膳食补充抗氧化剂的姜黄素暂停系统性LPS-Induced Neuroinflammation-Associated神经退化和记忆/通过物/ NF -突触损伤κB / Akt信号通路在成年老鼠

文摘

姜黄素是一种天然多酚化合物广泛已知有抗氧化、抗炎、抗凋亡的属性。在目前的研究中,我们探讨了神经保护作用的姜黄素对脂多糖(LPS)诱导活性氧(ROS)介导的神经炎症,神经衰弱,在成年大鼠海马记忆缺陷通过调节物/ NF -κB / Akt信号通路。成年老鼠与LPS腹腔内治疗剂量的250μ克/公斤7天,姜黄素的剂量300毫克/公斤14天。14天后,老鼠牺牲,免疫印迹和ROS和脂质过氧化作用进行了分析。免疫组织化学和共焦显微镜,老鼠灌注transcardially 4%多聚甲醛。为了验证JNK-dependent体内神经保护作用的姜黄素和确认结果,HT-22神经元和BV2小胶质细胞暴露在有限合伙人的剂量1μ100 g / ml,姜黄素μg / ml, SP600125(特定物抑制剂)20μm .我们免疫组织化学、免疫荧光和生化结果表明,姜黄素抑制LPS-induced氧化应激通过减少丙二醛和2,7-dichlorofluorescein水平和改善神经炎症和神经细胞通过调节物/ NF -死亡κB / Akt信号通路体内(成年大鼠海马)和体外(HT-22 / BV2细胞株)。此外,姜黄素显著改善LPS-induced记忆障碍的莫里斯水迷宫和Y-maze任务。综上所述,我们的研究结果表明,姜黄素可能是一个潜在的预防和治疗候选人LPS-induced ROS-mediated神经毒性和内存赤字在成年大鼠模型。

1。介绍

存在是一种保护机制,发生在大脑和损伤是主要的反应。如果长期神经炎症反应,然而,这可能导致神经功能障碍,最终导致神经元细胞凋亡和记忆障碍(1,2]。越来越多的证据表明,神经炎症引起的不良反应或干扰体内平衡的抗氧化剂在神经退行性疾病的发病机制中扮演着重要的角色,如帕金森病和阿尔茨海默病(AD) [3- - - - - -5]。活性氧(ROS)曾被认为是神经退行性疾病的有力调停者。他们已经被证明能够影响蛋白质、脂质、核酸、细胞功能障碍和神经细胞凋亡铺平了道路。证据表明,氧化应激鼓励像phosphorylated-c-Jun n端压力的活化激酶激酶1 (p-JNK),神经炎症和神经退行性变的一个重要中介。因此关键贡献者慢性氧化应激和神经炎症疾病的发展像广告2,6]。

几行调查已经表明,脂多糖(LPS)和其他有毒代理人如乙醇和d-galactose激活无数ROS-mediated神经炎症和凋亡信号通路,从而导致神经退化和记忆缺陷(7- - - - - -9]。有限合伙人是一个触发神经炎症的细菌内毒素和用作inflammagen在各种动物模型研究评估炎症之间的交互,大脑功能和记忆障碍。众所周知,有限合伙人治疗导致增加活性氧的生成和细胞因子的生产,最终导致神经细胞死亡和记忆障碍(1,10,11]。各种机制已进行过研究并提出了LPS-induced神经元损伤,最完善的是增加活性氧的生成,随后增加氧化应激和神经损伤。此外,ROS升高可以激活其他介质如κB (p-NF - phosphorylated-nuclear因素κB),肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β),影响海马神经元细胞的功能通过神经元细胞凋亡和随后导致记忆障碍。此外,根据最近的研究,LPS腹腔内可以激活星形胶质细胞和小胶质细胞,分别诱导astrogliosis和microgliosis的过程。活化的星形胶质细胞和小胶质细胞诱发神经毒性,神经炎症,通过刺激促炎介质(ROS的产生7,12- - - - - -16]。Badshah等人证明了有限合伙人的系统性管理在250剂量的成年老鼠μ1克/公斤week-induced神经细胞死亡通过增加caspase-3的表达和聚[ADP-ribose]聚合酶1 (PARP-1),触发线粒体凋亡通路(1]。

