文摘

氧化应激中起着至关重要的作用在糖尿病血管并发症的发病机理。众所周知,积累先进的糖化终端产品(年龄)和激活受体的年龄(愤怒)诱导持续在维管组织氧化应激。越来越多的证据表明,甘氨酸,最简单的氨基酸,发挥抗氧化和antiglycation效果并改善血管功能。然而,甘氨酸机制保护维管组织免受氧化应激与糖尿病模型没有被调查。在目前的研究中,我们评估是否甘氨酸可以减弱氧化应激,抑制主动脉的年龄/愤怒信号通路体外糖尿病老鼠和人类脐带血管内皮细胞(HUVECs)。我们的研究结果表明,口服甘氨酸政府没有增加内容和改善氧化应激在糖尿病大鼠的血清和主动脉。年龄/愤怒信号通路在糖尿病大鼠的主动脉显著减弱了甘氨酸治疗所体现的减少水平的年龄,愤怒,Nox4, NF -κB p65。甘氨酸的抑制效应的形成年龄与活动和表达的增加主动脉glyoxalase-1 (Glo1),一种至关重要的酶,这种酶降解甲基乙二醛(MG)的主要前体。在MG-treated HUVECs,甘氨酸恢复Glo1功能,抑制年龄/愤怒信号通路,抑制活性氧的生成。此外,减少的形成年龄HUVECs由甘氨酸治疗被Glo1抑制抑制。综上所述,我们的研究提供了证据,甘氨酸可能抑制年龄/愤怒通路和随后的氧化应激通过改善Glo1功能,从而防止糖尿病macrovascular并发症。

1。介绍

血管并发症已成为发病率和死亡率的主要原因在全世界患有糖尿病。氧化应激过程中扮演着重要的角色在糖尿病血管并发症的发病机理1]。完善,形成先进的糖化终端产品(年龄)和随后的信号通路在持续的氧化应激的主要方式,发生在维管组织2,3]。年龄是由非酶的反应还原糖和氨基酸组之间大生物分子,包括蛋白质,核酸,脂质(4]。这个不可逆过程正在加速慢性高血糖和/或氧化应激与糖尿病发生。除了在细胞外基质沉积和招募巨噬细胞在血管5),年龄也绑定到受体的年龄(愤怒)和激活NADPH氧化酶(Nox)和NF -κB (6),从而启动氧化应激和炎症的恶性循环7,8]。年龄是他们的另一个有害的特性在“代谢记忆中的作用。“既然不能逆转的形成年龄,维管组织中积累引发持续的氧化应激,即使高血糖是改善(9]。因此,寻找抑制年龄形成是特别重要的防止氧化应激在糖尿病血管损伤。

甲基乙二醛(毫克),糖酵解的高活性二羰基代谢物,已经越来越被认为是细胞内的主要前体年龄(10]。MG是由乙二醛酶降解系统,一个有效的酶解毒系统,其中glyoxalase-1 (Glo1)是病原反应酶(11]。与谷胱甘肽(GSH)作为辅助因子,Glo1 MG转换成一个中间产品,由glyoxalase-2进一步解毒为乳酸。在糖尿病条件下,Glo1表达式和谷胱甘肽水平降低(12- - - - - -14]。因此,Glo1的功能受损,导致无法控制的时代形成和氧化应激(15,16]。因此,Glo1功能的增强会抑制这种有害的过程中发挥重要作用。

甘氨酸是最简单的氨基酸在哺乳动物中。除了参与合成结构生物分子,甘氨酸作为谷胱甘肽的前辈之一,人体最重要的抗氧化剂之一。糖尿病并发症,对糖化甘氨酸产生抑制的影响,如延缓白内障(17),尽管这个机制尚未明确。最近的研究报道一些保护作用的甘氨酸血管损伤,比如改善内皮功能(18)和恢复血管反应性(13),但甘氨酸的影响在大血管暴露在糖尿病条件没有被调查。antiglycation和抗氧化效果的甘氨酸离开开放的可能性,甘氨酸可能通过抑制工作年龄的形成和抑制激活/愤怒轴,从而防止氧化应激与糖尿病血管并发症。由于甘氨酸恢复血管谷胱甘肽水平的影响(13),我们推测甘氨酸可能对Glo1起到有益的作用函数,从而恢复Glo1抑制年龄形成的能力。

