四甲基吡嗪变弱Endotheliotoxicity和阿霉素的线粒体功能障碍通过14-3-3γbcl - 2 /

文摘

阿霉素(阿霉素)毒性和癌症endotheliotoxicity限制了其临床应用。toxicitic机制需要过量的活性氧的生成。14-3-3s对各种受伤组织和细胞有保护作用。四甲基吡嗪(TMP)是一种生物碱提取的粉末当归wallichii多种生物活性。我们假设TMP对血管内皮的保护作用上调14-3-3γ。为了测试假说,Dox-induced endotheliotoxicity是用于建立血管内皮损伤模型小鼠和人类脐静脉内皮细胞。TMP的影响进行评估,确定胸主动脉条“endothelium-dependent扩张(EDD),以及LDH、CK, caspase-3, SOD, CAT,氧化酶活动和血清MDA水平,凋亡率、维管组织和组织病理学变化(在活的有机体内)。细胞的生存能力,LDH和caspase-3活动,ROS生成,NAD的水平⁺注射/ NADH和GSH / GSSG, MMP mPTP药物,和凋亡率进行评估(在体外)。14-3-3的表达γ和bcl - 2,以及磷酸化的坏(S112),测定蛋白质印迹。我们的研究结果表明,Dox-induced损伤血管内皮是下降了TMP通过上调14-3-3γ总在线粒体蛋白质和bcl - 2表达,表达激活坏(S112)磷酸化,维护EDD,减少LDH、CK、和caspase-3活动,从而导致凋亡率降低,血管内皮细胞和组织病理学变化(在活的有机体内)。此外,TMP增加细胞活力和MMP的水平,保持河畔⁺/ NADH、谷胱甘肽(GSSG平衡,减少LDH和caspase-3活动,ROS生成,mPTP开放,凋亡率(在体外)。然而,血管内皮细胞的保护作用TMP明显取消垫/ 14-3-3γ成分,腺病毒导致降价14-3-3γ表达式或abt - 737,一个特定的bcl - 2抑制剂。总之,本研究首次证明TMP对Dox-induced保护血管内皮损伤通过上调14-3-3γbcl - 2表达,促进易位的线粒体,注射关闭mPTP药物,维持MMP抑制RIRR机制,抑制氧化应激,改善线粒体功能,减轻Dox-induced endotheliotoxicity。

1。介绍

阿霉素(阿霉素)是一种广谱、高效、低成本、使用方便的抗癌抗生素(1]。然而,它的毒性存在剂量依赖的相关性大大限制了其临床应用(2]。近年来,阿霉素对血管内皮的损伤,和所谓的endotheliotoxicity也引起了相当大的关注3]。

许多研究发现,有各种各样的原因阿霉素的毒性或endotheliotoxicity [3,4]。然而,最重要的一个原因是,阿霉素本身可能诱发氧化应激,导致过多的活性氧(ROS)生成(3- - - - - -6]。在先前的研究中,我们已经表明,阿霉素毒性会导致过多的活性氧生成,导致严重的心肌损伤(7,8]。然而,抑制氧化应激和减少ROS生成可能减轻阿霉素引起的毒性或endotheliotoxicity [9- - - - - -13]。植物化学物质都是候选人的主题(7,8,10- - - - - -13]。

四甲基吡嗪(TMP),一种生物碱提取当归的根chuanxiong长的矮(信用证;伞形科),中国传统医学(14),有多个目标和许多生物学功能,如抗氧化、抗血小板、抗炎、抗凋亡等(15- - - - - -17]。许多研究表明,TMP对心肌保护作用,大脑,和血管内皮细胞,这表明TMP有着良好的应用前景在心脑血管病的预防和治疗16- - - - - -19]。最近,我们发现,TMP可以调控的14-3-3γ表达,改善线粒体功能,并降低LPS诱导细胞凋亡心肌细胞(20.]。

14-3-3s是一种高度保守的酸性蛋白家族组成的七个亚型(21]。通过磷酸化,与伴侣蛋白相互作用,参与细胞内几乎所有的生命活动22]。我们先前的研究发现,14-3-3η和14-3-3γ参与急性心肌损伤和保护。14-3-3η参与缺血/缺氧损伤和保护,而14-3-3γ主要涉及感染或炎症损伤和保护(20.,23- - - - - -29日]。最近,我们发现,姜黄素和槲皮素可以调控的14-3-3γ表达,改善线粒体功能、保护心肌对阿霉素的毒性7,8]。

因此,当前的研究的目的是调查在活的有机体内和在体外1)是否TMP保护血管内皮细胞对阿霉素导致的endotheliotoxicity;2)是否上调14-3-3γ表情,磷酸化的坏(S112)和随后的易位的bcl - 2的线粒体参与保护TMP对endotheliotoxicity阿霉素引起的;3)的改变是否14-3-3γbcl - 2 / TMP可能影响线粒体氧化应激引起的,阿霉素引起的血管内皮endotheliotoxicity;4)是否改善线粒体功能由14-3-3γ/ bcl - 2参与TMP对阿霉素引起的endotheliotoxicity保护血管内皮。

2。材料和方法

2.1。材料、细胞和动物

腺病毒垫/ 14-3-3γ成分和消极的控制(垫/ scrRNAi)来自GeneChem有限公司有限公司(上海,中国)。TMP、强力霉素、去氧肾上腺素(PE),硝普酸钠(SNP),乙酰胆碱(Ach)、苍术苷(Atr),和ciclosporin (CsA)从Sigma-Aldrich购买(猫。95162号,D1515 P1240000、PHR1423 PHR1546, A6882, C1832,圣路易斯,密苏里州,美国)。从MedChemExpress Mitoquinone (MitoQ)(猫。不。中国上海,hy - 100116)。Selleck abt - 737(猫。不。S1002,休斯顿,德克萨斯州,美国)。抗体针对14-3-3γ购买从圣克鲁斯(猫。不。美国sc - 69955,圣克鲁斯,CA)。以挪士,bcl - 2抗体针对的,坏phospho-S112以挪士phospho-S1177,细胞色素C (cyt C)、COX4和β肌动蛋白从Abcam购买(猫。不。ab196495, ab129192、ab5589 ab184154、ab16381 ab33985 ab8229,剑桥,英国)。辣根peroxidase-conjugated免疫球蛋白是杰克逊免疫研究(猫。107-035-142号西树林,PA,美国)。