几种抗氧化剂对氧化效果著称stress-mediated神经细胞死亡和记忆障碍。其中大部分已报告穿过血脑屏障,减少各种有毒的有害影响分子氧和氮自由基等脑细胞。天然多酚类化合物的来源包括植物、蔬菜、水果、绿茶、橄榄油和红酒17,18]。虽然没有目前预防性治疗,研究神经退行性疾病已经表明,改变生活方式,每天锻炼,摄入天然多酚补充剂可以帮助预防这些疾病。姜黄素,从姜黄的根茎植物,是一种天然的黄色化合物几个世纪以来一直用于治疗神经病理障碍是因为它的抗氧化和消炎作用。姜黄素不仅作为自由基清除剂,还可以提高学习和记忆的赤字。涉及姜黄素的研究报道,神经保护作用,它已被证明,以抵消广告,抑郁症和癫痫(19- - - - - -21]。此外,姜黄素也被证明有保护作用在其他疾病如癌症、胰腺炎、风湿性关节炎、肝脏疾病、肺功能障碍(22,23]。此外,姜黄素可以保护大脑免受有限合伙人毒性通过抑制一氧化氮(NO)的生产,前列腺素E2 (PGE2)、活性氧、促炎细胞因子(24- - - - - -26]。

尽管众所周知,姜黄素抗炎和神经保护属性,存在小证据对其确切的潜在的作用机制,尤其是ROS-mediated神经炎症的情况下,神经衰弱,记忆障碍。因此,我们进行了本研究探讨姜黄素对LPS-induced海马小胶质激活的影响,神经炎症,神经衰弱,记忆障碍。我们的结果证实姜黄素不仅具有强大的抗氧化,抗炎,和凋亡特性而且预防LPS-induced ROS-mediated神经炎症,神经衰弱,记忆障碍。我们的研究结果进一步证实了天然化合物如姜黄素可能被用作替代合成和半合成药物治疗神经退行性疾病。

2。材料和方法

2.1。化学物质

2,有限合伙人7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA)、二甲亚砜(DMSO)和物抑制剂(SP600125)实验中使用的所有从Sigma-Aldrich购买化学有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。动物

男性Sprague-Dawley老鼠体重250 - 300克从Samtako购买生物(乌山、韩国)。所有的动物都在大学动物屋12/12 h光明与黑暗周期在室温和湿度实验开始前一周允许适应新环境。动物被允许随意。老鼠谨慎处理根据提供的指导方针动物伦理委员会的国立大学,韩国(批准ID: 125)。

2.3。实验动物的分组和治疗

动物随机分为以下三组( 对于每一个):(我)控制(续)组:注射生理盐水1星期(2)LPS-treated组:腹腔内注射LPS溶解在250年剂量的生理盐水1周μ克/公斤/天,先前报道(1](3)有限合伙人+ curcumin-treated组:注射LPS如上和姜黄素(300毫克/公斤/天,14天,报道(3])有限合伙人之前和之后7天治疗

姜黄素在DMSO溶液溶解,最后使用生理盐水注射成交准备。有限合伙人是溶解在同样体积的生理盐水用于姜黄素。

2.4。体内活性氧测定

测定海马内ROS水平( 每组),我们执行活性氧测定。如前所述(执行这个分析12),是基于DCFH-DA 2的变更,7-dichlorofluorescein (DCF)。海马的短暂、脑匀浆稀释与锁的缓冲区1:20比例,最后的浓度是每500人2.5毫克组织调整μl。反应混合物由锁的缓冲区(pH值7.4)、脑匀浆从海马组织(0.2μl)和DCFH-DA (10μl, 5毫米)。的混合物被覆盖和孵化在室温下15分钟。孵化后,荧光光纤产品被标仪测量(激发在484 nm,排放在530海里)。使用一个空白的平行评估背景信号。结果表示为pmol DCF /分钟/毫克的蛋白质在形成组织匀浆。

