恢复自噬流量救援氧化损伤和线粒体功能障碍预防椎间盘变性

文摘

氧化应激的线粒体功能障碍和髓核(NP)细胞凋亡在椎间盘变性的发展起着至关重要的作用(IDD)。增加研究表明,干预措施针对受损的自噬流量可以通过减轻氧化损伤维持细胞内稳态。在这里,我们研究了姜黄素的影响(坏蛋),一个已知的自噬激活,国际直拨电话在体外和在活的有机体内。坏蛋镇压叔丁基氢过氧化物(TBHP)诱导氧化应激和线粒体功能障碍,从而抑制人类NP细胞凋亡、衰老和ECM降解。坏蛋治疗诱导自噬和增强的自噬流量在一个AMPK / mTOR ULK1-dependent方式。值得注意的是,坏蛋缓解TBHP-induced中断autophagosome-lysosome融合和溶酶体功能受损,从而导致自噬间隙恢复阻塞。这些保护作用的坏蛋TBHP-stimulated人类NP细胞自噬诱导物雷帕霉素产生的影响,但影响是部分消除3-methyladenine和复合C-mediated抑制自噬起始或自噬流量chloroquine-mediated阻塞。最后,坏蛋也产生了对puncture-induced IDD进展的保护作用在活的有机体内。我们的研究结果表明,抑制过度生产活性氧和线粒体功能障碍的通过自噬增强加上恢复自噬通量TBHP-induced人类NP细胞凋亡,改善衰老和ECM降解。因此,维护正常运行的自噬是一个有前景的治疗策略IDD,和坏蛋可能作为代理IDD的一种行之有效的方法。

1。介绍

腰痛(LBP),最常见的一种肌肉骨骼问题在现代社会中,负责低生活质量和一个大的经济负担1]。枸杞多糖的主要原因被普遍认为是椎间盘变性)(IDD)、异常和细胞介导反应进步失败的试管由于老化、遗传因素和各种环境压力(2]。目前,手术和某些有限形式的保守治疗,如好休息,止痛,用于IDD,但没有有效或建设性的药物用于临床治疗IDD [3]。

试管由三个相互关联的结构:凝胶状的髓核(NP),纤维环(AF)、软骨终板。NP细胞发挥关键作用在维护正常的结构和生理功能的试管生成NP细胞外基质(ECM)的主要组件,包括II型胶原和蛋白聚糖(主要是aggrecan) (4]。IDD通常发生在NP细胞凋亡和衰老水平异常升高和ECM分解代谢超过合成代谢5]。氧化应激被确诊为深入参与IDD发病机理(6- - - - - -8]。它指的是不平衡活性氧簇(ROS)的产生和细胞的能力,以抵消他们通过抗氧化防御和可以损伤脂质,蛋白质和DNA (9]。IDD病理因素相关,如机械加载,营养不足,和炎性细胞因子的生产,能明显诱导活性氧的生产,随后导致氧化应激和线粒体功能障碍,进而导致过度凋亡、衰老,ECM降解NP细胞(6]。因此,全面调查机制不受控制的活性氧产量和有效的干预措施对这可能不仅增加我们的知识关于IDD发病机制,还为制动IDD提供适当的治疗策略。

自噬,这是高度保守的在所有的真核生物,不仅是主要的细胞内降解系统通过受损的细胞器和蛋白质降解溶酶体也是一个活跃的生产原材料和能源回收系统改造和体内平衡的细胞(10]。“自噬流量”一词反映了整个动态过程的完成形成自噬体与溶酶体融合,后续货物降解,降解产物的释放(11]。自噬扰动经常造成这些机制:抑制自噬起始,autophagosome-lysosome融合的中断,破坏溶酶体功能(12]。此外,自噬功能障碍已被广泛报道,细胞衰老和凋亡密切相关的一些疾病,尤其是退行性疾病,如关节炎(13],IDD [14),神经退行性疾病(15),和年龄相关性黄斑变性16]。值得注意的是,许等人发现治疗大鼠NP细胞与雷帕霉素(Rap),一个经典的自噬激活剂,可以有效防止ECM降解炎症等因素引起的肿瘤坏死因子-α和interleukin-1β(17]。最近,据报道自噬流量也明显受损在鼠NP细胞氧化应激(18]。因此,自噬upregulation加上自噬流量增强IDD可能代表一个有前途的治疗策略。

姜黄素(坏蛋)是一个活跃的多酚的干根状茎中提取出来的姜黄,坏蛋已经用于饮食和药用目的几百年来在世界的一些地区(19]。由于其固有的抗炎、抗氧化应激和anticatabolic属性,坏蛋可以减少各种疾病的发病机理和症状,包括骨关节炎(20.),阿尔茨海默病(21),和动脉粥样硬化22]。此外,坏蛋最近演示了诱导自噬在不同组织,如软骨(23,心24),和肝脏(25),但NP是否包括这些组织仍然未知。考虑到自噬与氧化应激之间的关系建立和坏蛋促进自噬的能力,增强理解CUR如何影响NP可能促进临床安全的发展,可用口服治疗IDD的代理。