人类脐静脉内皮细胞从中国购买(通过传代形成细胞细胞系的基础设施资源(上海,中国)。雄性昆明小鼠(8 - 10周大,重量- g)南昌大学动物中心提供的(南昌,中国)。

所有实验协议进行按照美国国立卫生研究院(NIH)实验动物保健和使用指南(NIH出版85号- 23,1996年修订),和南昌大学的伦理委员会批准的(2019 - 0006)。

2.2。体内实验

老鼠被安置每笼(2)在一个受控环境温度为22°C,湿度50%,12小时光/暗周期。水是提供给动物随意。

2.2.1。体内实验分组

如图175小鼠随机分为5组:强力霉素组老鼠经常喂3周;然后腹腔内注射六注射2.5毫克/公斤阿霉素在3周的累积剂量15毫克/公斤(7];TMP +阿霉素组小鼠接种6毫克/公斤TMP [30.6周通过胃内的管理),每天一次,一个小时前阿霉素管理;TMP +阿霉素+垫/ 14-3-3γshrna组小鼠治疗方案与TMP +阿霉素组4周,然后注射垫/ 14-3-3γshrna腺病毒;TMP +阿霉素+ abt - 737组小鼠治疗方案与TMP +阿霉素组5周,随后通过一次每日腹腔内注射abt - 737 (20μ克/公斤)(31日),前一小时TMP管理,1周;和对照组,老鼠给同等体积的磷酸缓冲盐(PBS)使用方法类似于TMP +阿霉素组。

2.2.2。通过尾静脉基因传递

14-3-3γ击倒模型构建在昆明小鼠通过尾静脉注射重组腺病毒包含成分的14-3-3γ22628年基因(基因库ID,目标序列:GCTTCTGAGGCAGC GTATA)如前所述[32]。简单地说,垫/ 14-3-3γshrna腺病毒(2×10¹¹点状单位/毫升,200μl)是尾静脉注入。两个星期post-injection,老鼠被杀死。

2.2.3。血液和组织的集合

在实验的最后,老鼠与氯胺酮麻醉使用腹腔内注射(100毫克/公斤)和甲苯噻嗪(8毫克/公斤)。然后,在毛细管肝素化收集的血液通过心脏穿刺并立即离心10分钟在3000 rpm和25°C血清分离。胸主动脉环收获在冰冷的生理盐水(PSS: 0.288 g不₂阿宝₄,1.802克葡萄糖,丙酮酸钠0.44克,20.0 g BSA, 21.48克氯化钠,氯化钾0.875克,0.7195 g MgSO₄7小时₂0,13.9 g拖把钠盐,每公升0.185 g EDTA溶液的pH值7.4)和评估血管反应性如前所述[33]。

2.2.4。生化测定和组织损伤指标

组织损伤的生物标志物,血清乳酸脱氢酶(LDH)的活动和肌酸激酶(CK)测量标仪(美国大力神Bio-rad 680年,CA)根据规范各自的分析工具(南京建成生物工程研究所有限公司、南京,中国)。

铁降低抗氧化能力(收紧)试验(细胞生物学实验室,Inc .圣地亚哥、钙、美国),基于减少tripyridyltriazine铁(Fe^{3 +}铁(Fe -TPTZ)复杂^{2 +}-TPTZ),被用来评估小鼠的血清的抗氧化潜力的吸收560海里(29日,34]。总之,5μl血清和15μl与75年去离子水涨跌互现μl收紧颜色解决方案。混合物是孵化为30分钟25°C和其OD测量由分光光度计波长560纳米。氯化亚铁标准被用来准备的标准曲线。样品的浓度,表明抗氧化潜能,获得了使用标准曲线的方程。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)是至关重要的指标评估氧化应激(29日,35]。抗氧化剂酶活性和脂质过氧化水平对小鼠血清测定根据制造商的指示。总之,收集上清液测定使用标。MDA工具包用于测量水平、SOD、猫,氧化酶活动是购自南京建成Bioenginering研究所有限公司(中国南京)。

2.2.5。Hematoxylin-Eosin(圆))染色和终端原位缺口末端标记(TUNEL)测定

刚收获的胸主动脉缓冲福尔马林溶液固定在10%嵌入在石蜡和分为5μ米厚的部分被安装到玻璃幻灯片。评估形态学变化,他走时染色。此外,检测细胞凋亡,TUNEL (WI Promega,麦迪逊,美国)染色法进行根据制造商的指南(7]。

2.2.6款。血管反应性

血管收缩和放松测定如前所述[33,36]。短暂,胸主动脉肌动描记器被安置在压力室(DMT Inc .,亚特兰大,乔治亚州,美国),包含温暖PSS,空心和安全玻璃微量吸液管,和平衡在50毫米汞柱的管腔内的压力,一个小时在37°C。首先,我们确认保持动脉收缩苯肾上腺素(PE: 10^-10年-10年⁴M)实验,直到没有自发扩张期间发生收缩时期(例如5 - 12分钟)。然后,样本限制增加剂量的PE (10⁶M,关于电子商务₅₀),立即紧随其后的剂量反应endothelium-dependent扩张器乙酰胆碱(课时:10⁹-10年⁴米)。后洗脱期和之后pre-constriction PE (10⁶米),剂量反应到endothelium-independent扩张器硝普酸钠(SNP: 10^-10年-10年⁴米)。扩张的百分比计算基于每个动脉的最大腔的直径。

2.2.7。测定一氧化氮(NO)的内容

没有内容的小鼠的血清或培养基间接反映了亚硝酸盐和硝酸盐的内容37]。由曲霉菌硝酸盐转化为亚硝酸盐亚硝酸盐还原酶,和亚硝酸盐的总体水平是衡量使用格里斯试剂(G4410 Sigma-Aldrich),吸光度的决心在540海里。没有内容的样本提出了大量的亚硝酸盐和硝酸盐(μ米)每克蛋白质的血清或每升培养基。