2.5。体外ROS化验

同样的程序使用体内被用于量化BV2 ROS的小胶质细胞。体外ROS分析也是根据对话DCFH-DA贴现。中使用的小胶质细胞BV2体外研究请提供作为礼物。w . Choi博士(Inje大学、韩国釜山)。的BV2小胶质细胞被播种在75厘米²Nunc™EasYFlask™与Nunclon™三角洲表面(热费希尔科学、Nunc / S,鲁开德那样,丹麦)包含杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)(生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)补充10%胎牛血清(抗生素的边后卫)和1% (penicillin-streptomycin) 37°C调湿空气中含有5%的股份有限公司₂。细胞生长,计算,进一步亚文化在35毫米培养皿(热费希尔科学、Nunc / S,鲁开德那样,丹麦)在DMEM补充10%的边后卫和1%的抗生素(penicillin-streptomycin) 37°C调湿空气中含有5%的股份有限公司₂。当细胞融合达到70 - 80%,他们对待有限合伙人(1μg / ml)此前报道(1),有限合伙人(1μg / ml) +姜黄素(100μg / ml)此前报道(6,有限合伙人+ SP600125 (20μ米)报道之前(724小时。ROS分析,细胞暴露在DCFH-DA (50μ在37°C M) 30分钟。ROS-positive细胞测定吸光度的484/530 nm。

2.6。体内脂质过氧化(法律流程外包)测定

评估氧化应激,我们执行法律流程外包试验。法律流程外包分析工具包(中科院4091-99-0,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国)是用于评估水平的自由丙二醛(MDA)大鼠海马组织,正如前面执行的(12]。法律流程外包试验是按照制造商的指示执行。总之,海马组织均质在300年冰μl MDA裂解缓冲的3μl二叔丁基对甲酚和离心机(13000×g, 10分钟)。总共10毫克的蛋白质被均质化沉淀150年样本μl dH2O + 3μ二叔丁基对甲酚,添加1卷2 N高氯酸,顶点,然后离心法去除沉淀蛋白。最后一卷(200μl)的上层清液从每个样本然后引入一个96孔板,和吸光度测量使用微型板块读者在532海里。总MDA内容表示为nmol /毫克的蛋白质在组织匀浆。

2.7。体外法律外包分析

法律流程外包分析也用于评估BV2细胞氧化应激使用法律外包分析工具包(BioVision、旧金山、钙、美国;猫# 739 - 100)。BV2细胞生长和治疗以同样的方式如前所述在体外活性氧测定的方法。法律流程外包分析如上所述的体内实验。

2.8。蛋白质的提取

当体内治疗完成后,所有的动物都牺牲了麻醉,大脑很仔细删除以避免任何损害。仔细分离海马组织,保存在液氮中,并存储在-80°C进一步生化实验工作。在需要时,海马组织幼儿学前萃取溶液中均质(内含生物技术公司,国军,韩国)和离心机在13000 rpm在4°C 25分钟。均质化后,上层的收集和储存在−80°C。

2.9。定量分析的蛋白质免疫印迹

西方墨点法之前,光密度(OD)的蛋白质进行了分析使用Bio-Rad蛋白质分析工具包(Bio-Rad实验室、CA、美国),如前所述[14]。等量的蛋白质,约20 - 30μg,用于使用4 - 12%螺栓™迷你凝胶电泳(生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)。蛋白质被转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜(Sigma-Aldrich化工有限公司)。膜处理5%脱脂牛奶(/为90分钟),用TBST(3次,每10分钟),和治疗原发性抗体(anti-caspase-3 anti-TNF -α,anti-IL-1β、anti-p-JNK anti-p-NF -κB65 anti-Bcl-2-associated X蛋白(伯灵顿),anti-B-cell淋巴瘤2 (bcl - 2), anti-cytochrome c (Cyt c), anti-PARP-1 anti-phosphorylated-glycogen合成酶激酶3 (p-GSK3β)(Ser 9) anti-phosphorylated蛋白激酶B (p-Akt) (Ser 473), anti-synaptosomal相关蛋白质25 (SNAP-25) anti-postsynaptic密度蛋白95 (PSD95)和反β肌动蛋白,从圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国)一夜之间在4°C,紧随其后的是辣根peroxidase-conjugated二级抗体1 h。膜是用TBST(3次,每10分钟),处理化学发光系统(阿公司日本东京),和蛋白质x射线胶片乐队被检测到。乐队的蛋白质分析ImageJ软件(版本1.50,国家卫生研究院,https://imagej.nih.gov/ij/美国,马里兰州贝塞斯达)是用来量化集成密度。