在这项研究中,我们调查了坏蛋对自噬活性的影响,以及其对细胞凋亡的保护作用,衰老,ECM降解,在氧化应激和线粒体功能障碍在NP细胞。我们使用叔丁基氢过氧化物(TBHP)诱导氧化微环境,因为它提供了几个优势过氧化氢(H₂O₂),比如高稳定和缓慢释放[26]。此外,我们评估的治疗潜力坏蛋用puncture-induced IDD的鼠模型,我们的目标是提供新的见解的发展有效的治疗策略抑制IDD进展。

2。材料和方法

2.1。病人组织样本

腰椎NP标本取自8例(4男性和女性;年龄:15 - 30年)特发性脊柱侧凸畸形矫正手术。研究协议是同济医学院伦理委员会的批准,华中科技大学(没有。S214),从每个捐赠者获得知情同意。

2.2。隔离和人类NP细胞的文化

分离如前所述和培养人类NP细胞(27),在37°C湿润有限公司5%₂氛围,在杜尔贝科修改鹰中补充了F12营养混合物(美国纽约Gibco,大岛),15%的胎牛血清(Gibco),和1%的青霉素和链霉素(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。在融合,细胞被胰蛋白酶化消化和扩张通道,和细胞从第二通道被播种到实验板化验。

2.3。细胞培养治疗方案

决定的影响CUR TBHP-treated人类NP细胞,这些细胞被使用浓度增加(汽车销售μ米)的坏蛋24 h,然后接受TBHP (50μ米)24 h。评估CUR如何影响自噬活动,人类的NP细胞要么是治疗24小时与不同浓度的坏蛋(0、5、10、15、20、25μ25米)或治疗μ不同时期M坏蛋(0、6、12、18、24和30 h)。检查是否CUR促进自噬流量,NP细胞被使用或没有氯喹(CQ;10μ米),然后用不同浓度的坏蛋(10、15、20、25μ米)。测试自噬的作用通量CUR预处理的保护作用,细胞使用CQ (10μ米),3-methyladenine (3-MA;5毫米),或复合C (10μ米)前2 h CUR TBHP总局;阳性对照组,细胞说唱(100海里)治疗,疗程2 h,然后处理TBHP 24 h。坏蛋,TBHP CQ、3-MA复合C,说唱Sigma-Aldrich买来。

2.4。评估细胞生存和增殖

坏蛋的细胞毒性效应或TBHP人类NP细胞评估使用细胞计数工具- 8 (CCK)试验(Dojindo、日本):细胞resuspended和播种在96 -孔板,孵化24 h,坏蛋或者TBHP处理不同的时间和浓度。随后,10μL CCK-8的解决方案是添加到每个好,在37°C和细胞培养4 h,之后在450海里使用分光光度计测量吸光度(美国BioTek Winooski, VT)。

细胞增殖也评估使用BeyoClick™edu - 488细胞增殖工具包(Beyotime,中国)。评估程序进行推荐的制造商和荧光图像终于通过荧光显微镜(奥林巴斯IX71、东京、日本)。

2.5。RNA提取和定量实时PCR(存在)

治疗后人类NP细胞在不同的组,总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和使用Transcriptor reverse-transcribed合成第一链cDNA工具包(豆类生物技术,首先,日本)。存在使用SYBR绿色装备进行主混合(美国应用生物系统公司,培育城市,CA),和产品进行了分析使用ABI 7500测序检测系统,根据制造商的指示。在这项研究中使用的引物是列在表中1。每个基因的相对表达水平计算使用2^−ΔΔCT方法。GAPDH是作为内部控制。

2.6。免疫印迹分析

各种治疗后,总、细胞质和线粒体蛋白质从细胞中提取使用相应的工具,根据制造商的说明(Beyotime,中国)。等量的蛋白质从每个示例使用10 - 12% sds - page分离和转移到PVDF膜(美国微孔),它被封锁和孵化与特定的主要抗体(1:500 - 1:1000)在一夜之间在4°C,然后用适当的辣根过氧化物酶,(合)标记的第二抗体(1:2000;Abcam)。蛋白表达是可视化使用增强化学发光试剂(美国新泽西州Amersham,皮斯卡塔韦)。主要抗体这些分子被使用:细胞色素c (ab133504 Abcam) VDAC1 (sc - 32063,圣克鲁斯生物技术),GAPDH(# 5174,细胞信号技术),伯灵顿(ab32503 Abcam)、bcl - 2 (ab32124 Abcam)、裂解caspase-3(# 9664,细胞信号技术)、裂解caspase-9(# 9505,细胞信号技术),p16(# 80772,细胞信号技术),II型胶原蛋白(ab34712 Abcam) aggrecan (13880 - 1 - ap, Proteintech)、基质金属蛋白酶- 3 (MMP)(# 14351,细胞信号技术),MMP-13 (ab39012 Abcam) ADAMTS-4 (ab185722 Abcam) ADAMTS-5 (ab41037 Abcam) LC3(# 12741,细胞信号技术),Beclin-1(# 3495,细胞信号技术),SQSTM1 / p62 (ab56416 Abcam), AMPK(# 5832,细胞信号技术),磷的(p) AMPK(# 2535,细胞信号技术),mTOR(# 2983,细胞信号技术),p-mTOR(# 5536,细胞信号技术),ULK1(# 8054,细胞信号技术),p-ULK1(# 12753,细胞信号技术)和lysosomal-associated膜蛋白(灯)2 (27823 - 1 - ap, Proteintech)。

