文摘
荠菜(危害bursa-pastoris(l)Medik),野生草本植物作为传统草药,证明与多个健康的好处。在这项研究中,确定了荠菜的化学成分UPLC-QTOF-MS /女士。荠菜提取物的抗氧化和抗炎潜力(SPE)也被调查,应用脂多糖(LPS)诱导炎症在原始264.7巨噬细胞和carrageenan-induced老鼠爪子水肿模型。24个化合物被确定主要包括酚酸和类黄酮。数据还表明SPE抑制的产品没有,铂族元素2肿瘤坏死因子-α,il - 6与LPS刺激。此外,SPE的增加抑制活性氧(ROS)和调节血红素的表达oxygenase-1 (HO-1)。我们进一步发现,SPE磷酸化的抑制NF - P38 MAPK和激活κB。在活的有机体内小鼠模型还表明,SPE显示强大的抗氧化和抗炎活性。
1。介绍
炎症存在的肥胖,老人的身体,伴随着许多不同的慢性疾病,如胰岛素抵抗、2型糖尿病、心血管疾病、慢性肾功能衰竭,一些癌症,内分泌1- - - - - -3]。来抵消这种慢性炎症状态,非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)通常被作为一种治疗策略提出(4]。然而,副作用与长期使用非甾体类抗炎药和类固醇刺激开发新型抗炎疗法(5,6]。因此,功能性食品,例如,一些可食用的野生草本植物,有特殊的健康福利,风味独特,营养价值高,可能是一个好的的选择提高慢性低度炎症及其相关疾病。更重要的是,这些功能食品也显示较高的生物安全,也可以很容易地和广泛接受。
荠菜(危害bursa-pastoris(l)Medik),野生草本植物(图1)具有高营养价值,生吃或煮熟的蔬菜几千年来在许多国家,越来越关注。荠菜一直作为历史悠久的传统草药已被记录在中医古籍“曹本帮派μ,”“明易Bie Lu”等等。先前的研究发现荠菜中含有多种化学物质包括类黄酮、生物碱、多肽、胆碱、乙酰胆碱、组胺、酪胺、脂肪酸、甾醇类、有机酸、氨基酸、萝卜硫素,许多微量元素、维生素、和许多其他化合物(7- - - - - -11]。此外,药理研究也证明,荠菜和多种生物活性,包括抗炎、抗氧化、抗过敏药,疼痛抑制活动,抗癌效果在先前的研究12- - - - - -16]。蔡等人准备从荠菜sulforaphane-containing解决方案组件,发现它有显著的抗炎活性13]。局域网等人发现的层提取危害bursa-pastoris这与apigenin-7-O -β-D-glucopyranoside luteolin-7-O -β-吡喃葡萄糖苷,α腺苷、尿苷显示更强的抗炎活动carrageenan-induced爪子水肿实验和egg-albumin-induced炎症实验(17]。尽管小和抗炎活性研究发现荠菜,化学成分、提取物的抗氧化和抗炎活动荠菜,和它的底层机制尚未系统研究。因此,本研究的目的是系统地研究了化学成分、氧化和抗炎活动荠菜的提取,及其使用LPS-induced生264.7细胞和一个潜在机制在活的有机体内carrageenan-induced老鼠爪子水肿模型。
2。材料和方法
2.1。荠菜中提取的植物材料和制备(SPE)
新鲜荠菜是来自孝感,中国的湖北省,2017年3月。整个植物的标本是存入在华中农业大学食品科学与技术学院(凭证标本编号:2016 - 02)。原材料是干在树荫下,然后用粉碎机粉碎。原材料萃取,100克和2000毫升95%乙醇浸泡在100°C 1 h两次。提取的解决方案相结合,集中在减压,然后冷冻干燥使用真空冷冻干燥。提取物的产量大约是12.8% (w/w)。提取存储在−20°C为进一步使用。
2.2。UPLC-QTOF-MS / MS系统和条件
化学分析的SPE是由UPLC-QTOF-MS / MS分析装备有水域Acquity UPLC系统和女士系统(美国马水域Corp .)。的UPLC分析Acquity UPLC本·C18柱(2.1×100毫米,1.7μ米)。移动阶段组成的水有0.01%甲酸(A)和甲醇(B);与一个梯度进行洗脱过程根据下列条件:0 - 0.5分钟,1% B;0.5 -30分钟,1% -99% B, 0.4毫升/分钟的流量。1毫克/毫升的SPE在0.22乙醇制备和过滤μ米尼龙微孔膜之前使用。注射量是1μESI MS l .参数如下:消极的模式;源温度120°C;反溶剂气体流量800 L / h;反溶剂温度450°C;锥气流50 L / h;采样锥和毛细管电压30和2500 V,分别。扫描范围从m / z100年到1500年被应用。