2.2.8。免疫印迹分析

蛋白质的总量从胸主动脉样本,以及蛋白质的总量和HUVECs的线粒体蛋白质,使用蛋白分离提取工具包(Applygen技术公司,北京),分别。蛋白质浓度由布拉德福德决定方法。共有50个μ克的蛋白质被变性SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离和转移到聚偏二氟乙烯膜。以5%的脱脂牛奶膜被阻塞,洗,孵化主要抗体针对14-3-3γ(1:1000),bcl - 2(1: 500),坏phospho-S112(1: 500),以挪士(1:1000),以挪士phospho-S1177 (1: 1000),cyt C(1:1000),β肌动蛋白(1:2000),COX4(1: 1000),然后用辣根peroxidase-conjugated二级抗体孵化。随后,膜被孵化的增强化学发光试剂在室温下2分钟,和蛋白质乐队是可视化使用增强化学发光法和分析数量一个软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)7]。

2.3。在体外实验

2.3.1。内皮细胞培养和腺病毒转染

转染化验,HUVECs被种植在high-glucose杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM Gibco-BRL,大岛,纽约,美国)补充10%的热量——灭活胎牛血清(的边后卫,Gibco-BRL)、青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / mL)和培养在37°C公司在湿润的气氛中为5%₂。

腺病毒垫/ 14-3-3γ成分和消极的控制面板/ scrRNAi(成分的14-3-3γ基因,目标序列:GCTTCTGAGGCAGCGTATA和消极的控制序列:TTCTCCGAACGTGTCACGT)转染到HUVECs新鲜DMEM培养补充15%的边后卫。48小时后转染效率约为85%。转染细胞孵化在37°C、O 95%₂,5%的公司₂2小时之前使用的实验。

2.3.2。实验设计(图1)

(1)阶段。首先,我们调查是否TMP-treated HUVECs证实对阿霉素诱导的endotheliotoxicity保护作用。,TMP-treated决心的最佳浓度。

细胞随机分为以下实验组:HUVECs在对照组培养在正常情况下(37°C, 95%啊₂和5%的公司₂)在整个实验;HUVECs强力霉素组治疗1μ米阿霉素48小时(7];HUVECs TMP +阿霉素组类似于阿霉素治疗组,但与不同浓度的细胞也co-incubated TMP(10、20、40或80μM) 48小时。最后的实验,细胞生存能力和LDH活性测定。

(2)B阶段。接下来,我们进一步确认是否14-3-3γbcl - 2表达和活动可能影响TMP对阿霉素endotheliotoxicity的保护作用。

细胞被随机分为五组。其中,控制,阿霉素组对上述(1)HUVECs TMP +阿霉素组类似于阿霉素治疗组,但细胞也co-incubated 20μM TMP 48小时,而细胞TMP +阿霉素+垫/ 14-3-3γshrna组治疗垫/ 14-3-3γshrna TMP治疗前2小时;HUVECs TMP +阿霉素+ abt - 737组治疗与TMP +阿霉素组相似,但这些细胞也co-incubated 2μabt - 737一个小时(31日]。最后的实验,细胞活力、细胞凋亡、LDH和半胱天冬酶3活动,没有水平的培养基,14-3-3的表达γ,坏phospho-S112以挪士,以挪士phospho-S1177 HUVECs溶解产物中,线粒体和bcl - 2表达测定。

(3)C阶段。最后,我们研究如何TMP-treated HUVECs维持线粒体功能和可能的机制。

总之,HUVECs被随机分为六组。其中,HUVECs控制、强力霉素和TMP +阿霉素组与上述(2)治疗。HUVECs TMP +阿霉素+ Atr组治疗类似于细胞TMP +阿霉素组,但也co-incubated 2小时50μM Atr (38];HUVECs在阿霉素+ CsA / MitoQ组类似于阿霉素治疗组,但细胞也co-incubated 1μM CsA / 0.5μM MitoQ 48小时,分别39,40]。

最后的实验,细胞生存能力和LDH活性,耗氧速率(OCR),细胞外酸化率(ECAR),细胞内线粒体ROS生成,NAD的水平⁺,NADH、谷胱甘肽和GSSG /细胞内的线粒体,线粒体膜电位(MMP),线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物),和cyt C从线粒体释放到细胞质HUVECs测定。

2.3.3。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-Yl 5 - (3-Carboxymethoxyphenyl) 2 - 2 h (4-Sulfophenyl)四唑(MTS)测定

细胞被镀在96 -孔板的密度1×10⁴在37°C细胞/嗯,孵化20μl MTS(5毫克/毫升,Promega,麦迪逊,WI,美国在100年μl的DMEM培养基2小时。接下来,每个的吸光度被标以490海里(Bio-Rad680)。吸光度是直接与活细胞的数量成正比。

2.3.4。测量的LDH和Caspase-3活动

在HUVECs, LDH的胞内酶释放到培养基对细胞损伤(7]。在这项研究中,在实验的最后,上层的收集,LDH活动是由一个微型板块读者(Bio-rad 680)根据LDH测定设备的规格(南京建成生物工程研究所有限公司)。

Caspase-3活动以孤立的胞质分数HUVECs如前所述[7]。短暂,caspase-3活动是由测量的乳沟caspase-3-specific衬底(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) -p-nitroanilide(机构)(DEVD-pNA)]使用caspase-3活动分析工具包(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。

2.3.5。内皮细胞凋亡的评估使用膜联蛋白V-FITC和π

评估细胞凋亡的执行HUVECs使用膜联蛋白V-EGFP /π凋亡检测设备(BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)。分析了膜联蛋白V-stained细胞使用Cytomics FC500流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)和DCF荧光测定,这是一个细胞损伤指数(7]。

2.3.6。测量细胞内线粒体ROS

细胞内和线粒体ROS生成测量使用DCFH-DA或mitoSOX探针如前所方法(41]。总之,细胞收获与血清DMEM媒体和清洗。然后,细胞无血清培养系统混合媒体包含10μM DCFH-DA探测器(分子探针,尤金,或者美国)或5μM mitoSOX探测器(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和孵化37°C在黑暗中与轻微的搅拌30分钟每5分钟。随后,收集细胞颗粒,与PBS洗了三次,500年resuspendedμ流式细胞术分析L PBS (Cytomics FC500)。从10000年绿色荧光细胞诱导有488或510海里。流乔软件被用来分析平均荧光强度。