2.7。短暂的干扰(si) RNA转染

AMPK-targeting核(si-AMPK)和小干扰rna (si-Control)设计并合成了炒RiboBio(广州)。NP细胞转染siRNAs使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。各种治疗方法后,为进一步的实验细胞收获。

2.8。流式细胞术

人类NP细胞从每个治疗组是收获,和细胞凋亡水平,线粒体膜电位(ΔΨ米)变化,细胞内活性氧的生产评估使用膜联蛋白V-APC / 7-AAD凋亡检测设备(Yeasen生物技术,中国),荧光探针JC-1 (Beyotime)和ROS-specific荧光探针dihydroethidium(她Beyotime),分别,如前所述28]。标签后,样本检查使用FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学)。

2.9。测量细胞内丙二醛(MDA)水平,超氧化物歧化酶(SOD)活性,ATP含量和线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物)

MDA, SOD酶活性,ATP生产、注射和mPTP药物在人类NP细胞MDA测定使用分析工具(Beyotime), SOD(南京建成生物工程研究所、中国)、ATP (Beyotime),注射和mPTP药物(Genmed、上海、中国),分别按照制造商的说明书。

2.10。免疫荧光

免疫荧光染色的人类NP细胞进行如前所述[9]。这些细胞被孵化一夜之间在4°C主要抗体裂解caspase-3 (1: 400), II型胶原蛋白(1:200),MMP-13 (1: 200), LC3(1: 100),或者LAMP1(1: 200),然后用适当的二次抗体在室温下2小时。核与DAPI染色(Beyotime)。荧光图像获得使用荧光显微镜(奥林巴斯IX71、东京、日本)和一个激光扫描共焦显微镜(德国蔡司LSM780)。

2.11。衰老评估

细胞内senescence-associatedβ牛乳糖(SA -β评估使用SA -加)活动β加染色工具包(Beyotime),根据制造商的指示。染色后,SA -β加staining-positive衰老NP细胞出现蓝色光显微镜下。SA -β加活动表示为SA -的百分比β加staining-positive NP细胞总NP细胞。

2.12。mRFP-GFP-LC3化验

人类NP细胞被感染mRFP-GFP-LC3运载体(Hanbio技术,中国上海)评估TBHP和坏蛋在自噬通量的影响。测定的原理是基于不同pH值稳定的绿色和红色荧光蛋白:而绿色荧光蛋白的荧光信号是淬火在溶酶体酸性条件下,不改变mRFP荧光信号明显在酸性条件下;因此,自噬体表现为黄色puncta (RFP + GFP +),但自吞噬泡显示为红色puncta (RFP + GFP−)。当自噬流量增加,黄色和红色puncta细胞增加,而当自噬流量受阻,黄色puncta增加但红色puncta并不改变。mRFP和GFP puncta在每个治疗组发现了使用激光扫描共焦显微镜(蔡司LSM780)。

2.13。测量组织蛋白酶B (CTSB)活动,组织蛋白酶D (CTSD)活动,溶酶体pH值的变化

CTSB CTSD活动测量使用两个酶特异荧光测定试剂盒(BioVision),如前所述[29日]。溶酶体的pH值的变化测定使用LysoSensor绿色dnd - 189 (Yeasen)报告;试剂展品pH-dependent增加荧光强度在酸性环境。这些细胞被检查,并使用荧光显微镜成像。

2.14。老鼠IDD模型

动物实验协议是通过动物实验委员会华中科技大学。Sprague-Dawley老鼠(3个月)获得的实验动物中心华中科技大学(武汉,中国),将随机分成三组(控制、IDD和坏蛋组);动物IDD和坏蛋组试管穿刺手术,这是使用一根针(g) 27日在执行experimental-level鼠尾盘(Co7/8)根据手术方法报道陈et al。30.]。手术后,坏蛋组腹腔注射100毫克/公斤坏蛋和IDD组注射生理盐水每周两次一个月。动物每天监测,以确保他们的健康,和所有的动物被允许自由无限制的负重和活动。

2.15。磁共振成像(MRI)的评估

MRI上执行所有老鼠用BioSpec MRI(力量,7.0吨/ 20厘米)。t2加权成像的参数是指在一个先前的研究(27]。Pfirrmann分类系统(31日)是用来评估等级的试管变性。

2.16。免疫印迹分析,H₂O₂测量内容、组织学评估和免疫组织化学染色在动物模型

核磁共振检查后,椎间盘组织被收获进行进一步的分析。标本在甲醛固定、脱钙脱水,石蜡嵌入式,切割厚度5μm。部分是沾hematoxylin-eosin(他)和红色染料O-fast绿色(所以)和组织学得分计算基于以前描述的方法(32)量化组织的结果。免疫组织化学进行描述(14]。免疫组织化学分析,部分是孵化主要抗体II型胶原蛋白,MMP-13, LC3, p62,和裂解caspase-3在4°C一夜之间,与适当的部分被孵化后HRP-conjugated二级抗体,用苏木精复染色。西方墨点法用于检测II型胶原蛋白的表达,aggrecan, MMP-13, ADAMTS-4, ADAMTS-5, LC3, p62,裂解caspase-3在椎间盘组织和上面相同的步骤。最后,H的内容₂O₂在椎间盘组织评估使用过氧化氢测定工具包(南京建成生物工程研究所)根据制造商的指示。