2.10。形态分析和样品制备

当药物治疗和行为研究完成后,这些动物包括transcardially冰冷的4%多聚甲醛,如前所述[7,12]。简而言之,大脑在4%多聚甲醛固定72 h,然后转移到20%蔗糖和存储72 h。这后,大脑是用新鲜的PBS和立即冻结在O.C.T.化合物(樱花Finetek美国公司,托兰斯,CA,美国)。在凝固的块,14μ海马体的m日冕部分被剪掉了使用厘米3050 c低温恒温器(德国徕卡)。的部分被thaw-mounted ProbeOn加上™带电幻灯片(热费希尔科学、Nunc / S,鲁开德那样,丹麦)。

2.11。免疫荧光染色

免疫荧光染色后执行先前描述的协议(12,14]。一夜之间,总之,脑组织幻灯片被干,洗两次与PBS为10分钟(0.01米),和阻塞阻止血清(2%正常山羊血清和0.3% Triton x - 100在PBS) 1小时。幻灯片被孵化与上述主要抗体(圣克鲁斯生物技术)在一夜之间在4°C。第二天,幻灯片处理二级TRITC / FITC-labelled抗体(1100)(圣克鲁斯生物技术)2 h。幻灯片与PBS洗5分钟(两次)和安装4 ,6 - - - - - -diamidino-2-phenylindole (DAPI)和延长不变色试剂(分子探针,尤金,或者美国)。最后,彩色幻灯片是共焦激光扫描FluoView艘1000迈普显微镜下检查(奥林巴斯、东京、日本)。

2.12。Fluoro-Jade B (FJB)染色

一夜之间,短暂,组织幻灯片被干干燥室,洗两次与PBS(0.01米)为5分钟。幻灯片被浸泡在一个解决方案包含1%氢氧化钠和80%乙醇为5分钟。然后幻灯片保存在70%酒精,保持蒸馏水为2分钟。后,组织对待解决方案包含0.1%醋酸和0.06% FJB 20分钟。幻灯片是清洗和晾干10分钟,安装与DPX安装介质,和盖玻片。幻灯片是共焦激光扫描FluoView艘1000迈普显微镜下检查(奥林巴斯、东京、日本)和图像。ImageJ软件结果进行分析,量化的immunohistofluorescence和FJB图像进行根据我们最近出版协议(7]。

2.13。TUNEL染色

TUNEL末端转移酶- (TdT)介导的dUTP缺口末端标记)染色法用于检测死亡神经元和神经细胞凋亡的程度进行评估。这个试验中使用的工具从Sigma-Aldrich购买化工有限公司(猫。11684809910号,圣路易斯,密苏里州,美国),和染色进行根据制造商的建议。

2.14。苏木精和伊红染色())

他走时染色用于分析细胞形态。总之,从每一组幻灯片( )第一次浸自来水在短时间内和转移到染色的解决方案。幻灯片被转移到苏木精解8 - 10分钟。接下来,双方用自来水洗10 - 15分钟,转移到伊红30秒的解决方案。接下来的幻灯片被脱水的分级系列酒。最后,所有的幻灯片都安装安装介质(美国马热费希尔科学)和盖玻片。幻灯片的图像被使用一个简单的显微镜。

2.15。甲苯基紫染色

甲苯基紫/尼氏小染色用于检查和测定神经细胞死亡。首先,幻灯片组成14μm大脑部分与PBS洗15分钟(0.01米),沾染了甲酚紫溶液(0.5%)包含几滴冰醋酸为10 - 15分钟。幻灯片是用蒸馏水洗净,与一系列分级的酒精脱水(70、95和100%),保留在二甲苯;nonfluorescent安装介质,和盖玻片。图像被使用荧光显微镜和免疫组织化学的量化图像。