在目前的研究中,我们旨在探讨甘氨酸年龄/愤怒的影响作用的信号通路以及Glo1在糖尿病大鼠的主动脉和人类脐带血管内皮细胞(HUVECs)。我们的目标是增加的数量可能对糖尿病治疗方法可能有用macrovascular并发症。

2。材料和方法

2.1。实验动物

协议和我们的研究过程都是动物实验伦理委员会批准的北京大学第一医院(批准文号:J201613)。

六个男Sprague-Dawley (SD)老鼠被安置在12 h光暗周期。所有的动物都有无限制地饮用水和食物的饮食。两周的适应后,所有老鼠被随机分配到实验组或健康对照组。快速一夜后,实验组是腹腔内注射单剂量链脲霉素(STZ 45毫克/公斤的体重,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。糖尿病(DM)证实了2周后,通过测量血糖水平(个人 被确诊为糖尿病)。实验组进一步分为糖尿病组(参与糖尿病大鼠接受正常的饮用水, )和DG组(糖尿病大鼠接受1% ( / )甘氨酸随意在饮用水13,19), )。同样,健康对照组分为两组:对照组(健康大鼠接受正常的饮用水, )和CG集团(健康老鼠收到1% ( / )甘氨酸随意在饮用水、 )。12周后,所有老鼠与戊巴比妥麻醉和牺牲。胸主动脉很快被删除和存储在-80°C或浸在福尔马林固定。收集血清样本,以确定生化概要文件(7600年自动生化分析仪、日立、东京、日本)和甘氨酸浓度。

2.2。测量血清甘氨酸

血清样本准备使用EZ: faast GCMS自由氨基酸分析工具包(美国Phenomenex托兰斯,CA)和在气相色谱仪分析Spectrometer-QP2010(日本岛津公司,日本京都)根据制造商的指示。条件如下:样本注入使用分裂注入的比率1:10和港口温度为280°C。一个Rtx-5MS列( )用于分离的化合物。最初的烤箱温度设定在100°C,然后提高到300°C的速度10°C / min,然后举行了10分钟。

2.3。组织病理学

胸主动脉在10%福尔马林固定,嵌入在石蜡,切成4μ米的部分。患者部分是沾hematoxylin-eosin())来观察整个变化和测量内膜中层厚度(IMT)。五个随机不重叠的视觉领域的一个部分被捕获在一个奥林巴斯DP71显微镜(放大400倍)。在每个视野,IMT被ImageJ软件测量四个不同的点。一个Verhoeff-Van Gieson染色工具包(DC0059 Leagene,北京,中国)被用来观察中的弹性纤维组织。

2.4。测量的浓度和氧化应激标志物的血清和主动脉

主动脉的样品是用在冰冷的里帕裂解缓冲(P0013 Beyotime,中国上海)和离心机在16000 g 20分钟在4°C。蛋白质浓度测定的皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(热费希尔科学、哈德逊,在北半球,美国)和调整到相同的水平。等量的可溶性主动脉匀浆和血清样本化验,以确定没有代谢物水平(S0021 Beyotime,中国上海),总谷胱甘肽水平(S0053 Beyotime,中国上海)、丙二醛(MDA)水平(S0131 Beyotime,中国上海)和超氧化物歧化酶(SOD)活性(706002开曼化学,安阿伯市密歇根,美国),按照制造商的说明。

2.5。测量的水平

100年μl的可溶性蛋白质样品用移液器吸取了96口井的井非透明的盘子,和年龄的自体荧光是评估在前370海里/ Em 440 nm波长(20.]。年龄酶联免疫试剂盒(MBS261131 MyBioSource,圣地亚哥,美国)也适用于确定年龄的浓度,在制造商的指示。蛋白质浓度的数据规范化。