2.3。SPE的抗氧化活性
SPE的自由基清除能力是评估使用abt化验。abt的股票的解决方案+是由混合abt和K(7毫米)吗2年代2O8解决方案。获取abt+工作方案,上述股票的解决方案是进一步稀释用水,直到接受吸光度在734海里(0.7±0.02)实现。抗坏血酸(Vc)被选为一个积极的控制和Vc等价的抗氧化能力进行了计算。10μ样品与不同浓度L和200年μL工作解决方案的涨跌互现,孵化大约10分钟,吸光度测定使用标在734海里。
2.4。细胞培养
写明ATCC,老鼠巨噬细胞细胞系生264.7(美国)是生长在DMEM培养基(美国写明ATCC)补充10%胎牛血清(的边后卫)(美国Gibco) 5%的股份有限公司2湿润孵化器在37°C。
2.5。细胞生存能力分析
生264.7巨噬细胞被播种密度的4×103细胞/到96孔板。孵化后一夜之间,这些细胞被处理SPE (0 - 320μg / mL)和有限合伙人20 h。然后,20μL 5毫克/毫升的methylthiazole四唑(MTT)被添加到每个然后孵化为另一个4 h。在那之后,上层清液和100年被抛弃了μL DMSO是补充道。盘子都摇动了1分钟,吸光度测量在570 nm使用标(美国热费希尔)。
2.6。确定没有和促炎细胞因子
生264.7巨噬细胞治疗如前所述[18]。简单地说,这些细胞被刺激与1μ克/毫升的有限合伙人有或没有SPE 16 h。浮在表面的游离是收集不同治疗时间(1、2、4、8、16 h)。没有测量使用格里斯试剂浓度(美国σ)和纳米2应用作为标准。铂族元素的内容2肿瘤坏死因子-α使用特定的酶联免疫试剂盒,il - 6测量(开曼化学,安阿伯市密歇根,美国;研发、明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指导方针。
2.7。测量活性氧的生产
细胞内的活性氧决心使用2 ,7 - - - - - -二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)如前所述18]。生264.7巨噬细胞细胞最先孵化有限合伙人和SPE 16 h;之后,细胞治疗20μ在37°C M DCFH-DA在黑暗中30分钟。之后,DCF荧光强度是衡量微型板块荧光计的波长488 nm(激励)和535海里(排放)。
2.8。免疫印迹分析
上述治疗方法是一样的。伊诺,COX 2, HO-1决心,巨噬细胞刺激了1μ克/毫升有限合伙人和SPE 16 h。信号分子分析(NF -κB和MAP激酶信号),细胞治疗1μ克/毫升有限合伙人和SPE仅为一个小时。蛋白质样品有或没有MG132、蛋白酶体抑制剂,也收集了0.25,0.5,1 h。之后,这些细胞被收获和蛋白质收集。免疫印迹方法的详细信息与先前的报道(19]。这些墨迹被发现使用增强化学发光分析工具包(英国通用电气医疗集团)和可视化的化学发光法(BioRad实验室、大力神、钙、美国)。β肌动蛋白被用作控制。
2.9。Carrageenan-Induced鼠标后爪水肿
C57BL / 6小鼠(20 g)是来自华中农业大学实验动物中心(武汉,中国)。所有的程序都是实验动物审查委员会批准中国华中农业大学。首先,100 - 400毫克/公斤的SPE的口服药物;1小时后,30μL 1%角叉菜胶注入他们的正确的后爪引起水肿。爪子的厚度是评价1,2,4 h。最后,老鼠安乐死和爪子组织收集和保存在−80°C下学习。炎性细胞因子包括IL 6和TNF -α使用特定的ELISA试剂盒测定(研发、明尼阿波利斯,美国)。SOD活性和MDA含量调查使用特殊测试试剂盒(南京建成生物工程研究所、中国)。
2.10。统计分析