2.17。统计分析

数据了 至少有三个独立的实验,分析了使用SPSS v.18.0软件(美国SPSS,芝加哥,IL)。使用学生的团体之间的差异进行评估 - - - - - -测试或单向方差分析(方差分析)其次是图基的测试。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。坏蛋对人类NP细胞生存能力的影响

坏蛋的化学结构如图1(一)。CCK-8试验的结果表明,在≤25μ米,坏蛋没有细胞毒性对人类NP细胞24和48 h(数字1 (b)和1 (c))。治疗TBHP 24 h减少人类NP细胞剂量依赖性的方式的可行性,和50μM TBHP选择刺激细胞在后续实验(图1 (d))。值得注意的是,坏蛋预处理减毒TBHP引起的细胞死亡(图1 (e))。

3.2。坏蛋的影响在TBHP-Treated人类NP细胞衰老和细胞凋亡

接下来,坏蛋对细胞凋亡的影响人类的NP细胞暴露于TBHP评估通过膜联蛋白V-APC / 7-AAD染色。TBHP治疗NP细胞凋亡的发生率明显增加,而坏蛋预处理救出这TBHP-induced增加细胞凋亡(数字2(一个)和2 (b))。此外,我们使用西方墨点法测量线粒体通路apoptosis-related蛋白质(bcl - 2、Bax caspase-3裂解,裂解caspase-9,和细胞色素c)在人类NP细胞;这是因为NP细胞氧化应激诱导细胞凋亡是据报道介导至少部分通过激活线粒体途径。TBHP治疗增加了水平的伯灵顿,caspase-3裂解,裂解caspase-9,细胞质和细胞色素c和bcl - 2和线粒体细胞色素c的水平下降,但坏蛋预处理减这些变化(图2 (c)- - - - - -2(我))。免疫荧光染色水平进一步透露,裂解caspase-3低TBHP / CUR cotreatment组比组仅接受TBHP(数字2 (j)和2 (k))。最后,在人类NP细胞衰老检测的结果正好与细胞凋亡的结果,如图所示为p16蛋白免疫印迹(古典衰老标记)(数据2(左)和2(米)),SA -β加染色(图2 (n)和2 (o))和EdU公司(数字2 (p)和2(问))。在一起,这些结果表明,坏蛋施加antiapoptosis TBHP-treated人类NP细胞和antisenescence效果。

3.3。坏蛋对TBHP-Induced ECM降解的影响在人类NP细胞

ECM合成代谢和分解代谢之间的失衡NP细胞和随之而来的ECM降解被认为是IDD的主要特征。因此,我们测量了信使rna和蛋白质水平的ECM合成代谢标记(II型胶原蛋白和aggrecan)和ECM分解代谢标记(MMP-3, MMP-13、ADAMTS-4 ADAMTS-5)在人类NP细胞TBHP刺激有或没有坏蛋预处理。TBHP治疗II型胶原蛋白和aggrecan减少和增加MMP-3 MMP-13 ADAMTS-4, ADAMTS-5 mRNA水平(数字3(一个)- - - - - -3 (f))和蛋白质含量(数字3 (g)- - - - - -3(米)),这些TBHP-induced改变被坏蛋预处理部分逆转。此外,免疫荧光染色的结果为II型胶原蛋白和MMP-13同意免疫印迹结果(数据3 (n)- - - - - -3(问))。

3.4。坏蛋对TBHP-Induced的影响在人类NP细胞氧化应激和线粒体功能障碍

氧化应激和随后的线粒体功能异常引起的过度ROS生成以前确认IDD发展中发挥至关重要的作用[9]。这里,细胞内ROS水平检测和测量使用荧光探针她和流式细胞术:TBHP治疗明显诱导活性氧的生产,这是部分被坏蛋预处理(数据4(一)和4 (b))。我们还研究了MDA的水平,脂质过氧化的产物,被广泛认为是氧化应激的标记细胞损伤;在人类TBHP-treated NP细胞,MDA水平高于控制NP细胞,和坏蛋预处理部分减少TBHP-induced MDA生产(图4 (c))。我们下了草皮,一个关键的细胞内抗氧化剂,催化超氧阴离子(O的转换₂^{- - - - - -})H₂O₂,然后进一步降低H₂O, O₂;在人类NP细胞SOD活性显著下调TBHP刺激后,这种影响主要是通过预处理和坏蛋(图4 (d))。线粒体功能障碍引起的氧化应激的特点是崩溃ΔΨ米,增加注射的mPTP药物打开,减少ATP生产。TBHP治疗导致的损失ΔΨm在人类的NP细胞,由比例的减少表明JC-1红色荧光(JC-1骨料)绿色荧光(JC-1单体),正如所料,坏蛋预处理减轻TBHP-induced损失ΔΨ(数据4 (e)和4 (f))。此外,坏蛋预处理预防注射延长mPTP药物引起的开放TBHP刺激(图4 (g))。TBHP人类NP细胞ATP水平降低,这是部分恢复了预处理与坏蛋(图4 (h))。这些结果表明,坏蛋缓解TBHP-mediated人类NP细胞氧化应激和线粒体损伤。

