文摘

溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性疾病控制炎症和氧化应激和特点是高复发,复发风险。作为后起之秀在气体医学,甲烷拥有属性的抗炎、抗氧化、antiapoptosis。基于可能的机制,我们旨在调查加州大学甲烷的影响。介绍了富含甲烷的盐水(夫人),加州大学被醋酸诱导。C57BL / 6小鼠被分配到组:对照组,结肠炎模型组,结肠炎治疗salazosulfapyridine SASP组,夫人和结肠炎治疗(1或10毫升/公斤)组。组织损伤,炎症的程度、氧化应激、细胞凋亡和评估研究中,以及TLR4 / NF -κB / MAPK和il - 10 / JAK1 / STAT3信号通路为进一步勘探的潜在机制。结果表明,(1)缓解夫人醋酸造成的组织损伤,(2)乙酸段炎症控制,(3)抑制乙酸酸氧化应激,(4)结肠细胞凋亡减少由于醋酸,(5)抑制地/ NF -κB / MAPK信号通路,il - 10(6)激活/ JAK1 / STAT3抗炎反应提高醋酸引起的损伤。我们得出结论,夫人对醋酸有保护作用段通过阻断小鼠溃疡性结肠炎TLR4 / NF -κB / MAPK信号通路,促进il - 10 / JAK1 STAT3-mediated抗炎反应。

1。介绍

溃疡性结肠炎(UC),属于慢性非特异性炎症性肠病(IBD)家庭与免疫有关,是炎症的粘膜和subserosa结肠和直肠。加州大学的主要症状是腹泻、黏脓性的血便、腹痛、复发,复发。此外,加州大学将导致严重的并发症,如中毒性巨结肠和直肠癌的风险增加。这是表示,加州大学的患病率和发病率近年来逐步增加(1,2]。加州大学一直在呼吁越来越多的担忧,因为它的损害个人生活和工作能力。然而,加州大学的病因尚不清楚,考虑多个因素,其中环境因素,遗传因素,微生物因素获得了广泛的认可。

炎症和氧化应激反应被认为在加州大学的病理生理过程中起着关键作用。刺激从外部或内部诱导激活的炎症,导致的氧化应激和加重炎症细胞(3]。与促炎的特点,产品氧化应激导致破坏细胞结构的脂质过氧化反应,最终导致cellapoptosis和坏死(4]。死细胞成为新的刺激,开始恶性循环。重要的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素- 6 (il - 6)已经应用于目标加州大学(5]。然而,感染和恶性肿瘤的风险增加引起的免疫抑制不容忽视。此外,它已经表明,核转录因子κB (NF -κB)和增殖蛋白激酶(MAPK)途径是活跃在炎症反应通过帮助炎性细胞因子的功能。针对TLR4 / NF -κB / MAPK信号通路可能是另一种方法来治疗炎性疾病(6]。与此同时,il - 10,研究抗炎细胞因子之一,也是导致结肠炎的进步。il - 10 / JAK1 / STAT3-mediated抗炎反应是一个重要的负面调节器,控制炎症的程度和持续时间7]。一直在努力探索潜在的治疗UC患者,在此,我们想关注一个新颖的方法,甲烷。

最简单的烷烃,甲烷(CH₄)被认为是无用的人类就是几十年,直到研究人员最近透露其生理行为。先前的报道提供了证据的甲烷来改善缺血再灌注损伤、脓毒症、急性肺损伤、自身免疫性肝炎,获得积极的结果甚至在糖尿病性视网膜病变(8- - - - - -13]。antiapoptosis研究者发现,抗炎,抗氧化甲烷的性质使它成为一个保护者在这些疾病14]。一般来说,富含甲烷的甲烷被吸入或注射生理盐水(夫人)。考虑甲烷气体爆炸的风险,一些研究人员更喜欢后者。然而,很少有人注意到甲烷在加州大学的生物功能。因此,我们旨在探讨疗效的夫人在加州大学学习。