2.6。免疫组织学

我们跟着王等的方法。21]。主动脉阻断后,一夜之间,部分被孵化与兔抗衰老抗体4°C(1: 200年,ab23722 Abcam,剑桥,英国),兔子anti-RAGE抗体(1:200年,ab3611 Abcam,剑桥,英国),兔子anti-Nox4抗体(1:150年,ab133303 Abcam,剑桥,英国),鼠标anti-3-nitrotyrosine抗体(1:200年,ab61392 Abcam,剑桥,英国),兔子anti-NF -κD14E12 B p65抗体(1:200年,春秋国旅,贝弗利,妈,美国),或鼠标anti-Glo1抗体(1:200年,ma1 - 13029表达载体,沃尔瑟姆,妈,美国)。部分被洗,然后用二次孵化抗体(1:200年,peroxidase-conjugated anti-rabbit (zb - 2301)或anti-mouse (zb - 2305)抗体,ZSGB-BIO,北京,中国)1小时。使用涂颜色了。使用一个奥林巴斯DP71显微镜图像被抓获。染色的平均碘(IOD /区)从5随机领域使用Image-Pro + 6.0软件评估的一节。

2.7。免疫印迹

可溶性蛋白质样本与加载缓冲煮5分钟。等量的蛋白质(30μg)分离使用12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳和electrotransferred到硝化纤维膜。膜被5%的脱脂牛奶和孵化一只兔子anti-RAGE抗体(1:1000年,ab3611 Abcam,剑桥,英国),兔子anti-Nox4抗体(1:1000年,ab133303 Abcam,剑桥,英国),兔子anti-NF -κD14E12 B p65抗体(1:1000年,春秋国旅,贝弗利,妈,美国),或鼠标anti-Glo1抗体(1:3000年,ma1 - 13029表达载体,沃尔瑟姆,妈,美国)一夜之间在4°C。彻底清洗后,膜与二次孵化抗体(1:5000年,peroxidase-conjugated anti-rabbit (zb - 2301)或anti-mouse (zb - 2305)抗体,ZSGB-BIO,北京,中国)在室温下了一个小时。β肌动蛋白作为加载控制(1:3000 TA-09 ZSGB-BIO,北京,中国)。乐队是可视化使用ECL免疫印迹基质(热费希尔科学、哈德逊,在北半球,美国)和量化Image-Pro + 6.0软件。

2.8。测量Glo1活动

Glo1的活动时候根据建立的方法测定et al。22]。样本在PBS和用洗10毫米钠磷酸盐缓冲剂( )。离心后,蛋白质浓度由BCA装备和调整到同一水平在所有样本。在96孔板,125年μl钠磷酸盐缓冲剂(100毫米, ),25μl谷胱甘肽(40毫米),25岁μl毫克(40毫米),70μl微孔水被添加到每个在37°C,孵化15分钟。孵化后,5μl可溶性蛋白质从细胞或主动脉组织添加到每个。在240 nm(吸光度 )监控每2分钟。Glo1活动显示为变化的速率 每毫克的蛋白质。

2.9。细胞培养和生存能力

人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)收购中国国家基础设施的细胞系的资源。HUVECs培养在最低基本媒体(MEM不甘氨酸、葡萄糖5.5毫米,Hyclone,生命科学,匹兹堡,PA,美国有10%的胎牛血清(Gibco,生命科学,宾夕法尼亚州匹兹堡,美国),100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。HUVECs被确定典型的鹅卵石的存在形态和血管性血友病因子(VWF)抗原。

细胞生存能力评估使用CCK-8(细胞计数Kit-8、Donjindo Mashikimachi,日本)。 HUVECs被播种到每一个96孔板。治疗后,每个被轻轻地用磷酸盐(PBS)可能的干扰排除在任何剩余的培养基。10μ和100 l CCK-8解决方案μl新的MEM媒体无酚红被添加到每个。孵化后3小时37°C, 450海里的吸光度测定。