2.3.7。OCR和ECAR的评价

线粒体呼吸是线粒体的功能生物能学能力的指标和总体健康细胞(29日,42]。在目前的研究中,我们使用了一个XFp细胞外流量分析仪(美国海马生物科学、北Billerica MA)评价OCR,测量作为时间的函数。总之,HUVECs被播种在海马细胞培养miniplates XFp 5000细胞/密度好,接受相应的治疗。经过分析的基础呼吸,寡霉素(复杂V抑制剂,10μ(M), carbonyl-cyanide-4) - trifluoromethoxy苯腙(FCCP, permeabilizes内线粒体膜质子,2μ米),鱼藤酮/抗霉素A(抑制剂的复杂我和三世,0.5μ0.5米/μ米)按顺序添加。井没有细胞作为背景和使用规范化的阅读每一个板的背景噪音。OCR规范化每口井的总蛋白。

ECAR,监测糖酵解函数表示为英里/小时/分钟,决心。测量过程是OCR上面描述的相似。基底ECAR测量后,葡萄糖溶液(80毫米),寡霉素(5毫米),和2 dg(100毫米)添加顺序确定糖酵解,糖酵解能力,和糖酵解储备(42]。

2.3.8。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的分离线粒体分数和评估线粒体

最后的实验,收集HUVECs PBS和洗两次冷。细胞在1×resuspended胞质提取缓冲混合和均质在冰上。混合了冰面上15分钟和离心机1300 g×5分钟在4°C。然后将上层清液转移到一个新的管和旋转17000 g×10分钟在4°C沉淀的线粒体。这种颗粒在15% Percoll resuspended(猫。不。P4937、σ-奥尔德里奇)和分层Percoll 22%的预成型的梯度,然后分层Percoll到50%。Percoll密度梯度离心在17000 g×10分钟在4°C,收集和纯化的线粒体在50%和22%之间的界面梯度。纯化的线粒体样本离心机在7000 g×10分钟在4°C (27,43]。

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸存在于一个氧化(NAD⁺)形式和降低(NADH)形式。总NAD⁺在纯化的线粒体和NADH水平样本量化使用河畔⁺按照制造商的指示/ NADH量化工具(Biovision,苗必达、钙、美国)43]。总NAD⁺将所有NAD / NADH水平进行评估⁺样品的NADH使用NAD循环酶混合和NADH开发者工具包中。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸仅减轻线粒体样品浓度是通过加热到60°C分解NAD 30分钟⁺。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸在OD 450海里使用分光光度计测量标仪(美国BioTek乐器,Winooski VT)。已知浓度的纯化NADH被用来生成标准曲线和计算线粒体浓度。NAD的值⁺是由减去总NAD NADH-only价值⁺/ NADH的价值。

2.3.9。GSSG评估细胞内谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率

减少谷胱甘肽是最丰富的胞内硫醇。细胞内氧化还原状态的水平反映氧化(谷胱甘肽)谷胱甘肽(GSSG)和减少。谷胱甘肽(GSSG细胞健康的比例也是一个重要的指标(44,45]。测量根据制造商的说明进行使用上层清液从细胞治疗后细胞溶解。GSSG谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率分析包买来Beyotime研究所生物技术(海门、江苏、中国)。

2.3.10。MMP的评估

流式细胞术分析是用来评估使用荧光指示剂MMP的损失,JC-1(5,5’, 6日6 ' -tetrachloro-1, 1 ', 3、3 ' -tetraethyl-benzimidazole carbocyanine碘,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)。HUVECs收获和细胞悬液与JC-1孵化(200μ在37°C M) 20分钟之后,两轮与PBS洗涤去除剩余的试剂。荧光测量与Cytomics FC500流式细胞分析仪与初始激发和发射波长(例/ em) 530和580海里(红色),紧随其后的是交货/ em 485/530 nm(绿色)。红色比绿色荧光强度的细胞显示MMP的水平(7]。

2.3.11。注射的mPTP药物

注射细胞凋亡,mPTP药物和Ca上起着重要的作用^{2 +}注射诱导线粒体肿胀试验可用于确定mPTP药物。孤立的线粒体在肿胀resuspended缓冲区(氯化钾120毫米,Tris-HCl 10 mM,拖把20毫米,KH₂阿宝₄5毫米),涌入96 -微量滴定板。的40μl (CaCl₂每个解决方案(200海里)作为注射兴奋剂的mPTP药物打开,导致线粒体密度稳定下降。每分钟520海里的吸光度测量观察到稳定值。测量注射的程度mPTP药物打开,吸光度的变化计算(7]。

2.4。统计分析

所有的值被表示为手段±均值的标准误差(SEM)。单向方差分析(方差分析)是用来测试的意义不同的生化数据组,其次是事后测试个体差异。结果被认为是重要的价值P< 0.05。

3所示。结果

3.1。TMP-Treated减轻维管组织的阿霉素毒性损伤诱导的小鼠

如图2(一个)不出所料,血清LDH和CK的活动在强力霉素组显著增加(P< 0.01),显著降低TMP-treated (P< 0.01),恢复通常是在结合垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737 (P< 0.01),表明阿霉素引起组织和/或在小鼠器官损伤,TMP可以有效地抵制它,但它依赖于14-3-3γbcl - 2表达和活动。

组织病理学检查老鼠的胸主动脉也证实TMP Dox-induced血管毒性的保护作用。如图2 (c)阿霉素的老鼠,一些炎性变化,如炎症浸润,细胞肿胀,被发现在胸主动脉的组织。然而,组织损伤与TMP-treated显著降低。此外,胸主动脉细胞凋亡的组织化验使用TUNEL染色(图2 (d))。在显微镜,阿霉素组明显提升胸主动脉细胞凋亡的组织,由TMP-treated显著逆转。然而,当结合垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737,上述保护作用的TMP主要是取消了。

如图2 (b)的血清内容没有强力霉素的老鼠低得多(P< 0.01),显著逆转TMP-treated (P< 0.01)。这种变化可能是完全抵消垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737 (P< 0.01)。而且,我们发现以挪士的表达和p-eNOS胸主动脉组织的小鼠,分别。如图3 (c)和3 (g)主动脉组织阿霉素的老鼠,p-eNOS /以挪士比例降低(P< 0.01),显著逆转TMP-treated (P< 0.01),但它可能只有部分抵消垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737 (P< 0.01)。上述结果表明,TMP-treated可以促进以挪士的磷酸化在主动脉组织,增加没有合成,也只有部分依赖于14-3-3γbcl - 2表达和活动。