3.5。坏蛋的影响在人类NP细胞自噬

作为指标的自噬,LC3-I LC3-II转换和Beclin-1表达式使用西方墨点法进行评估。此外,我们评估p62的水平,一个特定的底物降解的自溶酶体,用于研究自噬流量的状态。结果显示剂量和时间增加LC3-II /我比,Beclin-1表达式,和p62退化CUR-treated人类NP细胞(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。自噬流量涉及自噬体的形成是一个动态的过程,运输自噬溶酶体基质,及其随后的退化。因为海拔自噬流量或减少疲惫的自噬囊泡可以导致增加LC3-II水平,我们试图区分这两个可能性,进一步分析在自噬流量坏蛋的角色:我们监控LC3-II水平在人类的NP细胞治疗CUR单独或与自噬抑制剂CQ通量,抑制溶酶体酸化和损害自噬体与溶酶体的融合。免疫印迹分析显示,CQ治疗增强p62水平和CUR-stimulated LC3-II /我比人类NP细胞(数字5 (e)- - - - - -5 (g)),这是通过免疫荧光分析(数据进一步证实了5 (h)和5(我))。总的来说,这些结果表明,坏蛋诱发自噬和促进人类NP细胞自噬流量。

3.6。AMPK效果/ mTOR ULK1 CUR-Mediated激活自噬通路在人类NP细胞

识别与自噬激活相关的信号通路在人类CUR-treated NP细胞,我们执行西方墨点法评估水平的AMPK, p-AMPK, mTOR, p-mTOR ULK1, p-ULK1(数字6(一)- - - - - -6 (d)):坏蛋增加AMPK的磷酸化和ULK1减少mTOR磷酸化的剂量和时间的方式。接下来,人类NP细胞转染si-AMPK或复合处理C,一个特定的AMPK抑制剂,之前CUR刺激。免疫印迹结果表明在人类NP细胞,复合C和si-AMPK抑制CUR-induced upregulation AMPK和ULK1 mTOR的差别,对这些基因的磷酸化,磷酸化以及CUR-stimulated LC3-II /我比的增加,Beclin-1表达式,和p62退化(算6 (e)- - - - - -6 (j))。免疫荧光染色结果还表明,坏蛋LC3-II水平升高,这可以通过复合C预处理(数据6 (k)和6(左))。这些数据表明,AMPK / mTOR / ULK1通路参与CUR-triggered人类NP细胞自噬的激活。

3.7。坏蛋对TBHP-Induced堵塞的影响人类NP细胞的自噬流量

自噬流量的变化进行评估与坏蛋和TBHP人类NP细胞治疗。首先,免疫印迹结果表明TBHP治疗提高了LC3-II /我比和p62蛋白质水平,提出损伤的自噬流量下TBHP曝光,,正如所料,坏蛋预处理降低TBHP-triggered p62积累和LC3-II /我比率增加(数据7(一)- - - - - -7 (d))。接下来,我们人类NP细胞转染串联mRFP-GFP-LC3构造成直接监测自噬流量的状态。酸性溶酶体环境有效地淬灭绿色荧光但不是红色荧光,这导致代只有红色荧光自吞噬泡,但两个红色和绿色的荧光在自噬体(合并为黄色puncta)。TBHP集团与对照组相比显示黄色puncta但不是红色puncta的增加,这表明自噬流量是抑制这些细胞;然而,TBHP / CUR cotreatment集团,更发现了红色puncta和更少的黄色puncta TBHP组(数字7 (e)和7 (f))。在一起,这些数据表明,坏蛋恢复缺陷自噬在人类NP细胞暴露于TBHP通量。

3.8。坏蛋对中断的影响Autophagosome-Lysosome融合和溶酶体功能障碍与TBHP人类NP细胞刺激

自噬体与溶酶体的融合是一个关键的步骤,它维护一个完整的自噬流量。LAMP1当我们执行double-immunofluorescence染色(溶酶体膜的蛋白质的一个主要组件)和LC3,我们观察到的LC3 colocalization LAMP1 TBHP刺激下减少人类NP细胞相比,在未经处理的细胞;值得注意的是,坏蛋预处理救出这个colocalization下降,证明CUR-mediated逆转TBHP-inhibited autophagosome-lysosome融合(数字7 (g)和7 (h))。

的自噬降解和营业额基质打包成自吞噬泡是自噬的最后一步。封锁自噬流量已经证明从溶酶体功能受损,结果显示,例如,异常的存在水平的溶酶体膜蛋白,溶酶体酶的活性,降低或减少在溶酶体的酸化。因此,我们评估的保护作用是否对TBHP-impaired CUR自噬流量与拯救人类NP细胞溶酶体功能障碍。溶酶体膜糖蛋白LAMP2, autophagosome-lysosome融合和自噬的间隙是至关重要的。免疫印迹显示TBHP刺激抑制LAMP2表达在人类NP细胞,但与坏蛋预处理部分阻止这种抑制作用(数字7(我)和7 (j))。第二,评估在人类NP细胞溶酶体的降解能力,我们测量的活动CTSB CTSD,这是关键的溶酶体蛋白酶:坏蛋预处理减轻TBHP-induced减少CTSB和CTSD(人物的活动水平7 (k)和7(左))。第三,考虑到溶酶体低pH值对溶酶体酶活性至关重要,我们评估了溶酶体的pH值通过LysoSensor绿色dnd - 189染色;这个探针绿色荧光强度的增加与细胞器的酸化pH-dependent的方式。我们发现TBHP-treated人类NP细胞表现出溶酶体pH值升高而控制,这坏蛋预处理部分抑制溶酶体引起的碱化TBHP(数字7(米)和7 (n))。总的来说,这些结果表明,损伤autophagosome-lysosome融合和溶酶体功能在人类NP细胞暴露于TBHP可以被坏蛋松了一口气。