2.10。免疫荧光

HUVECs被播种到盖玻片放置在一个12-well板。治疗后,所有的盖玻片在中性10%福尔马林10分钟,孵化与PBS洗3次,0.1%孵化Triton x - 100试剂10分钟。细胞被封锁在1% BSA 30分钟50和孵化μl兔抗衰老抗体(1:200年,ab23722 Abcam,剑桥,英国)一夜之间在4°C。在PBS广泛的洗涤后,荧光二次抗体的细胞被孵化一个小时在一个黑暗的房间。洗3次后,盖玻片与DAPI安装。数字图像的荧光染色法在奥林巴斯显微镜被抓获。五个随机不重叠的视觉领域的一个部分被抓获计算平均荧光强度。

2.11。估计细胞内活性氧(ROS)

细胞内ROS估计通过流式细胞术使用oxidation-sensitive荧光探针(2 ,7 - - - - - -dichlorofluorescin二醋酸盐、DCFH-DA D6883 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。治疗细胞轻轻洗了PBS和孵化DCFH-DA (10μ在MEM无酚红米)。30分钟后,这些细胞被洗trypsin-EDTA PBS 3倍和消化0.05%。平均荧光强度在488例/ Em 525被流式细胞仪检测。

2.12。统计分析

执行数据的统计分析使用SPSS 20.0(美国芝加哥SPSS Inc .)后发布在别处的方法(21]。定量数据的 错误的手段(正态分布数据)或中位数和四分位范围(非正态的分布式数据)。组之间的差异评估使用单向方差分析(方差分析)正态分布数据,其次是图基的事后考验。此外,克鲁斯卡尔-沃利斯检验被用于非正态的分布数据。一个 值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。甘氨酸对血糖的影响,体重和血清中甘氨酸的水平

在第12周,DM组的血浆葡萄糖水平明显高于对照组( ,表1)。的体重和血清甘氨酸水平的DM组低于对照组( 和 ,分别)。与DM组相比,DG组的血糖水平和体重似乎未受影响,而血清甘氨酸含量显著增加( )。

表1
血浆葡萄糖水平、体重和血清甘氨酸经过12周的治疗水平。
3.2。甘氨酸治疗主动脉组织病理学的影响和血管功能

甘氨酸的影响评估治疗主动脉的结构组织,我们应用)和Verhoeff-Van Gieson染色检查形态变化。他走时染色(图1(一))表明,DM组,主动脉内膜的和内侧层的混乱,而更少的伤害是DG组中观察到。的Verhoeff-Van Gieson染色(图1 (b))表明,弹性纤维在DM组显示严重的分裂和失真。与甘氨酸治疗,弹性蛋白纤维的变形低于DM组,虽然没有完全恢复。

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图1
主动脉组织病理学改变和浓度的四组。(一)代表他染色的图片部分鼠主动脉,放大400倍。(b)的代表图像Verhoeff-Van Gieson染色的部分大鼠主动脉,放大400倍。比例尺显示20μm。(c)血清代谢物水平治疗后12周。 。(d)没有代谢物水平在12周的治疗后大鼠主动脉。 。(e)主动脉内膜中层厚度后12周的治疗。 - - - - - -8。控制:健康的老鼠接受正常的自来水。CG:健康的老鼠接受水含有1% ( / 甘氨酸。糖尿病:糖尿病大鼠接受正常的自来水。DG:糖尿病大鼠接受水含有1% ( / 甘氨酸。 , 与对照组相比, 相比之下,DM组。

评估甘氨酸对血管内皮功能的影响,我们测量的水平没有血清代谢物和主动脉。数据1 (c)和1 (d)表明DM组,没有代谢物的浓度显著降低血清和主动脉组织匀浆中与对照组相比 和 ,分别)。DG组的浓度没有显著升高而这些代谢物浓度的DM组( )。如图1 (e)无显著差异,观察动脉IMT的四组。