3.2。TMP-Treated保护血管endothelia对阿霉素的Endotheliotoxicity老鼠的函数

一般来说,endothelium-dependent膨胀的控制实验(EDD) Ach和endothelium-independent扩张与SNP (EID)值得注意的标准判断是否正常血管内皮的功能(33]。如数据所示3(一个)和3 (b)EDD,阿霉素组明显受损(P< 0.01)和曲线下面积(AUC)量效关系下降到34.3%的对照组(P< 0.01)。TMP-treated改善EDD这样扩张在几个剂量的Ach(显著增加P< 0.01),AUC也恢复到对照组的78.6% (P< 0.01),但它也可能主要是扭转垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737至对照组的42.5%和45.5%,分别为(P< 0.01)。同样,开斋节强力霉素组明显受损,AUC是28.3%与对照组相比,TMP-treated改进也可以反向相关的变化(P< 0.01,图S1A和B部分的补充材料)。这表明TMP-treated可以显著减轻血管内皮的损伤,阿霉素毒性,它也有相当大的缓解伤害血管平滑肌,当然,这也取决于14-3-3γbcl - 2表达和活动。

如图3 (c)- - - - - -3 (f)很有意思,在主动脉组织TMP-treated上调14-3-3γ表达和促进了坏的磷酸化,尤其是upregulation线粒体bcl - 2表达的(P< 0.01)。然而,abt - 737,一个特定的bcl - 2抑制剂(31日),并不影响老年病的14-3-3γ表达和坏的磷酸化TMP-treated (P> 0.05),但显著降低TMP-treated bcl - 2表达的线粒体(P< 0.01)。

3.3。TMP-Treated保护HUVECs Endotheliotoxicity由阿霉素

细胞生存能力和LDH泄漏通常作为索引的细胞损伤7]。评估TMP-treated的影响,我们测试了不同浓度的TMP-treated HUVECs上受到阿霉素毒性。如图S2A和B部分的补充材料,HUVECs受到阿霉素毒性表现出细胞生存能力下降P< 0.01)和LDH活性的增加(P< 0.01)。TMP-treated显著增加细胞活力,减少LDH活动(P< 0.01)浓度的方式。最优的浓度TMP-treated决心是20μM×选择后续实验。有趣的是,co-treatment垫/ 14-3-3γ主要成分或abt - 737废除TMP-treated(数据的保护作用4(一)和4 (b),P< 0.01)。

与对照组相比,细胞生存能力和LDH活性没有改变仅当使用TMP, CsA, MitoQ,垫/ scrRNAi, TMP +垫/ 14-3-3γ成分、TMP +垫/ scrRNAi TMP + abt - 737, TMP + Atr (P> 0.05),但治疗垫/ 14-3-3γ成分,abt - 737或Atr,细胞生存能力低和LDH活性高于对照组(P< 0.01,图S3A和B部分的补充材料),表明14-3-3γ注射bcl - 2表达,活动,和mPTP药物关闭保持正常HUVECs功能起到至关重要的作用。这也是理由垫/ 14-3-3γshrna +阿霉素,abt - 737 +阿霉素,Atr +阿霉素组与强力霉素组(P< 0.01)。但细胞生存能力和LDH活性没有改变当使用垫/ scrRNAi +阿霉素(P> 0.05,图S4A和B部分的补充材料),这表明可能加剧HUVECs受伤使用垫/ 14-3-3γ成分会使14-3-3γbcl - 2表达,或abt - 737抑制,或注射Atr打开mPTP药物。然而,垫/ scrRNAi负控制可能不会影响细胞的生存能力和LDH活性。

如图4 (c)caspase-3活动,阿霉素组相比显著增加,对照组(P< 0.01),而TMP-treated显著抑制caspase-3活动相比,阿霉素组(P< 0.01)。caspase-3活动增加对TMP +垫/ 14-3-3γ成分或ABT - 737 (P< 0.01)。

HUVECs细胞凋亡的程度是评估使用膜联蛋白V / PI双染色,然后通过流式细胞术分析(图4 (d))。结果表明,与阿霉素组相比,细胞凋亡被TMP-treated显著降低(P< 0.01)。然而,更高的速度观察细胞凋亡的细胞与TMP +垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737 (P< 0.01)。

3.4。TMP-Treated改变了表情,磷酸化,Sublocalization或新陈代谢相关的活性蛋白质HUVECs阿霉素的伤害

如图5(一个)- - - - - -5 (d)在HUVECs TMP-treated表达显著上调14-3-3γ表达和促进了坏的磷酸化,尤其是upregulation线粒体bcl - 2表达的(P< 0.01),TMP +垫/ 14-3-3γ成分可能会完全逆转上述变化。然而,abt - 737对上调14-3-3没有影响γ表达式由TMP和坏的磷酸化(P> 0.05),但显著降低bcl - 2表达引起的线粒体TMP-treated (P< 0.01)。

与对照组相比,14-3-3γ表达式使用垫时并没有改变/ scrRNAi alone-treated,一样使用TMP +垫/ scrRNAi +阿霉素和TMP +阿霉素(P> 0.05,图S5部分的补充材料),这表明垫/ scrRNAi并不影响14-3-3γ作为一个负控制表达式。

如图5(一个),5 (e)和5 (f)在HUVECs p-eNOS /以挪士比显著增加(P< 0.01)TMP-treated之后,没有内容显著增加(P< 0.01)作为后续结果,但是垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737可以部分抵消它(P< 0.01)。上述结果表明,TMP-treated可以促进磷酸化HUVECs以挪士的增加没有合成,也只有部分依赖于14-3-3γbcl - 2表达和活动。

3.5。TMP-Treated保留了细胞内/线粒体ROS生成和HUVECs中和的之间的平衡

以往的经验显示,氧化应激在阿霉素毒性损伤中发挥着关键作用7,8]。首先,我们发现HUVECs治疗1μM阿霉素加1μM CsA (39注射),mPTP药物关闭代理或0.5μM MitoQ [40],mitochondria-targeted CoQ-10抗氧化剂co-incubation,培养基中的细胞生存能力增加,LDH活动减少,这些结果表明CsA和HUVECs损伤造成MitoQ减轻阿霉素毒性。然而,50μM Atr,注射的mPTP药物的开瓶器可以完全颠覆20的保护作用μM TMP,也就是说,它可以减少细胞生存能力和增加培养基中LDH活性(P< 0.01,图A和B S6部分的补充材料)。