3.9。自噬作用通量恢复在坏蛋在人类NP细胞的保护作用TBHP对待

调查的潜在贡献改进自噬流量CUR-mediated cytoprotection,人类NP细胞治疗与公认的自噬抑制剂CQ 3-MA或AMPK抑制剂化合物C然后暴露于CUR TBHP。说唱,此外,一个经典的自噬诱导物是用来加强TBHP-treated人类NP细胞的自噬流量。正如预期的那样,西方墨点法LC3和p62显示高架下自噬说唱预处理与TBHP单独治疗(数字8(一个)- - - - - -8 (c))。相比之下,预处理与复合C或3-MA减少LC3-II /我在人类NP细胞比率和p62退化处理TBHP和坏蛋,这说明自噬抑制(数字8(一个)- - - - - -8 (c))。预处理与CQ有效地阻止了自噬流量,反映在LC3-II /我比的增加和p62水平相对于相应的比例和水平TBHP / CUR cotreatment集团(数字8(一个)- - - - - -8 (c))。接下来,我们发现,当坏蛋被添加到TBHP-treated人类NP细胞的培养基,TBHP-induced衰老细胞凋亡和抑制,以流式细胞术结果显示(图8 (d)和8 (e)),SA -β加染色(图8 (n)和8 (o))和免疫印迹分析p16, bcl - 2、Bax, caspase-3裂解,裂解caspase-9,和细胞色素c(数据8 (f)- - - - - -8 (m)),同意说唱预处理后的结果。然而,坏蛋TBHP-induced细胞凋亡与衰老的预防效应被CQ钝化,3-MA和复合C(数字8 (d)- - - - - -8 (o))。此外,II型胶原蛋白和aggrecan水平低和MMP-3 MMP-13, ADAMTS-4, ADAMTS-5 TBHP-only组水平高于对照组。类似的治疗与自噬激活说唱,预处理与坏蛋抑制这些TBHP-induced改变,而CQ 3-MA,复合C缓解坏蛋(人物的抑制作用9(一个)- - - - - -9 (g))。此外,坏蛋治疗改善TBHP-induced人类NP细胞氧化应激和线粒体损伤,由活性氧的产量下降,反映了mPTP开放,MDA水平和增加ΔΨm和ATP含量,改善与说唱与诱导后的结果是一致的(数据9 (h)- - - - - -9(米))。然而,包含CQ、3-MA或复合C逆转CUR-mediated改良(数字9 (h)- - - - - -9(米))。整体而言,这些结果表明,坏蛋抑制TBHP-induced细胞凋亡、衰老,ECM降解、氧化应激、线粒体功能障碍,促进自噬流量。

3.10。坏蛋改善IDD体内大鼠模型的发展

考虑所有的实验结果在体外,我们构建了一个针puncture-induced IDD模型大鼠调查坏蛋在IDD的治疗效果在活的有机体内。IDD用核磁共振测量和评估是基于Pfirrmann MRI年级分数。核磁共振成像结果表明,t2加权信号强度更高的坏蛋治疗组比IDD组(图10 ()),而Pfirrmann MRI年级CUR组的分数低于IDD组(图10 (d))。接下来,我们评估了histomorphological试管组织的变化在老鼠模型中通过使用他所以染色(数字10 (b)和10 (c)):在对照组,椭圆形的NP构成大容量光盘的矢横截面,证实了他染色,和NP区域包含大量的粘多糖,所表示的强烈所以染色。NP星形细胞区域均匀分布和丰富的ECM包围。IDD组相对于对照组,显示出崩溃的椎间盘高度一起明显的纤维组织入侵。坏蛋治疗后,NP组织的损失和阀瓣结构的破坏是缓解与IDD组中观察到的影响。组织学评分还表示CUR防范IDD发展(图10 (e))。免疫印迹结果表明CUR治疗II型胶原蛋白的含量增加,aggrecan LC3-II /我的比例和降低的水平caspase-3裂解,MMP-13, ADAMTS-4, ADAMTS-5, p62相比IDD组(数字10 (f)- - - - - -10 (h))和II型胶原蛋白,免疫组织化学染色结果MMP-13, caspase-3裂解,LC3, p62与免疫印迹结果(图一致10(我))。最后,与IDD组相比,有显著降低H₂O₂坏蛋治疗组(图的内容10 (j))。在一起,这些发现表明,坏蛋改善IDD的进展在活的有机体内。

4所示。讨论

全球对枸杞多糖在一般人群成人患病率显示点患病率为12% -33%和22% - -65%的1年期患病率33]。虽然枸杞多糖早期诊断和预防改善由于广泛的研究集中在IDD的机制,目前临床治疗仅限于症状缓解,不有效地扭转IDD的病理学,最终导致椎间盘疾病的复发或圆盘损失函数(34- - - - - -36]。因此,它是至关重要的识别有效的药物,防止IDD进展通过作用于其病理机制。研究发现坏蛋可以增强自噬和恢复人类NP细胞自噬流量从而减少ROS,因此,抑制线粒体功能异常和过度NP细胞凋亡、衰老,ECM降解引起的氧化应激。这在活的有机体内研究进一步证明了疗效IDD的坏蛋。