2.16。莫里斯水迷宫(微波加工)和Y-Maze测试

行为研究,进行了微波加工测试大鼠( /组),如前所述12]。微波加工由一个圆形罐(100厘米,直径40厘米高)包含水( )15.5厘米的深度。白色墨水被加入到水让它看起来不透明。透明的逃生平台(直径10厘米,高14.4厘米)保持在一个象限的中点,隐藏1厘米在水位以下。老鼠训练5天前开始研究使用一个隐藏的平台在一个象限三象限旋转开始。逃避延迟(时间寻找和定位隐藏的平台)计算每一个审判。24小时后5^th天,一个探头检测评估进行记忆的巩固。平台了,老鼠被允许自由游泳,持续60秒。然后,在目标象限的时间长度和老鼠的次数跨越平台的位置(平台仍然隐藏在培训期间)记录。所花费的总时间,一只老鼠在目标象限被认为是衡量记忆巩固的程度。智能电视软件(Panlab哈佛装置Holliston,妈,美国)被用来记录大鼠的运动。Y-maze测试执行与必要的更改(如前所述14]。

2.17。体外细胞培养和免疫印迹和共焦显微镜治疗

HT-22神经元细胞用于体外研究提供的请教授Koh(国立大学、韩国)。HT-22细胞在DMEM补充被播种10%胎牛血清(的边后卫)和1%的抗生素在湿润有限公司5%₂孵化器在37°C。HT-22细胞与有限合伙人(1孵化μ有限合伙人(1 g / ml)μg / ml) +坏蛋(100μg / ml)和有限合伙人(1μg / ml) + SP600125 (20μ米)24 h。

2.18。统计分析

差异控制,分析了有限合伙人和有限合伙人+姜黄素组使用单向方差分析(方差分析)和学生的 - - - - - -测试。所有数据都表示为 三个独立的实验,分析了使用GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。在体内研究中,符号表示控制之间的显著差异和LPS组和Ώ符号代表一个有限合伙人和姜黄素组之间的显著差异。同样,在体外研究中,符号表示控制和LPS组之间存在显著差异,Ώ符号代表一个有限合伙人之间的显著差异和姜黄素组,和#符号代表一个有限合伙人之间的显著差异和物抑制剂SP600125组。

3所示。结果

3.1。姜黄素LPS-Induced增加活性氧生成,改善氧化应激,P-JNK水平在成年大鼠海马和LPS-Treated BV2细胞

最近,它已经表明,姜黄素具有较强的抗氧化性能,可以减少ROS的负担。也是众所周知,物是一个至关重要的高度表示压力激酶和增加细胞内ROS生成(7,20.]。因此,我们通过免疫印迹分析p-JNK的表达,共焦显微镜和免疫组织化学。我们的研究结果表明,有限合伙人治疗显著增加p-JNK在成年大鼠海马的表达。另一方面,使用300毫克/公斤/ i.p进行治疗。姜黄素2周显著降低p-JNK的表达,提供证据表明,姜黄素具有很强的抗氧化功能属性(数据1 (f),1 (g),1 (j))。此外,调查如果姜黄素能抑制p-JNK激活物抑制剂SP600125以类似的方式,我们暴露BV2小胶质细胞为1μg / ml有限合伙人,100年μ20 g / ml姜黄素,μM SP600125。体外免疫印迹和共焦显微镜检查结果证实,LPS处理显著增加p-JNK BV2细胞的表达。姜黄素显著降低增加类似于SP600125治疗(数据1 (h)和1(我))。使用动物模型的研究表明LPS处理诱导活性氧的生成(21- - - - - -23]。因此我们对老鼠进行了ROS和法律事务外包化验使用生理盐水治疗,有限合伙人和有限合伙人+姜黄素。我们发现治疗有限合伙人增强活性氧生成和氧化应激在成年大鼠的海马,和姜黄素这两种改善LPS + curcumin-treated集团(数字1 (b)和1 (c))。我们进一步研究了姜黄素能否减少ROS生成和氧化应激在类似的方式通过执行ROS和法律事务外包化验SP600125 BV2细胞系。体外结果表明LPS处理显著增加DCF和MDA的水平(ROS和氧化应激的标记)的BV2细胞。姜黄素治疗显著降低DCF和MDA的水平以类似的方式的物抑制剂SP600125(数字1 (d)和1 (e)。