增加阿霉素48小时后,细胞内的峰值/线粒体ROS HUVECs明显向右移动,表明显著增加细胞内/线粒体ROS生成的强力霉素组(P< 0.01,图6(一))。此外,添加TMP / CsA / MitoQ co-incubation引起了重大转变细胞内的峰值/线粒体ROS HUVECs向左,表示显著降低细胞内/线粒体ROS生成与强力霉素组相比P< 0.01)。然而,添加Atr co-incubation TMP效果(可能发生逆转P< 0.01),这种注射强烈表明,mPTP药物是打开或关闭,扮演着一个重要的角色在细胞内线粒体ROS生成。

几个小河畔等分子标记⁺/ NADH [43,45)、谷胱甘肽(GSSG (44,46在线粒体/细胞内氧化还原状态的有用指标和氧化还原平衡47]。HUVECs、NADH的内容及谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率显著增加(P< 0.01)和NAD的内容⁺和GSSG NAD⁺/ NADH比率下降(P在TMP治疗(< 0.01)6 (b)和6 (c));这些结果类似于通过CsA和MitoQ治疗。这一结果进一步证实,TMP, CsA或MitoQ等可以显著减少氧化应激和线粒体ROS生成。还发现直接影响注射与线粒体mPTP药物打开Atr,注射的mPTP药物刀,几乎可以完全取消20的效果μTMP (P< 0.01)。这种现象符合上述细胞生存能力和LDH活性的变化。

通常,在动物血清、MDA含量、SOD,猫和氧化酶活动确定评估氧化应激的水平(7,29日],收紧试验是用来评估潜在的抗氧化剂29日,34]。在这项研究中,如表所示1TMP-treated后,小鼠的血清SOD,猫和氧化酶活动明显增加,MDA含量减少(P< 0.01)。符合低水平的氧化应激,收紧结果显示高的抗氧化潜力TMP集团(P< 0.01),然而,上述保护作用可以主要中和TMP-treated垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737 (P< 0.01)。

3.6。在HUVECs TMP-Treated维持线粒体功能

探索TMP的保护作用线粒体呼吸、OCR测量使用HUVECs海马XF分析仪。细胞治疗的OCR 20μM TMP仍高于接受1μ阿霉素(P< 0.01,图7(一))。如图7 (b)之前,基底呼吸寡霉素,ATP生产添加寡霉素后,添加FCCP后最大呼吸,呼吸产能闲置后的鱼藤酮/抗霉素在HUVECs TMP治疗明显高于强力霉素治疗。质子峰,然而,与TMP治疗显著降低阿霉素治疗(P< 0.01)。

ECAR被用来确定HUVECs糖酵解率的变化。如图7 (c)的ECAR TMP-treated细胞仍高于阿霉素(P< 0.01)。基底的糖酵解和糖酵解能力显著高于在HUVECs TMP-treatment寡霉素后注入(P< 0.01)。相比之下,non-glycolytic酸化略有增加(图7 (d))。这些发现表明,HUVECs的能量需求增加,细胞内酸中毒纠正TMP治疗后由于更好的维护的线粒体。

MMP的损失发生在细胞凋亡的早期阶段。在活细胞中,线粒体基质JC-1积累,只存在于其单体的形式在凋亡和坏死细胞由于MMP的损失(7]。如图8(一个)后MMP一直TMP-treated因为MMP的峰值水平显著转移到正确的(P< 0.01)。同样,CsA或MitoQ治疗也导致显著增加MMP的(P< 0.01),但Atr, co-incubation,导致MMP的大量损失,因为高峰的MMP转向左边(P< 0.01)。

mPTP打开是细胞凋亡的主要原因。注射的状态mPTP药物是由Ca^{2 +}全身肿胀,线粒体(7]。图8 (b)显示,与阿霉素组相比后注射的mPTP药物抑制TMP-treated (P< 0.01)。CsA或MitoQ治疗也会导致类似的效果;然而,ATR,注射TMP-treated开启mPTP药物的效果正好相反(P< 0.01)。

在线粒体的释放cyt C的胞质HUVECs细胞免疫印迹分析评价。如图8 (c)、阿霉素损伤导致显著的积累cyt C在胞质(P< 0.01)和cyt C在胞质显著降低细胞TMP治疗时,或CsA、MitoQ (P< 0.01),但与ATR, TMP-treated被取消的影响(P< 0.01)。

4所示。讨论

阿霉素是一种化疗药物治疗,包括乳腺癌,膀胱癌,卡波济氏肉瘤、淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(1]。然而,阿霉素剂量依赖性的方式可能会导致不可逆转的心肌病(2,10- - - - - -12]。除了毒性,阿霉素引起的多种细胞毒性已逐渐引起了极大关注,特别是内皮功能障碍(3,4,48,49]。已经指出,阿霉素心肌和血管内皮细胞的毒性往往伴随着甚至相互因果关系(3- - - - - -6]。在这项研究中,我们可以观察阿霉素的endotheliotoxicity血管内皮是否在活的有机体内或在体外是否相关酶索引、内皮功能指标细胞生存,和凋亡指数或形态指标(数据2- - - - - -5)。

TMP是纯化粉末的主要生物活性成分当归wallichii(14]。最近,人们发现了丰富的TMP在成熟的醋和老醋(15]。它已经探索了许多药物TMP的活动,如清除自由基,阻断钙超载,保护线粒体,改善能量代谢,抑制细胞凋亡,诱导cytoprotection等等(15- - - - - -17]。许多研究已经表明,TMP及其衍生物或兼容salvianic酸/白藜芦醇具有心脏保护心肌缺血再灌注后神经保护/功能缺血性中风GSK3通过干扰PI3K / Akt /β,PGC1α/ Nrf2, BDNF / Akt通路分子,调控Nrf-2 HO-1表达式,维护Ca^{2 +}体内平衡,抑制炎症反应,等。(18- - - - - -20.,50- - - - - -52]。一些研究人员已经表明,TMP和处方如上所述可以减弱伤害Dox-induced毒性和肾毒性通过抑制氧化应激、细胞自噬和细胞凋亡53,54]。TMP和处方也可以逆转多药耐药性阿霉素诱导的乳腺癌,膀胱癌,通过调节肝细胞癌的表达和功能P-gp, MRP2, MRP3, MRP5, MRP1,销售税,bcl - 2, TOPO-II,或直接提高阿霉素的抗癌效应(55- - - - - -58]。在这项研究中,TMP扭转Dox-endothelio -毒性引起的血管内皮损伤可以通过减少证实血清LDH和CK活动,维护EDD,导致caspase-3活动减少,血管内皮细胞的凋亡率,和组织病理学变化(在活的有机体内,数据2和3)。此外,TMP增加细胞活力,减少LDH和caspase-3活动,和凋亡率(在体外,数据4和5)。这些结果表明,TMP可以逆转或减轻阿霉素毒性损伤的血管内皮在活的有机体内和在体外。