所有数据被当作意味着±s.d统计显著性进行了分析使用单向方差分析和图基多重比较测试应用GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。UPLC-QTOF-MS SPE / MS分析
在目前的研究中,定性分析使用UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS SPE进行的组成。320纳米的爸爸色谱SPE如图1。列在表1SPE, 24个化合物被确定。SPE的化合物初步确认的数据,通过比较女士发表文献[20.- - - - - -31日]。总之,这些化合物包括7个酚酸及其衍生物、17类黄酮属于黄酮组,黄酮醇、黄烷酮类。
3.2。SPE的可行性生264.7巨噬细胞的影响
MTT试验进行计算SPE有或没有有限合伙人的细胞毒性。结果表明SPE没有细胞毒性即使在高浓度(160μ264.7 g / mL)生无论有限合伙人(图的存在2)。因此,在本研究10、20、40、80人μ克/毫升的SPE被选为下学习。
3.3。SPE对炎性细胞因子的影响生产和相关基因的表达
我们首先研究了SPE能否抑制生产的,这是主要的促炎介质LPS-induced炎症巨噬细胞。结果见图3(一个),有限合伙人可以诱发大量的没有;40μ克/毫升的SPE不能显著降低生产( )与集成电路5091.09μ克/毫升。对铂族元素2,类似于生产,SPE的浓度增加,铂族元素的水平2和一个集成电路显著降低吗50150.37μ克/毫升(图3 (b))。同样,治疗SPE导致浓度减少IL 6和TNF -α与集成电路50129.4和136.2的μ克/毫升(数字3 (c)和3 (d))。进一步的免疫印迹试验(数据3 (e)和3 (f))还表示,SPE显示显著抑制对伊诺和cox - 2的表达的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。SPE对促炎细胞因子分泌的影响
进一步调查的影响SPE在特定细胞因子的分泌刺激有限合伙人在不同治疗时期,没有的内容,il - 6,铂族元素2和肿瘤坏死因子-α测量在1、2、4、8、16 h。结果见图4有限合伙人的感应,所有这些产品的四个主要促炎细胞因子与LPS刺激的时间增加增加。80年μg / mL SPE可以显著抑制这些特定的一代促炎细胞因子( )在8 h和16 h。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。SPE对MAPK磷酸化的影响和NF -激活κB
NF -κB和MAP激酶信号(p38、物和ERK)通路调节LPS-induced炎症反应也扮演了关键的角色在炎症的发生和发展32]。进一步澄清的底层机制抗炎能力,SPE在NF -激活的影响κB和磷酸化的MAPKs免疫印迹分析评价。数据中提供的数据5(一个)和5 (b)SPE显示,显著减少p38的磷酸化。在这项研究中,某人203580 - 38 MAPK抑制剂,也显示出显著抑制活动没有生产LPS-induced RAW264.7细胞(32.06±3.14 vs 18.51±2.37μ米)。此外,我的磷酸化κBα和p65出现LPS刺激后60分钟(数字5 (c)和5 (d))。的磷酸化p65与SPE的治疗明显降低;我的磷酸化κB -α也减少了与80年的治疗μg / mL SPE虽然没有显著差异。这些数据表明,SPE在LPS-induced磷酸化的抑制作用p 38 MAPKs和NF -激活κB部分与其抗炎潜在关联。在这项研究中,我们还使用了MG132、蛋白酶体抑制剂,澄清SPE的效果。结果见图6MG132显示LPS-induced炎症(图上显著的抑制作用6(一))。结果显示在图6 (b)的磷酸化,有限合伙人可以显著诱导IKK和我κB和诱导我的退化κBα。不过,SPE可以扭转这种减少炎症过程的发展。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
3.6。SPE的抗氧化活动