ROS构成类型的不稳定和有氧代谢产生的高活性分子,包括O₂^{- - - - - -}H₂O₂和氢氧自由基(^⋅哦)。越来越多的证据表明,退化试管展览ROS水平,增加支持在体外在这项研究中(使用TBHP-induced模型37]。线粒体代表ROS袭击的主要目标,线粒体功能失调也过多的活性氧生成的主要网站。这造成了一种恶性循环,从而导致持续ROS生产,最终导致氧化应激和细胞死亡(38),这大大有助于IDD的发病机理。我们调查的影响CUR TBHP引起的氧化应激和线粒体功能障碍。正如所料,坏蛋预处理减毒细胞内ROS、MDA的积累,预防注射延长mPTP药物开通,和缓解的障碍ΔΨ米,ATP生产,SOD活性与TBHP人类NP细胞刺激。线粒体功能失调可以释放proapoptotic蛋白质形成apoptosome和激活半胱天冬酶为NP细胞凋亡级联。减少凋亡bcl - 2水平,增加proapoptotic伯灵顿的水平,以及从线粒体细胞色素c的易位细胞质据报道特点NP细胞凋亡的线粒体途径(27]。我们发现在NP细胞凋亡水平大幅增加TBHP应用时那坏蛋缓解TBHP-induced通过线粒体途径凋亡。衰老也扮演一个关键的角色在IDD的发生和发展。与衰老,NP细胞衰老似乎自然,但是这个过程可以加速了几个病理事件,包括氧化应激(39]。以前的工作表明,退化性试管,NP细胞衰老积累与生存能力降低,分解代谢增强,增加了炎症反应,损害自我修复(40]。我们发现,好明显减少SA -β加活动和p16的水平,这表明CUR强有力地抑制氧化应激人类NP细胞衰老,这一发现同意IDD发展的衰减。试管生理功能取决于NP ECM的分子组成,主要由II型胶原和蛋白聚糖。II型胶原为阀瓣提供抗拉强度(41],aggrecan-the最常见的proteoglycan-functions使NP在养分吸收水和艾滋病扩散的边缘通过维护一个渗透梯度(42]。逐步降低II型胶原蛋白和aggrecan内容,而出现由于矩阵合成代谢和分解代谢的失衡,是IDD的主要病理特征9]。我们的研究证实,坏蛋纠正ECM合成/降解失衡和保留矩阵组件通过促进II型胶原蛋白和aggrecan表达和抑制了ECM降解酶的表达MMP-3, MMP-13, ADAMTS-4, ADAMTS-5;这表明在NP CUR ECM内稳态的有益作用在氧化应激。此外,我们的结果在活的有机体内研究表明,坏蛋治疗改善针puncture-induced变性鼠尾盘,这进一步证实了上述结果在体外实验。

自噬,这意味着“自食”,起着至关重要的作用在维持细胞内稳态的降解和回收细胞内受损的细胞器和蛋白质反应增加细胞的代谢需求或环境压力如饥饿、缺氧、氧化应激(43]。已报告Nondegenerative鼠NP和房颤细胞表现出较低的基础水平的自噬,自噬活动是显著增加退化性鼠NP和房颤细胞(44,45]。然而,江等人得到相反的结果:Beclin-1表达式和LC3-II /我在NP细胞比率较低的患者比NP细胞IDD的腰椎骨折患者(46]。因此,自噬活动期间IDD差别upregulation或对这些可能与自噬的功能多样性。此外,假定的自噬在IDD的发病机制中的作用已经在其他先前的研究建议47]。例如,陈等人报道,激活自噬可以抑制MMP-3的表达,MMP-13, ADAMTS-4, ADAMTS-5人类NP细胞interleukin-1对待β但抑制自噬产生相反的效果48]。宫崎骏等人表明,重组人类SIRT1防止营养deprivation-induced人类NP细胞通过自噬诱导线粒体凋亡[49]。总的来说,这些结果表明,通过调节自噬活动,NP细胞的退行性表型引起各种病理因素可以大大减轻;这表明,自噬在NP细胞可能代表一个有效的目标IDD的治疗。

坏蛋是一种多酚,已被证实对多种药理作用在体外和在活的有机体内模型(50,51]。有趣的是,坏蛋已经报道促进或抑制自噬活性在不同细胞(52- - - - - -54]。在这项研究中,我们发现坏蛋诱导自噬和增强人类NP细胞自噬流量,我们进一步研究了潜在的坏蛋促进自噬的分子机制。我们首先关注AMPK / mTOR ULK1信号通路,因为这种途径调节自噬的激活是至关重要的:AMPK,一个关键的能源传感器,可以直接使磷酸化ULK1(酵母ATG1的哺乳动物相同器官),反过来,启动自噬(55];相反,mTOR进化高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是确定函数作为一个消极的自噬抑制ULK1调节器,这mTOR行动可以反击AMPK信号(56,57]。坏蛋已经报告给调节自噬通过抑制mTOR [58)或激活AMPK途径(59]。因此,我们的研究揭示了AMPK / mTOR / ULK1通路参与CUR-mediated自噬激活。