2。材料和方法

2.1。动物和夫人准备

四到有没有野生型雄性C57BL / 6小鼠(21 - 25日g)买来的动物饲养中心西安交通大学健康科学中心。在实验之前,所有的动物都在受控的情况下五个老鼠共用一个房间最多12 h光/暗周期,固定温度 ,和50%的湿度。提供标准的食品和自来水,动物保健原则是减少小鼠的不适。所有动物实验遵守的指导方针,中国动物保健和使用委员会。喂养动物的所有程序和处理的研究进行了综述,批准和监督的机构伦理委员会的动物保健和使用委员会西安交通大学健康科学中心,中国。

甲烷溶解在密封的生理盐水,并经历了高压(0.4 MPa) 8个小时生产准备保留使用铝袋夫人太太在4°C和消毒γ辐射前一天的利用率。使用气相色谱法检测,夫人的浓度和甲烷的浓度是1.2 - -1.5更易与夫人/ l。

2.2。实验设计

的小鼠随机分为5组,每组6个动物。1组(对照组)和2 (AA组)使用0.9%生理盐水的剂量50毫升/公斤。在3组(AA + SASP组),给出的老鼠SASP剂量500毫克/公斤。组4夫人(AA + 1组)和5 (AA + 10)夫人收到了预处理与夫人在1或10毫升/公斤,分别。所有的药品都由胃强饲法一天一次。在第八天,老鼠从组2到5受到结肠炎感应,而组1收到一个类似的过程,同等体积的生理盐水。动物牺牲了异氟烷吸入24 h后(5%)。随后,血液和组织样本收集。

2.3。结肠炎感应

经典的方法来诱导结肠炎(15]。老鼠被乙醚麻醉禁食后24 h。接下来,一个灵活的导管(3.5 F)插入到结肠的离肛门约3厘米。醋酸溶液诱导加州大学负责被注入腔结肠intrarectally 1毫升的体积和剂量的5%。接下来,老鼠保存在一个仰卧的仰卧灌输的30年代,以防止泄漏的解决方案。老鼠从使用0.9%生理盐水组1获得同样的待遇。

2.4。组织损伤的评估宏观上

疾病活动指数(DAI)计算并由三个参数,即减肥,凳子上的一致性,直肠出血。评估标准(16减肥(0,没有;1、减少1 - 5%;2、减少5 - 10%;3、减少11 - 15%;4、减少超过15%),粪便一致性(0,正常;2、便溏;4、腹泻),直肠出血(0,正常;2、轻度出血;4、严重出血)。在某一天,体重与最初的一天。 The sum of all the grades was evaluated for each animal daily. Additionally, the ulcer area was recorded, and the ulcer index (UI) for each colon sample was calculated as follows: (17]。的长度和重量测量回盲肠的结之间的结肠和直肠,和长度/重量比是评价,以及脾脏重量。

2.5。显微损伤的评估

评估组织学变化,结肠组织收集并固定在10%福尔马林溶液。接下来,在石蜡样本嵌入,连续5μ米厚的部分被苏木精和伊红染色。显微损伤的评估将分级系统称为前面描述的(18):(1)粘膜结构的损失(0 - 3)、(2)浸润的白细胞(0 - 3)、(3)肌肉增厚(0 - 3)、(4)形成的隐窝脓肿(0 - 3)和(5)损失的杯状细胞(0 - 3)。最高得分是15。每个幻灯片被调查人员在显微镜下检查那些盲目治疗。

2.6。生化试验

2.6.1。炎症参数

收集血液样本测量肿瘤坏死因子的水平α和il - 6使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(阎连科,杭州,中国)根据制造商的指示。

总RNA分离从结肠标本使用RNAfast200工具包(Fastagen生物科技、上海、中国)。使用PrimeScript RT执行反转录试剂盒(豆类生物技术,大连,中国)。信使rna表达化验一式三份和归一化到18 s mRNA的表达。使用比较Ct方法的相对水平计算(ΔΔCt方法)。研究肿瘤坏死因子-使用的引物α(前5 - - - - - -亚美大陆煤层气有限公司有条件现金援助GTA GCC CAC GTC GTA-3和反向5 - - - - - -gg TAC AAC CCA TCG GCT GG-3 ),il - 6(前5 - - - - - -太极拳ATC CAG TTG有条件现金援助TCT TG-3和反向5 - - - - - -TTC CAC手枪TTC CCA GAG AAC-3 ),il - 1β(前5 - - - - - -GGA广汽TTC ACA GAG手枪AC-3和反向5 - - - - - -猫CCA TC-3 CCA GTT TGG标签 ),il - 10(前5 - - - - - -GCT CTT广汽TGG猫GAG-3行动和反向5 - - - - - -公司治理文化AGC TCT gg AGC ATG TG-3 ),和18岁(5 - - - - - -AAA CGG CTA CCA猫CCA AG-3和反向5 - - - - - -有条件现金援助CCA ATG手枪有条件现金转移支付资本利得税TA-3 )。