先前的研究已经表明在体外abt自由基清除活性可以用作评估类黄酮的抗炎活性标记(33]。因此,SPE的抗氧化活性是首先使用abt试验研究。作为数据呈现在图7(一)SPE的abt自由基清除活性增加与EC SPE浓度的增加50值为61.6μ克/毫升。在160年的浓度μg / ml,大约80%的abt自由基被回收。SPE的Vc等效抗氧化能力是计算为0.18 g / g SPE。图7 (b)表明,有限合伙人的刺激,细胞内活性氧积累在264.7原始细胞,而SPE对活性氧的生产表现出强烈的抑制效应。
(一)
(b)
(c)
(d)
HO-1被报道为stress-inducible蛋白质等许多刺激诱导的氧化应激和紫外线34,35),upregulation HO-1的表达被证明是一个有用的方法来提高氧化损伤和巨噬细胞激活(35- - - - - -38]。因此,HO-1的表达与SPE治疗也在本研究评估(数字7 (c)和7 (d))。这些结果表明,HO-1的表达增加与SPE的治疗。
3.7。在活的有机体内抗炎活性的SPE
SPE的抗炎潜力进一步调查使用在活的有机体内老鼠爪子水肿模型。作为数据见图8,后爪厚度显著增加注射角叉菜胶,和400毫克/公斤的SPE显示显著抑制活性的爪子水肿(图8)。的口服400毫克/公斤的SPE,爪子厚度显著减少,0.30±0.02,0.32±0.02厘米相比0.37±0.01,0.39±0.03厘米2 h和4 h,分别。肿瘤坏死因子-α和il - 6,大量的TNF -α和il - 6与注射角叉菜胶诱导(数字9(一个)和9 (b));400毫克/公斤的SPE可以显著降低TNF -的一代α和il - 6, 170.23±19.58, 1728.21±237.69 pg /毫克蛋白相比,226.01±38.70,2314.41±409.04 pg /毫克蛋白( ),分别。此外,400毫克/公斤的SPE还可以显著降低MDA含量(19.82±4.36 vs 39.71±5.30 nmol /毫克的蛋白质, )(图9 (c))。这些在活的有机体内结果也按照从细胞培养模型的结果。同时,SOD活性测定还表示,由角叉菜胶注射SOD活性的下降是扭转的治疗SPE (50.53±6.59 vs 32.19±4.28 U /毫克蛋白)(图9 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
近年来,全世界功能食品已收到越来越多的关注。它不仅提供营养,还可以提供许多植物化学物质发挥功能因素对人类健康,尤其是对这些人有慢性疾病或亚健康的状态,如慢性低度炎症;这些功能食品可能是最好的选择来改善他们的健康,而不是用药物治疗(39,40]。先前的研究已经证明,荠菜(危害bursa-pastoris)施加multihealthy好处,比如抗菌(41,抗炎13)、心血管、生殖,抗癌16,42),王亚南,镇静剂和其他药理作用[43]。因此,荠菜乙醇提取物的化学成分是第一个特点是UPLC-QTOF-MS /女士,然后SPE的抗炎作用及其潜在机制LPS-induced炎症模型和原始264.7在活的有机体内小鼠模型进行系统研究。
巨噬细胞在免疫系统中起着关键作用;激活的巨噬细胞诱导的分泌许多炎症介质,同时加上高度的氧化应激(44]。SPE显示显著抑制生产没有和铂族元素2。循环炎症因子的过度表达,包括il - 6、il - 1β肿瘤坏死因子-αMCP-1,转化生长因子(TGF)——TGF-b,和IFN-c也被证明与低度相关,慢性炎症(45,46]。在这项研究中,结果表明,肿瘤坏死因子-的生产α和il - 6的治疗有显著抑制SPE从4 h。这些发现表明,SPE可以减弱LPS-induced巨噬细胞激活,这表明SPE具有潜在的抗炎活性。