研究表明,TMP是一个多目标、多机制的成分(14),调节信号通路和影响特定蛋白的表达和活性是其突出的机制之一(14- - - - - -17]。我们以前的工作也发现TMP可以调控的14-3-3γbcl - 2表达,使磷酸化坏(S112),把线粒体,改善线粒体功能、减少心肌细胞凋亡对有限合伙人最终伤害(20.]。巧合的是,在这项研究中,两种在活的有机体内和在体外TMP对血管内皮的保护作用,可以显著调控的14-3-3γ表达式,使磷酸化坏(S112)和bcl - 2表达,特别是在线粒体。然而,垫/ 14-3-3γ成分,腺病毒推倒胞内14-3-3γ表达,不仅摧毁了14-3-3γ表达和抑制磷酸化不好,但也会大大降低线粒体bcl - 2表达(数字3 (c)- - - - - -3 (f)和5(一个)- - - - - -5 (d))。同时,TMP对血管内皮的保护作用(数据丢失2- - - - - -5)。abt - 737,有趣的是,一个特定抑制剂的bcl - 2,不能改变14-3-3的老年病γ表达,促进磷酸化。然而,它可以取消TMP的bcl - 2表达的影响线粒体(数字3 (c)- - - - - -3 (f)和5(一个)- - - - - -5 (d))及其对血管内皮的保护作用(数字2- - - - - -5)。研究已经证实,bcl - 2和坏通常结合形成一个复杂的在细胞质中59]。当刺激某些刺激,在ser - 112和/或ser - 136网站,14-3-3s使磷酸化坏,bcl - 2分离的复杂和把针对线粒体产生相应的生理效应(60]。结合上面的前辈和我们自己的结果,我们可以得出结论,TMP可以显著调控的14-3-3γ表达式。由于阿霉素毒性,14-3-3γ磷酸化坏,bcl - 2版本,把针对线粒体,逆转或减轻血管内皮损伤。换句话说,TMP对阿霉素的endotheliotoxicity取决于14-3-3γbcl - 2表达和活动。此外,一些研究发现TMP诱发的磷酸化以挪士Ser1177和保护心肌61年),在这项研究中,垫/ 14-3-3γ成分或abt - 737不能完全抑制或取消TMP改善p-eNOS /以挪士比的影响,没有内容(数据2 (b),3 (g)和5 (e),5 (f)),或部分TMP的影响并不完全取决于on14-3-3γbcl - 2表达和活动。

越来越多的证据表明,在Dox-induced细胞毒性ROS生成触发后续所引起的病理生理变化(3- - - - - -6,10- - - - - -12]。研究表明,阿霉素积累通过减少氧化还原循环复杂我线粒体电子传递链(等),从而增加活性氧生成(62年]。此外,线粒体NADH-dependent酶减少相应的半醌自由基,阿霉素进行氧化还原周期形成超氧化物自由基和过氧化氢63年]。在这项研究中,我们发现老鼠注射阿霉素后,抗氧化潜力削弱了(表1收紧),氧化应激水平的提高(表1、MDA含量、SOD、猫和氧化酶活动)。在HUVECs被强力霉素治疗,细胞内/线粒体ROS生成显著增加,河畔⁺、GSSG河畔⁺/ NADH增加、NADH、谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG减少,MitoQ,一个mitochondria-targeted CoQ-10抗氧化剂,能完全扭转上述变化(图6),这表明氧化应激增加负责HUVECs损伤,此外,它提供了实验依据“过度线粒体ROS来自”(62年]。这个结果与主流文学的报告是一致的。随后,TMP可以显著逆转阿霉素引起的氧化压力的增加,导致抗氧化潜力增强,氧化应激的程度被削弱(在活的有机体内、表1),显著降低细胞内/线粒体ROS生成,NADH的显著增加,谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG,明显降低在河畔⁺、GSSG河畔⁺/ NADH (在体外,图6)。更有趣的是,上述影响MitoQ TMP非常类似,CsA,注射了mPTP药物关闭代理,并且可以完全逆转的Atr,注射的mPTP药物刀(图6)。人们普遍认为,TMP有一定的抗氧化能力在细胞质中12,17]。没有证据表明TMP可以在线粒体像MitoQ清除自由基。因此,它是不合适的解释上面的TMP的直接抗氧化能力的影响。考虑到相似性TMP和CsA,上述效应的逆转与Atr注射TMP打开后mPTP药物,我们可以使用“ROS-induced ROS发布”(RIRR)假说来解释它。假设[64年)表明,当线粒体ROS增加,MMP注射变得不稳定和mPTP药物不断打开,然后线粒体肿胀和破裂,不可逆转损害线粒体。因此,ROS从它的矩阵被释放到胞质和相邻的正常的线粒体迅速吸收,导致相邻的线粒体的变化相似,像积极的反馈放大,最终导致细胞凋亡(65年]。注射因此,mPTP药物在RIRR开放中扮演一个重要角色,注射和ROS是最重要的刺激mPTP药物打开(66年),形成一个恶性循环。TMP可以促进bcl - 2对线粒体的易位。CsA、注射TMP或mPTP药物稳定MMP抑制RIRR机制,抑制ROS破裂(数字6和8),终止恶性循环,减弱最终阿霉素引起的血管内皮的损伤。

线粒体是多功能的细胞器,并能主动或被动驱动细胞功能障碍或消亡29日,67年]。事实上,其结构和功能的完整性是细胞生命的基础(29日,68年]。在这项研究中,当TMP帮助bcl - 2可能促使在线粒体,线粒体功能显著改善。这些包括:线粒体呼吸和糖酵解增加函数(氧化磷酸化和ATP生产)的能力,纠正细胞内酸中毒、归一化能量代谢(图7),稳定MMP注射抑制mPTP药物打开,明显减少了cyt C释放到细胞质(图8)。因此,我们可以得出结论,线粒体是终极目标细胞器TMP从阿霉素毒性保护血管内皮。