3.2。姜黄素减毒LPS-Induced P-Akt / P-GSK3促炎细胞因子的生产和恢复β生存的途径

最近的研究表明,有限合伙人治疗诱导小胶质细胞因子激活和生产在体内和体外都扮演重要的角色在neuroinflammation-induced神经退行性疾病。此外,姜黄素的抑制作用在促炎细胞因子的释放是有据可查的24,25]。因此,为了确定姜黄素对LPS-induced神经炎症的抑制作用在成年老鼠,我们评估p-NF——的表达κ转录因子B (), TNF -α和il - 1β(促炎细胞因子)和GFAP和Iba1(反应小胶质细胞和星形胶质细胞的标记)通过免疫印迹。我们发现LPS处理显著增加p-NF——的表达κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β、GFAP和Iba1。姜黄素治疗抑制p-NF——超表达κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β、GFAP和Iba-1 LPS-treated成年老鼠的海马组织(图2(一个))。共焦显微镜也显示增加p-NF——的免疫反应性κB和肿瘤坏死因子-α在LPS-treated成年大鼠的海马。姜黄素治疗显著降低TNF的免疫反应性α和p-NF -κB,这表明它可以防止细胞因子生产LPS-treated老鼠(数字2 (b)和2 (c))。调查如果通过JNK-dependent姜黄素可以防止神经炎症机制,我们暴露BV2小胶质细胞的剂量LPS 1μg / ml 24 h。我们发现姜黄素(100μg / ml)和物抑制剂SP600125 (20μ米)同样的减毒LPS-induced促炎细胞因子水平升高,提供证据表明,姜黄素可抑制细胞因子通过JNK-dependent机制(数据生产2 (d)- - - - - -2 (g))。

越来越多的研究报道,LPS处理抑制了一种蛋白激酶的磷酸化和GSK3 -β在大鼠帕金森病模型26]。免疫印迹和immunofluorescent结果表明,有限合伙人处理破坏了生存途径,证明了降低表达一种蛋白激酶的磷酸化和GSK3 -β蛋白质相比saline-treated成年老鼠。姜黄素治疗的剂量300毫克/公斤/天不仅恢复了这个生存通路也显著增加p-Akt和p-GSK3水平β在成年大鼠海马(数字2 (h)- - - - - -2 (j))。

3.3。姜黄素减轻LPS-Induced神经元细胞凋亡和神经退行性变的成年大鼠海马和HT-22神经元细胞

最近,兴趣都集中在LPS-induced ROS-mediated neuroinflammation-associated退化。Badshah等人表明,有限合伙人可以诱导神经细胞凋亡增加凋亡标记的表达caspase-3和PARP-1 [1]。其他研究也表明,LPS诱导长期神经炎症反应通过激活小胶质细胞,随后启动线粒体凋亡通路和神经细胞死亡27- - - - - -29日]。在目前的研究中,我们验证了姜黄素的抗凋亡特性对LPS-induced neuroinflammation-associated退化。我们的免疫印迹和免疫荧光结果表明,有限合伙人在250剂量μ克/公斤7天凋亡蛋白的表达增加伯灵顿,caspase-3, Cyt c, PARP-1和减少凋亡蛋白bcl - 2的表达在成年大鼠海马。姜黄素治疗的剂量300毫克/公斤14天显著减少这些凋亡标记和抑制神经细胞凋亡(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。

在文献中存在大量证据的曝光HT-22 LPS-induced损伤细胞。霁等人报道,刺激海马HT-22与LPS显著调节神经细胞凋亡的表达标记伯灵顿和caspase-3和bcl - 2表达下调抗凋亡蛋白的表达30.]。同样,在目前的研究中,我们对待HT-22神经元细胞与有限合伙人以评估JNK-dependent和炎症反应的神经元凋亡。免疫印迹和共焦结果表明,有限合伙人治疗剂量的1μg / ml caspase-3的水平显著升高,Cyt c, PARP-1。100年姜黄素的剂量μg / ml的剂量和物抑制剂SP600125 20μ明显减少了表达式(数据3 (e)- - - - - -3 (g))。

此外,确定LPS-induced退化的程度,我们执行FJB, TUNEL和尼氏小染色。我们发现LPS处理FJB-positive细胞的数量增加成年老鼠的海马。然而,用姜黄素治疗FJB-positive细胞的数量减少和抑制神经细胞死亡(图3 (h))。接下来,尼氏小染色结果表明,有限合伙人的剂量治疗7天250μ克/公斤的数量显著减少可行的神经元。姜黄素治疗14天的剂量300毫克/公斤阻止神经元细胞凋亡和非常可行的神经元的数量增加(图3(左))。TUNEL结果分析还表明,有限合伙人死亡神经元的数量增加。姜黄素显著提高细胞生存的影响神经元和改善神经退化(图3(我))。确定有限合伙人对细胞形态的影响,我们进行了圆)染色。结果表明,有限合伙人治疗细胞特异表达形态,证明了神经细胞萎缩的外观。姜黄素治疗恢复细胞形态和提高细胞生存(图3 (k))。