炎症是由许多炎性介质和细胞信号通路(47]。在这个过程中,NF -κB、MAPKs Nrf 2 / HO-1通路已经被证明在介导炎症反应(扮演关键角色19,48- - - - - -52]。因此,这些途径是潜在目标[药理干预治疗炎症49,50]。本研究发现SPE可以抑制p38 MAPK的磷酸化和减少随后的炎症反应。同样,NF -κB也是一个重要的信号通路参与免疫和炎症反应53,54]。此外,治疗后SPE, LPS诱导我的磷酸化κB、p - 65也生264.7中抑制巨噬细胞与SPE的治疗,这表明SPE可以防止NF -的激活κB发挥其抗炎的潜力。此外,这两个信号通路之间有非常密切的关系。从上面的结果,我们可以发现这两个p 38 MAPKs和NF -的激活κB信号通路是SPE的被治疗。因此,这些数据表明SPE发挥其抗炎可能至少部分与监管MAPKs和NF -激活的κB通路。
已经证明,有慢性炎症和氧化应激之间的联系,和自由radical-induced伤害也会诱发许多慢性健康问题(55- - - - - -57]。在炎症过程中,活性氧被证明参与LPS-stimulated炎症过程通过激活特定的信号通路,导致许多特定的细胞因子的生产(35,57- - - - - -60]。此外,upregulation HO-1被认为是一个关键的应对各种各样的压力,它可以发挥其抗炎可能通过抑制特定细胞因子的过度生产,并通过调节巨噬细胞转变成一个M2-phenotype [61年]。在这项研究中,数据显示SPE具有较强的抗氧化活性;与此同时SPE可以抑制巨噬细胞细胞ROS生产而增强HO-1的表达。这些数据证明了强大的抗氧化活性也发挥了重要作用在SPE的抗炎效果。
Carrageenan-induced爪子水肿动物模型通常被用于评估炎症反应的不同阶段和评估抗炎剂;它可以引起急性炎症,炎症介质的释放,产生自由基(62年- - - - - -64年]。因此,该动物模型也被用于这项研究。结果证明,SPE可以抑制carrageenan-induced水肿的发展,这是包括的在体外发现。与此同时,由角叉菜胶诱导的炎症而ROS的生成和增加氧化应激(64年]。动物研究表明,有一个显著增加MDA含量和SOD活性明显降低,在模型组注射角叉菜胶。然而,随着治疗400毫克/公斤SPE,增加SOD活性,减少MDA的爪子水肿组织观察。这些结果表明,SPE还展示了强大的抗炎和抗氧化潜能在活的有机体内。
在这项研究中,大约24个化合物被确定的提取危害bursa-pastoris。HPLC-MS结果,SPE含有大量的黄酮类化合物,如槲皮素、kaempferol-7-O-rhamnopyranoside, quercetin-3-O-glucopyranoside, quercetin-6-C-glucopyranoside, kaempferol-3-O-rutinoside;这些结果也符合先前的一些发现(43,65年,66年]。许多研究已经调查了这些组件的健康益处,例如,抗氧化,ant-obesity和抗癌活动64年,67年,68年]。因此,SPE中给出的黄酮类成分可能为它的抗氧化和抗炎活动中起着关键作用。然而,由于提取包含许多化合物,进一步的工作仍需要进行进一步调查单一化合物的抗炎作用明显抗炎SPE的潜力。
5。结论
总之,在这项研究中,化学成分,荠菜的抗炎作用,其潜在机制第一次系统地评估。我们的研究结果表明,危害bursa-pastoris(l)Medik可能减少没有和铂族元素2生产和抑制TNF -的生产α开发过程和il - 6在炎症。底层机制研究证明抗炎的潜力危害bursa-pastoris(l)Medik是通过激活的抑制- 38 MAPKs和NF -κB通路。综上所述,除了良好的营养价值和美味已经描述的先前的研究,危害bursa-pastoris(l)Medik还显示特殊的健康益处,这表明它可能是有趣的不仅对人类健康,而且作为食品添加剂。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Jinming彭和胡田勇co-first作者的贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了中国自然科学基金(31701712)、湖北省自然科学基金(2017 cfb197),基础研究基金为中央大学(2662016 qd035),龙岗(没有科技项目。20160607142024828),深圳市科技创新委员会项目(ZDSYS201506050935272号)。