2.6.2。氧化压力参数

结肠部分被收集和均质。在5000转离心后30分钟在4°C,上层清液的分离是调查常见的氧化应激标志物包括丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽转移酶(谷胱甘肽)通过活动分析工具(南京建成生物工程研究所、南京、中国)后,制造商的协议。

2.7。评价细胞凋亡

终端原位缺口末端标记(TUNEL)细胞凋亡测定结肠进行幻灯片(4μ米厚度)嵌入的石蜡。蓝出现在4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)标志着核,绿色代表凋亡细胞。结果荧光显微镜观察到的发射波长530 nm和480 nm的激发波长,之后ImageJ2x软件被用来确定荧光强度。

2.8。免疫印迹分析

结肠癌样本收获和均质radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲。BCA蛋白质测定蛋白质含量进行检测。蛋白质样品分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,在那里他们被封锁10%脱脂牛奶1 h和随后沾特定主要抗体的toll样受体4 (TLR4),骨髓分化主要响应蛋白88 (MyD88), p38和磷酸化p38 (p-p38),细胞外signal-regulated激酶(ERK)和磷酸化ERK (p-ERK) c-Jun n端激酶(物)和磷酸化物(p-JNK),核因子κB p65亚基(NF -κp65)和磷酸化NF - BκB p65 (p-NF -κB p65)、il - 10、Janus激酶1 (JAK1)和磷酸化JAK1和信号转导和转录激活3和磷酸化STAT3 (Proteintech Group Inc .)、中国;北京生物合成生物技术有限公司,中国)一夜之间在4°C。接下来,PBS的膜清洗三次。与辣根过氧化物酶染色后,(合)共轭二次抗体,这些墨迹再次洗和可视化的化学发光(ECL)。蛋白质含量的统计数据生成使用ImageJ软件标准化的水平β肌动蛋白控制。

2.9。统计分析

所有的数据都被记录下来 偏差。,采用SPSS 18.0统计软件统计分析被执行死刑。组间显著差异被证实与单向方差分析,其次是费雪的LSD检验。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。夫人对组织损伤的影响醋酸段加州大学

3.1.1。脾脏重量

醋酸的常见表现之一段UC,脾脏肿大是重量计算的。我们发现小鼠结肠炎显示增加的脾脏重量与对照组相比,虽然SASP和夫人显著降低小鼠的脾脏重量(图1(一))。

3.1.2。疾病活动指数(DAI)

评估后的体重,凳子上的一致性,在每只动物和总直肠出血,我们获得了戴分数判断UC的症状严重程度(图1 (b))。我们发现傣族AA组得分显著高于其他组,表明SASP或夫人治疗可以减轻溃疡性结肠炎的症状。不同剂量之间的显著差异了夫人,夫人和老鼠戴显示一个更好的分数在治疗10毫升/公斤。

3.1.3。结肠重量/长度比例

结肠重量/长度比率计算评估结肠粘膜损伤的条件。增加的重量/长度比出现显著差异的动物从组AA与天真。SASP治疗和MRS-1 MRS-10显示显著减少结肠重量/长度比例如图1 (c)。然而,夫人的剂量显示显著降低10毫升/公斤体重/长度比率比1毫升/公斤。

3.1.4。溃疡面积和溃疡指数

溃疡面积和溃疡指数计算评估的严重性溃疡动物(数字1 (d)和1 (e))。小老鼠SASP治疗显示溃疡网站比未经处理的小鼠结肠炎,以及更小的溃疡指数。虽然显著降低溃疡面积显示1或10毫升/公斤的夫人,只有后者的剂量降低溃疡指数有显著差异。

