知道影响ALCAT1超表达对SC的形成。为了验证这一点,我们用生命细胞传感器对SC形成兼容,sEcGFP融合亚基CoxVIIIa文明。当SCs形成CoxVIIIa-sEcGFP被埋在一个密集的分子环境界面的CI, CIII,文明的荧光寿命的减少 传感器的sEcGFP [28]。作为一个控制,文明的另一个亚基,CoxIV, sEcGFP融合。即使在SC,传感器sEcGFP CoxIV不暴露在不同环境和荧光寿命不会改变。 确定了时间相关单光子计数。如图6, 减少的条件下更高的呼吸(半乳糖条件),表明更多的SCs。在ALCAT1 overexpressing细胞,并没有观察到这种效应;的意思是 是葡萄糖和半乳糖的相同和类似的低葡萄糖条件下的海拉细胞。显然,ALCAT1水平超过一定阈值SC形成阻碍,可能由CL。

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图6
ALCAT1妨碍了SC OXPHOS刺激条件下形成。(一)荧光寿命在亚基CoxVIIIa sEcGFP的图像。这种构造被埋在一个现有的呼吸supercomplex和荧光寿命降低 。作为控制单元CoxIV贴上sEcGFP,一生不应对SC形成下降(28]。细胞转染与ALCAT1-mCherry (tr ALCAT1),生长在葡萄糖(5.6毫米)或半乳糖(10毫米)媒介48 h。(b)平均荧光寿命 不同的呼吸条件下的CoxVIIIa-sEcGFP + / - ALCAT1-mCherry超表达。(c)平均荧光寿命 不同的呼吸条件下的CoxIV-sEcGFP±ALCAT1-mCherry超表达。 复制。数据分析了单向方差分析与事后矫正人员测试。酒吧规模:20μM (a)。

4所示。讨论

在这里,我们描述的影响线粒体生物能学ALCAT1水平升高,活性氧的形成,和呼吸supercomplex形成。ALCAT1水平升高是通过外源质粒的表达。我们可以表明ALCAT1人为过表达时,在局部ER还像之前描述的那样在线粒体膜(8,27]。的colocalization ALCAT1-mCherry信号与ER标记KDEL一起的结果(27),表明ALCAT1酶活性较高的亚细胞分数比线粒体播出,播出的优惠本地化。然而,这种本地化不仅仅是线粒体本身仍然表现出ALCAT1活动(27)在小鼠的肝脏,大规模spectrometry-based蛋白质组的分析播出根本没有确定ALCAT1 [33]。似是而非,但仍被测试的假设是由人工超表达等关键高ALCAT1水平导致ALCAT1积累在播出。相比之下,工件定位在溶酶体可能是一个一般的超表达。

我们想知道是否ALCAT1水平自然会改变不同代谢条件下。不同的代谢条件的改变引起的糖在中。开关从葡萄糖、半乳糖被上调OXPHOS [30.通过改变活动和/或蛋白质的表达参与有氧能量代谢(34]。内源性ALCAT1蛋白质含量的测定免疫印迹显示高可变性,。出于这个原因,我们的数据对内源性ALCAT1水平细胞不允许一个结论性的声明是否ALCAT1水平改变不同代谢条件下。葡萄糖半乳糖所取代时,线粒体呼吸刺激和ATP是最好由有氧磷酸化。因此,我们发现,在半乳糖ROS生产增强,特别是在ALCAT1 overexpressing细胞。在这种情况下,它是一个重要的观察,人为地增强ALCAT1负面影响呼吸道supercomplex (SC)组装。CL结合等复合物,III, IV和ADP / ATP运营商。保持完整的酶功能,文明需要两个氯分子有关,而CIII也需要CL维持四级结构和功能(35]。据报道,种跨膜螺旋跨膜区域的形成一个腔CIII [36]。腔,位于CIII /文明接口,充满了CL和磷脂酰乙醇胺。自从CL绑定等配合物促进SC大会(15,37),可以看到CLs作为supercomplexes胶(38]。由于这些原因,它似乎不可能减少supercomplex形成ALCAT1 overexpressing细胞是改变心磷脂含量的结果或专门修改CLs不提供胶水supercompex形成了。进一步的研究应该直接解决,如何扩展心磷脂物种或心磷脂水平增强ALCAT1条件下受到影响。这些研究特别应该关注CL的过氧化反应。

数据可用性

数据将根据要求提供。

的利益冲突

作者没有申报任何竞争性的财务利益。

作者的贡献

K.B.B.和开国元勋之一B.R.安贝德卡对概念和设计。开国元勋之一B.R.安贝德卡对,A.K., and P.D. helped in acquiring data. K.B.B., B.R., A.K., and P.D. analyzed and interpreted the data. K.B.B. and B.R. wrote the article.

确认

我们感谢Wladislaw科尔在克隆技术援助和Franziska斯皮尔宝贵的初步数据。我们请承认支持的开国元勋之一B.R.安贝德卡对GRF-funded CRC944,格兰特INST-190/167-2。

补充材料

增刊。图1:海马XF细胞水压力测试概要文件。连续注射等复杂的基础呼吸抑制剂使测量质子漏,最大呼吸,nonmitochondrial呼吸(XF细胞水压力测试工具箱用户指南)。增刊。图S3:免疫印迹分析ALCAT1-2A-GFP-NLS tr。(A)免疫印迹结果VDAC和ALCAT1希拉wt和tr。ALCAT-2A-GFP-NLS转染后细胞葡萄糖48 h。(B)的定量分析ALCAT1蛋白表达与VDAC正常化后。不包括中间的乐队,因为他们属于另一个实验。表1:主要用于抗体免疫印迹分析。(补充材料)