由于自噬细胞内的积累致病性废物障碍已经涉及到各种疾病的发生和发展,包括IDD [43,47]。在完成执行自噬过程中,自噬体与溶酶体的融合取决于溶酶体膜蛋白,和随后的退化的困货物取决于溶酶体酸性水解酶的活性;这表明自噬溶酶体是至关重要的,溶酶体功能障碍可能导致损害的自噬的通量和干扰细胞内稳态。最近,气等人表明,病理机制LAMP2基因的突变导致Danon疾病相关的损伤自噬流量和自噬小体的过度积累60]。此外,李等人发现了一个重要作用引起的溶酶体功能障碍发病机制的抑制溶酶体水解酶活动的cadmium-induced神经毒性(29日]。在这项研究中,我们发现自噬流量是摄动以及自噬体与溶酶体融合过程中自噬降解中货物在人类NP细胞氧化应激。值得注意的是,坏蛋预处理修复溶酶体功能和autophagosome-lysosome融合,从而最终获救自噬流量通过氧化应激的损伤。

我们进一步研究自噬的作用通量观测cytoprotective CUR效果与TBHP人类NP细胞刺激。坏蛋的有益效应被发现与那些由说唱是一致的,这是众所周知的,抑制mTOR从而促进自噬活动。随后,我们使用3-MA、CQ和复合C抑制自噬活动在人类的NP细胞:3-MA选择性PI3K抑制剂,主要阻碍自噬的初期阶段;CQ块溶酶体酸化,从而干扰的一个关键步骤自噬流量;和复合C是一个广泛使用特定的AMPK抑制剂。我们的研究结果表明,抑制自噬起始和损伤的自噬流量减少的能力CUR保护人类NP细胞免受TBHP-induced氧化应激、细胞凋亡、衰老和ECM降解。总的来说,这项研究的结果表明,坏蛋TBHP-treated人类NP细胞的保护作用的增强可以归因于自噬,自噬流量的恢复。

NP细胞凋亡、衰老和矩阵合成代谢和分解代谢之间的失衡是公认的主要贡献者IDD [5]。同时,大量证据表明,氧化应激有说服力地触发这些病理过程(6]。在这项研究中,我们使用TBHP引起过多的活性氧产量,导致氧化损伤细胞内大分子和线粒体。我们的数据进一步表明,自噬降解在TBHP-treated人类NP细胞阻塞。本科生包含货物和受损的线粒体自噬小体可以诱导活性氧增加产量,从而创建一个正反馈循环,导致进步细胞损伤(61年,62年]。清除累积的自噬小体,通过恢复受损的线粒体自噬流量受损将有助于保持在正常水平,稳定线粒体ROS函数,这将最终维持细胞内稳态。因此,在这项研究中,自噬的增强和自噬流量的恢复CUR可能间接地起到了保护作用通过上述清除过多的活性氧分子机制。

CUR发挥抗氧化作用增加SOD等抗氧化酶的活动(63年]。在这项研究中,我们的研究结果表明,坏蛋预处理逆转TBHP SOD活性的差别,对这些基因的诱导。此外,ROS生产后部分恢复cotreatment自噬抑制剂和坏蛋。因此,这些结果表明,坏蛋在NP细胞的保护作用至少部分与监管SOD活性有关。

本研究的局限性如下。首先,老鼠试管经验与人类相比不同的生物力学特征。更多的研究使用一只猴子,山羊,或者狗可能提供进一步的见解。第二,坏蛋是中国专利药有很多药理作用,坏蛋在NP细胞的保护作用可能不仅通过调节自噬活动还通过其他信号通路。因此,需要更多的调查在未来专门调查自噬的保护作用通量恢复IDD的过程中。

5。结论

这项研究表明,坏蛋治疗诱导自噬和增强的自噬通量AMPK / mTOR / ULK1信号通路,保护人类NP细胞对氧化stress-triggered凋亡,衰老,ECM降解减轻过多的活性氧产量和线粒体功能障碍(补充图。1)。这些影响限制在抑制自噬起始或妨碍在NP细胞自噬流量。此外,的结果在活的有机体内分析了坏蛋在IDD的治疗效果。我们的研究表明,杂狗可能是一个潜在的治疗代理IDD治疗。

缩写

腰痛:	腰痛
试管:	椎间盘
国际直拨电话:	椎间盘变性
坏蛋:	姜黄素
NP:	髓核
ECM:	细胞外基质
房颤:	纤维环
TBHP:	叔丁基氢过氧化物
ROS:	活性氧
mPTP:	线粒体通透性转换孔
CQ:	氯喹
3-MA:	3-Methyladenine
CTSB / CTSD:	组织蛋白酶B / D
她:	Dihydroethidium
MDA:	丙二醛
说唱:	雷帕霉素
SA -β加:	Senescence-associatedβ牛乳糖
SOD:	超氧化物歧化酶。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

这些作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

梁康、黔湘和圣丰詹贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81772391)和中央大学的基础研究基金(2017 kfyxjj248)。

补充材料

curcumin-induced自噬激活和自噬机制通量恢复在缓解TBHP-induced人类NP细胞氧化损伤和线粒体功能障碍。(补充材料)

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