3.1.5。夫人对乙酸段UC的组织学损伤

)染色法是利用评估动物组织学变化。我们观察到结肠炎在显微镜下细胞浸润,上皮破坏,充血、坏死与正常小鼠相比,如图1 (g)。SASP治疗和夫人在1或10毫升/公斤缓解上述炎症微观特征。同样,在评估微观得分(图1 (f)),我们发现,分数越高,被显示在AA组与对照组相比,显著减少小鼠结肠炎治疗时SASP夫妇(10毫升/公斤),表明10毫升/公斤的夫人比低剂量更有效。

3.2。夫人对炎性细胞因子水平的影响

肿瘤坏死因子-α和血清il - 6水平明显升高的刺激乙酸相比,那些虚假的组(图2)。治疗(10毫升/公斤)夫人,以及SASP治疗,引起显著的促炎细胞因子水平下降的价格相比对照组结肠炎。进一步研究细胞因子的状态在mRNA水平产生一致的结果,夫人(10毫升/公斤)的mRNA水平降低TNF -α和il - 6明显(数据3(一个)和3 (b))。此外,il - 1β信使rna折叠变化记录,显示一个明显的增加造成醋酸如图3 (c)夫人,而水平下降与SASP治疗10毫升/公斤。此外,作为抗炎细胞因子,il - 10被发现特别是在mRNA水平降低醋酸诱导(图3 (d))。当结肠炎小鼠接受SASP和夫人(10毫升/公斤),提高了抗炎状态通过增加mRNA水平的il - 10的价格相比AA组。

3.3。夫人对氧化应激水平的影响

MDA含量显示醋酸引起的脂质过氧化水平。MDA含量升高出现在AA组与对照组相比,明显减少了与SASP治疗和夫人如图4(一)。MPO活性也探讨中性粒细胞浸润的评估条件。图4 (b)表明,结肠炎动物的MPO活性显著高于天真的组。SASP治疗夫妇所有受影响的MPO活性的抑制。此外,内源性抗氧化剂SOD和谷胱甘肽的活动被发现,发现降低AA组与对照组相比(图4 (c)和4 (d))。此外,SASP夫妇(10毫升/公斤)提高SOD与谷胱甘肽的抑制活动一个重要的区别。

3.4。醋酸段UC的夫人对细胞凋亡的影响

我们探索的影响治疗结肠细胞凋亡在乙酸段夫人加州大学通过TUNEL染色。积极AA组表现出更强的荧光信号比天真的组,如图5。此外,样本与SASP治疗组或少夫人显示积极染色细胞。定量测定拍摄,结果显示结肠的凋亡率显著降低受到SASP治疗或夫人。

3.5。夫人对TLR4 / NF -的影响κB / MAPK信号通路

阐明在乙酸段夫人加州大学的潜在机制,西方墨点法进行探讨TLR4 / NF -κB / MAPKs信号通路的炎症反应。如图6,醋酸TLR4的表达水平和增加MyD88结肠组织中与对照组相比,由夫人明显逆转(10毫升/公斤)。的表达水平一致,我们发现p-NF -κB p65 p-JNK p-ERK, p-P38增强与醋酸但都显著抑制治疗夫人(10毫升/公斤)。

3.6。夫人对il - 10 / JAK1 STAT3-Mediated抗炎反应

夫人的影响的基础上,在转录水平是一个重要的抗炎细胞因子il - 10,我们检测il - 10的蛋白表达及其下游JAK1和STAT3通路分子。结果表明,乙酸不显著影响il - 10的表达水平和p-JAK1但可能增加p-STAT3表达式可能启动内源性保护。然而,夫人(10毫升/公斤)治疗可以显著增加il - 10的表达水平/ p-JAK1 p-STAT3(图7)。

4所示。讨论

在我们的研究中,我们研究了甲烷的影响生理盐水(夫人)结肠炎醋酸所致。结果如下:(1)在醋酸段UC减轻组织损伤,夫人夫人(2)控制炎症在乙酸段加州大学,(3)抑制氧化应激在乙酸结肠段夫人,夫人(4)减少细胞凋亡在乙酸段加州大学,(5)保护夫人通过地/ NF -乙酸段结肠炎κB / MAPKs信号通路,夫人(6)改善抗炎反应促进il - 10 / JAK1 / STAT3信号通路。因此,第一次,夫人的前景作为溃疡性结肠炎的治疗方法进行了讨论。