3.4。姜黄素的表达增加预处理和突触后蛋白质标记和拯救与内存相关的赤字在成年大鼠模型的有限合伙人的挑战

最近的一项研究表明,神经炎症和神经退行性变的回应ROS可能导致突触赤字和记忆障碍(31日,32]。分析姜黄素对LPS-induced突触变性的影响,我们研究了表达水平的蛋白质SNAP25突触前和突触后蛋白质PSD95通过免疫印迹和共焦显微镜。结果表明,有限合伙人治疗,由于其毒性作用,减少的表达SNAP25和PSD95相比控制和curcumin-treated组(数字4(一)- - - - - -4 (c))。此外,评估记忆时,我们进行了微波加工和Y-maze测试。LPS-treated老鼠表现出增加延迟时间,表明学习和记忆的赤字。相反,减少等待时间,表明记忆的改进,也体现在curcumin-treated组(图中4 (d))。探针测试也进行了5^th一天中被隐藏的平台。LPS-treated老鼠表现出更少的平台过境点,减少了时间的长度在目标象限。姜黄素治疗增加平台过境点的数量和时间的长度在目标象限(数字4 (e)和4 (f))。接下来,我们进行了Y-maze测试调查空间工作记忆通过评估自发交替百分比。我们发现LPS-treated老鼠表现出变更比例低于saline-treated老鼠,表示可怜的工作记忆。姜黄素显著增加变更比例在LPS-challenged老鼠,表明姜黄素可以改善记忆障碍(图4 (g))。

4所示。讨论

本研究的目的是评估潜在的抗氧化剂的神经保护机制中姜黄素的膳食多酚化合物LPS-treated成年老鼠通过调节物/ NF -κB / Akt信号通路。几项研究已经表明,有限合伙人触发ROS生成/氧化应激和激活压力激酶物,随后调解各种神经退行性疾病的发病机理(33,34]。同样,在我们的研究中,有限合伙人治疗升高活性氧生成和增强法律事务外包,证明了DCF和MDA水平增加和调节的表达p-JNK在成年大鼠的海马和HT-22 / BV2细胞。膳食补充姜黄素减少这些高浓度的活性氧/氧化应激和p-JNK。

许多研究报道,LPS诱导物激活介导神经炎症反应和有限合伙人已广泛应用于模型研究神经炎症。最近,其他研究已经表明,系统性管理LPS激活氧化应激和物启动下游神经炎症级联。大量的体内和体外研究提出,LPS引起microgliosis并激活许多信号通路包括激活NF -κB通过几个介质包括ROS /氧化应激和p-JNK,进而促进促炎细胞因子的释放,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β(4,35,36]。与早期的研究一致,我们的大鼠模型,有限合伙人挑战表现出Iba-1表达增加,GFAP p-NF -κB,肿瘤坏死因子-α,il - 1β。另一方面,我们的体内和体外研究结果表明,姜黄素治疗显著降低ROS / JNK-mediated增加NF -的表达式κB Iba-1 GFAP、TNF -α,il - 1β物抑制剂SP600125以类似的方式。