5。结论

总之,Dox-induced过度线粒体ROS生成,激活RIRR机制,弱化MMP注射开放mPTP药物,诱导活性氧破裂,导致线粒体功能障碍,进而损害血管内皮。TMP调节14-3-3γbcl - 2表达血管内皮细胞,促进了易位的线粒体,注射封闭mPTP药物,维持MMP抑制RIRR机制,抑制氧化应激,从而改善线粒体功能,缓解Dox-induced endotheliotoxicity(图9)。

缩写

哦:	乙酰胆碱
方差分析:	方差分析
Atr:	苍术苷
AUC:	曲线下的面积
猫:	过氧化氢酶
CK:	肌酸激酶
客服人员:	Ciclosporin一
cyt C:	细胞色素C
DCFH-DA:	6-carboxy-2 ' 7 ' -二乙酸Dichlorodihydro-flurescein
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
阿霉素:	阿霉素
ECAR:	Extracelluar酸化率
EDD:	Endothelium-dependent扩张
开斋节:	Endothelium-independent扩张
以挪士:	内皮细胞一氧化氮合酶
的边后卫:	胎牛血清
收紧:	铁降低抗氧化能力
谷胱甘肽:	减少谷胱甘肽
氧化酶:	谷胱甘肽过氧化物酶
GSSG:	氧化谷胱甘肽
):	Hematoxylin-eosin染色
HUVECs:	人类脐静脉内皮细胞
JC-1:	5、5 ' 6 6 ' -tetrachloro-1, 1 ', 3、3 '四乙基的——benzimidazolo carbocyanine碘
LDH:	乳酸脱氢酶
有限合伙人:	脂多糖
MDA:	丙二醛
MitoQ:	Mitoquinone
MMP的:	线粒体膜电位
mPTP:	Mitochonondria渗透过渡孔
河畔+:	氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
NADH:	还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
没有:	一氧化氮
光学字符识别:	耗氧速率
PBS:	磷酸缓冲盐
体育:	苯肾上腺素
PSS:	生理盐水
RIRR:	ROS-induced活性氧释放
ROS:	活性氧
扫描电镜:	均值的标准误差
SFN:	萝卜硫素
SNP:	硝普酸钠
SOD:	超氧化物歧化酶
TUNEL:	末端转移酶d UTP缺口末端标记
TMP:	四甲基吡嗪。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究支持由中国自然科学基金会(№:21467017、81660538、81660538)和江西应用研究和培养计划(20181 bbg78059)。

补充材料

图S1: TMP对血管反应性的影响小鼠的胸主动脉(endothelium-independent扩张,宰牲节)。(一)Endothelium-independent扩张(EID)胸主动脉条。(B)曲线下的面积的开斋节胸主动脉条。数据均值±SEM。十五个人实验。答:P < 0.01,而对照组;b: P < 0.01,与阿霉素组;c: P < 0.01,与TMP +阿霉素组。图S2: TMP保护HUVECs endotheliotoxicity由阿霉素。TMP-treated显著增加细胞活力,减少LDH活性浓度的方式(P < 0.01)。 (A) Histogram of the cell viability. (B) Histogram of the LDH activity. Data are presented as the mean ± SEM for eight individual experiments. Data are presented as the mean ± SEM for eight individual experiments. a: P<0.01, versus control group; b: P<0.01, versus prior dosage. Figure S3: Effects of TMP/CsA/MitoQ, or downregulated 14-3-3γbcl - 2表达或抑制活性的细胞生存和正常HUVECs的LDH活性。细胞生存能力和LDH活性没有改变仅通过使用MP, CsA, MitoQ,垫/ scrRNAi, TMP +垫/ 14-3-3γ成分、TMP +垫/ scrRNAi TMP + abt - 737和TMP + Atr相比,对照组(P > 0.05)。然而,细胞治疗的可行性与垫/ 14-3-3γ成分,abt - 737单独或Atr较低和LDH活性高于对照组(P < 0.01),表明14-3-3γ注射bcl - 2表达,活动,和mPTP药物关闭发挥重要作用在维持正常细胞功能,和垫/ scrRNAi负控制不影响细胞的生存能力和LDH活性。(一)直方图细胞的生存能力。(B)直方图的LDH活性。数据提出了均值±SEM八个人实验。数据提出了均值±SEM八个人实验。答:P < 0.01,而对照组。图S4:表达下调的影响14-3-3γbcl - 2表达或抑制活动阿霉素的细胞生存能力和HUVECs LDH活性的损伤。细胞治疗的可行性与垫/ 14-3-3γshrna +阿霉素,abt - 737 +阿霉素,Atr +阿霉素较低和LDH活性高于阿霉素组(P < 0.01),然而,细胞生存能力和LDH活性没有改变当使用垫/ scrRNAi +阿霉素(P > 0.05),表明治疗垫/ 14-3-3γshrna下调14-3-3的表达γ,或者使用abt - 737抑制bcl - 2,或者允许注射Atr打开mPTP药物,从而加重HUVECs受伤,和垫/ scrRNAi负控制不影响细胞的生存能力和LDH活性。(一)直方图细胞的生存能力。(B)直方图的LDH活性。数据提出了均值±SEM八个人实验。答:P < 0.01,而对照组。图S5: TMP的影响,垫/ 14-3-3γ成分和垫/ scrRNAi 14-3-3γ正常HUVECs的表达式。TMP可以显著上调14-3-3γ正常的表达HUVECs垫/ 14-3-3γ成分可以选择性沉默14-3-3有效表达,和垫/ scrRNAi负控制不能影响14-3-3表达式。数据提出了均值±SEM五个人实验。答:P < 0.01,而对照组,b: P < 0.01,与TMP集团图S6:影响TMP / CsA / MitoQ或TMP添加50μM细胞生存能力和LDH活性的Atr HUVECs损伤1μ阿霉素。TMP / CsA / MitoQ 1μ米阿霉素co-treat HUVECs,细胞生存能力增加和LDH活动减少,然而添加50μM Atr能扭转TMP的相关影响。(一)直方图细胞的生存能力。(B)直方图的LDH活性。数据提出了均值±SEM八个人实验。答:P < 0.01,而对照组;b: P < 0.01,与阿霉素组;c: P < 0.01,与TMP +阿霉素组。(补充材料)

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