溃疡性结肠炎建立了醋酸在这项研究中,是一个经典的方法,被广泛用于模仿UC具有较高可操作性的病理生理的过程。评估夫人对结肠炎表现的影响时,我们发现脾脏重量,减少戴得分,结肠体重/长度比、溃疡面积,和索引。夫人一起积极的微观结果,显示它能够减轻醋酸引起的组织损伤。

这是证明,结肠炎与炎症密切相关(19]。半胱天冬酶级联的炎症是引起结肠炎和特征是炎症细胞释放细胞因子的招聘同时对抗刺激和损伤组织。在此,肿瘤坏死因子-α中扮演着重要的角色在触发一系列的生产化学介质,导致更大的炎症(20.]。此外,il - 6是一个关键分子导致结肠炎(中性粒细胞浸润和细胞凋亡21]。肿瘤坏死因子-α和血清il - 6水平升高结肠炎组像预期的那样,但在分子信使rna水平,减少了太太的降低TNF -α和il - 6 mRNA水平下夫人夫人的治疗建议的抗炎效果。il - 1的信使rna折叠β也发现由于其重要的角色在结肠炎的促炎细胞因子。此外,il - 1的信使rna折叠β减少了太太此外,il - 10的表达水平,一个著名的抗炎细胞因子,调节了原来夫人太太会抑制醋酸段结肠炎的炎症。

氧化应激是造成组织破坏另一个突出因素在加州大学(22]。活性氧和氮物种(ROS和RNS),产品的氧化应激,是罪魁祸首,促进脂质过氧化反应,导致负面影响膜组织和蛋白质和DNA碱基的结构(23]。MDA是一种最终产品从多不饱和脂肪酸的氧化,这是一种常见的标志除了MPO氧化应激。另一方面,SOD和谷胱甘肽作为抑制剂的氧自由基清除氧自由基(24]。因此,我们发现氧化剂和抗氧化剂的水平来评估在结肠炎小鼠氧化应激的程度。SOD与谷胱甘肽的水平被发现因醋酸表达下调,这一发现与调节的MDA和MPO水平是相一致的。结肠炎小鼠接受夫人时,SOD和谷胱甘肽是改善他们的活动和MDA和MPO水平降低。结果表明,演示了一个保护作用,当夫人在结肠炎小鼠氧化应激损伤。

结肠上皮细胞凋亡在醋酸段结肠炎符合一项研究[25]。细胞凋亡被认为是一种机制涉及结肠细胞的稳态和致病过程在炎症性肠病。在上皮细胞发生凋亡时,周围组织细胞吞噬细胞程序性死亡和附加填补缺失。一般来说,当地的防御是维护如果相邻组织细胞的数量和质量保证,或炎症激活一次不受控制的细胞凋亡导致粘膜完整性破坏和细菌的入侵。此外,过度的炎症也会导致正常组织细胞的损伤26]。它的起源是有争议的凋亡或炎症是否加州大学的病理生理过程。然而,细胞凋亡起着著名的加州大学,和TUNEL染色结果显示,夫人是有助于减少上皮细胞凋亡。

为了进一步调查夫人在结肠炎的机制,我们集中在TLR4-MyD88信号通路,负责炎性细胞因子和趋化因子的表达27]。当信号从TLR4转移到MyD88,招募IRAK4和TRAF6, IKK复杂将被激活,导致我的毁灭κ蛋白酶体的B。接下来,NF -κB p65单元允许把成核和促进生产的促炎细胞因子如TNF -α,il - 1β,il - 6 (28]。此外,其他重要的TLR4信号通路的免疫反应是由地图物等激酶ERK,和人们密切相关等炎症介质诱导一氧化氮合酶和环氧合酶(cox - 2)。这是表明TLR4识别细菌LPS抑制NF -和方法κB和MAPK信号通路可以改善LPS引起的炎症性损害(29日]。目前的研究表明,乙酸刺激炎症相关的通路显示调节TLR4的表达水平和MyD88和随后的下游分子包括NF -κB,物、ERK和p38。此外,当我们与夫人治疗结肠炎小鼠,组件的途径表达水平较低。因此,我们推测,可能产生一种保护作用在乙酸段夫人通过地/ NF -结肠炎κB / MAPK信号通路。