一些研究支持这样的观点:LPS-induced ROS / JNK-mediated神经炎症引起的神经细胞死亡,会使蛋白质如p-Akt / p-GSK3生存β通过microgliosis和促炎细胞因子的生产。关于神经炎症,建议几种机制参与促炎细胞因子的分泌星形胶质细胞和小胶质细胞。这样的机制之一是LPS-induced p-JNK通路功能之间的联系ROS /氧化应激和neuroinflammation-mediated凋亡神经退化(4,26,37,38]。众所周知,饮食预防ROS的姜黄素是一个强有力的候选人/氧化stress-mediated neuroinflammation-related神经退化(39]。另外,姜黄素可以抑制线粒体活动的障碍和抑制凋亡蛋白伯灵顿,caspase-3 Cyt c, PARP-1。姜黄素也上调抗凋亡蛋白bcl - 2的表达,从而防止线粒体内稳态的调节异常28,40- - - - - -42]。在这里,我们的结果也表明,姜黄素治疗显著抑制在成年大鼠海马神经元细胞凋亡,通过抑制神经炎症调控的蛋白质p-Akt和p-GSK生存β,减少凋亡蛋白质标记。此外,许多研究表明暴露HT-22神经元细胞LPS激活细胞死亡途径和线粒体功能障碍(30.]。同样,在目前的研究中,我们观察到,姜黄素治疗预防通过JNK-dependent神经元凋亡机制LPS-treated HT-22神经元细胞。为了进一步探索姜黄素的神经保护作用,我们执行TUNEL FJB,尼氏小、圆)染色。我们的研究结果表明,在成年大鼠海马,TUNEL和FJB-positive神经元细胞的数量明显减少在LPS-treated集团,而可行的神经元尼氏小试验是大大增加姜黄素治疗。此外,与先前的研究一致,我们的研究结果表明,姜黄素治疗恢复支离破碎和神经细胞萎缩)免疫组织化学。

在动物模型的研究表明LPS诱导有害的生理反应,如慢性神经炎症,破坏线粒体功能,和变更的内稳态的抗氧化剂/氧化,进而导致记忆障碍(1,36,43,44]。多酚类化合物具有抗氧化特性,尤其是姜黄素,因此研究其有效性在减少氧化应激/ neuroinflammation-associated学习和记忆赤字(17,45,46]。这项研究的结果表明,姜黄素,一个强大的活性氧清除剂,改善记忆缺陷通过增加与内存相关蛋白的表达水平,用免疫印迹和共焦显微镜检测到。此外,姜黄素治疗显著降低延迟时间,提高平台过境点的数量,增加目标象限的时间的长度,和增强变更比例在莫里斯水迷宫和Y-maze任务。

5。结论

总之,我们获得了显著的数据潜在的抗氧化剂的膳食姜黄素在大鼠模型神经保护机制LPS-induced神经毒性。我们的研究结果表明,姜黄素调节物/ NF -κB / Akt信号通路,从而改善ROS生成,氧化应激,neuroinflammation-associated退化。姜黄素也改善了与预处理和突触后标记,以及认知功能,LPS-treated成年大鼠(图5)。综上所述,这些数据表明,膳食姜黄素作为一种强有力的抗氧化剂和抗炎剂,可能是有益的膳食补充剂预防氧化应激/ neuroinflammation-related神经障碍。

缩写

广告:	阿尔茨海默病
Cyt c:	细胞色素c
中枢神经系统:	中枢神经系统
DCFH-DA:	27-Dichlorodihydrofluorescein二乙酸
贴现:	27-Dichlorofluorescei
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
DAPI:	4 ,6 - - - - - -Diamidino-2-phenylindole
DG:	齿状回
DMSO溶液:	二甲亚砜
的边后卫:	胎牛血清
FITC:	异硫氰酸荧光素
FJB:	Fluoro-jade B
合:	辣根过氧化物酶
il - 1β:	Interleukin-1β
I.P。	腹腔内
法律流程外包:	脂质过氧化作用
有限合伙人:	脂多糖
MDA:	丙二醛
P-JNK:	Phospho-c-Jun n端激酶1
微波加工:	莫里斯水迷宫
PARP-1:	保利(ADP-ribose) polymerase-1
帕金森病:	帕金森病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

动物维护、治疗、行为研究和手术进行了按照动物伦理委员会(IACUC)应用生命科学部门发布的指导方针,在国立大学生物学系,韩国。实验方法进行了依法批准指南(批准ID: 125),和所有动物伦理委员会批准的实验协议(IACUC)应用生命科学部门,国立大学生物学系,韩国。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

穆罕默德Sohail汗是第一作者实验设计和管理工作,并写了手稿。Tahir穆罕默德是第二作者进行免疫印迹分析和其他技术安排。Myeong好金是相应的作者进行审核和批准的手稿,手稿相关的所有责任。

确认

这项研究受到了大脑研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部,ICT和未来规划(2016 m3c7a1904391)。

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