此外,我们发现夫人不仅可以减少促炎细胞因子的释放,而且可以提高抗炎能力通过il - 10的增加产量。事实上,其他一些研究显示,夫人会增加il - 10的生产在不同的疾病,如术后认知功能障碍,LPS-induced败血症,碳tetrachloride-induced肝损伤,慢性炎性疼痛(30.- - - - - -33]。il - 10 / JAK1 / STAT3证据确凿的信号通路,可以控制抗炎反应。乳杆菌GR-1上层清液能够提高il - 10的输出和激活JAK / STAT通路发挥抗炎财产lipopolysaccharide-stimulated胎盘滋养层细胞(34]。羧甲基壳聚糖可以减弱诱导一氧化氮合酶和预防骨关节炎il - 10 / JAK1 / STAT3通路(35]。il - 10的表达可以抑制促炎介质的表达如细胞表面受体,趋化因子和细胞因子。和STAT3的激活可能会刺激消炎作用的基因的表达,从而抑制促炎基因的表达(7]。先前的研究表明,可能促进上游PI3K / Akt / GSK-3夫人β介导的il - 10表达(31日,32]。和我们的结果了,夫人还能促进下游il - 10 / JAK1 / STAT3信号通路,提高抗炎反应。在未来,更多在活的有机体内和在体外可以进行相关研究,检测和验证的小说影响il - 10 /夫人JAK1 / STAT3信号通路在不同的疾病。由于其简单的分子结构,很难揭示夫人之间的具体作用方式由传统的实验方法和相应的受体。然而,随着结构生物学方法的发展,未来的工作可能会专注于夫人的影响影响蛋白质的结构如TLR4、NF -κB, il - 10,木菠萝,STAT3。

总之,我们发现富含甲烷的盐水对乙酸段溃疡性结肠炎有保护作用,依靠减轻氧化应激和炎症的能力通过抑制TLR4 / NF -κB / MAPK信号通路,促进il - 10 / JAK1 STAT3-mediated抗炎反应。夫人显示抗炎、抗氧化、antiapoptosis属性与先前的研究。然而,具体机制如何有益甲烷盐水仍不清楚。据报道,甲烷可以穿透细胞膜,发挥它的功能。因此,一些研究人员预测甲烷行为通过蛋白质镶嵌在脂质双分子层的膜36]。猜测,甲烷是通过相关受体诱导形成甲醇或酒精,然后影响细胞的氧化环境也提出了试图解释生物机制。除此之外,没有适当剂量的夫人决心根据先前的研究应用。然而,不同剂量的设置在我们的实验中显示,高剂量10毫升/公斤表现好于下一个1毫升/公斤。然而,进一步的研究涉及挪用剂量是必需的。在缺血再灌注损伤是最早和最常见的调查甲烷、脓毒症、肝炎、胰腺炎等疾病进行了探讨。我们的研究可以提供证据的应用领域扩大甲烷医学在溃疡性结肠炎和小说结肠炎治疗的方向来解决这个问题。没有特定指令相关的物理化学性质、生物机制,和使用的甲烷。然而,潜在的甲烷医学的前景,并进一步研究是必要的。

数据可用性

小鼠模型数据相关的数据,血清细胞因子水平,组织细胞因子mRNA水平,氧化应激指标,TUNEL染色法和免疫印迹图像用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

我们声明,没有关于这篇文章的出版的利益冲突。

作者的贡献

王GH参与研究设计,动物研究和论文的写作。徐B参与动物论文的研究和写作。王GH和徐B同样的贡献。“财政年度参与动物研究。杜MF参与IHC性能。李YG参与世行的性能。昱泰参与数据分析;陈LH设计研究中提供实质性的建议,协助劳动分工和写作和修改。

确认

这项工作是支持的科学和技术发展研究项目由陕西省基础(2015号sf057)。我们感谢所有那些参与或帮助这个研究项目。