3.3。甘氨酸增加糖尿病大鼠血清的抗氧化能力

评估甘氨酸在抗氧化能力的影响,我们测量了谷胱甘肽的水平,血清SOD、MDA和大鼠的主动脉。在血清中谷胱甘肽和DM组SOD水平与对照组相比显著降低( 和 ,分别的数据2(一个)和2 (b))。然而,谷胱甘肽含量显著提高DG组与糖尿病组( )。DG组SOD水平往往升高,但这一趋势并没有达到统计学意义。DM组的血清MDA水平与对照组相比增加( ,图2 (c)),但这增加DG组(被废除 )。没有观测到这些标记CG集团。

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图2
氧化标记在血清和主动脉匀浆。总谷胱甘肽水平(a), SOD水平(b)和(c)血清中MDA水平不同群体样本测量治疗12周后( )。总谷胱甘肽水平(d), SOD水平(e)和MDA水平(f)测量主动脉匀浆从不同群体治疗12周后( )。(g)和(h)显示的immunohistological分析3-nitrotyrosine主动脉,放大200倍。酒吧规模表明40μm。IOD:集成光密度。 。 , , 与对照组相比。 , 相比之下,DM组。
3.4。甘氨酸恢复抗氧化状态在糖尿病大鼠的主动脉

在主动脉组织匀浆、糖尿病显著减少谷胱甘肽和SOD水平与对照组相比( 和 ,分别的数据2 (d)和2 (e)),而这两种抗氧化标记(甘氨酸治疗显著增加 和 ,分别)。主动脉中MDA含量增加DM组与对照组相比( )。与甘氨酸治疗,糖尿病老鼠中MDA含量减少( ,图2 (f))。未发现明显的变化在CG组与对照组相比。通过免疫组织学(数据所示2 (g)和2 (h)),在主动脉3-nitrotyrosine的表达显著增加在DM组与对照组相比( ),特别是在内膜的层。然而,DG组显示更少3-nitrotyrosine染色( )。

3.5。甘氨酸抑制年龄积累和RAGE-Nox-NF -κB信号通路

众所周知,年龄绑定到其受体的愤怒,这进一步激活NADPH氧化酶(Nox) [23和炎症反应24),最终导致一个恶性循环的维管组织氧化应激(2,5]。因此,年龄/愤怒信号通路构成血管氧化应激的主要机制之一。据报道,甘氨酸补充可以降低年龄水平在糖尿病大鼠的血清17),但其效果在维管组织保持未知。探讨甘氨酸的抗氧化效果是否与抑制年龄/愤怒的途径有关,我们测量的表达,愤怒,Nox4, NF -κB p65。DM组的血清年龄水平与对照组相比显著增加( ,数据3(一个)和3 (b))。甘氨酸治疗年龄水平降低血清自体荧光和ELISA检测( 和 ,分别)。同样,主动脉年龄水平提高DM组被immunohistological分析( ,数据3 (c)和3 (d)),但在DG组(减少 )。类似的结果也发现在测量主动脉年龄由ELISA(图3 (e))。

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图3
分析年龄、愤怒、Nox4和NF -κB p65主动脉不同组治疗后12周。年龄(a)血清水平不同群体治疗12周后自体荧光测定的前370 nm / Em 440海里。 。(b)血清ELISA年龄来衡量。 。(c)和(d)显示主动脉immunohistological分析年龄,放大400倍。比例尺显示20μm。 。大鼠主动脉(e)年龄水平衡量ELISA。 。(f)和(g)显示immunohistological分析主动脉的愤怒,放大400倍。比例尺显示20μm。 。(h)在大鼠主动脉的表达取决于蛋白质印迹。 。(i)和(j)显示Nox4 immunohistological分析的主动脉,放大400倍。比例尺显示20μm。 。(k)的表达Nox4大鼠主动脉取决于蛋白质印迹。 。(左)和(m)显示immunohistological NF -分析κB p65主动脉,放大400倍。比例尺显示20μm。 。(n)的表达NF -κB p65大鼠主动脉取决于蛋白质印迹。 。 , , 与对照组相比。 , , 相比之下,DM组。

调查是否glycine-induced减少年龄可能影响下游年龄/愤怒信号通路,我们应用免疫组织学和免疫印迹,以确定的表达愤怒,Nox4, NF -κB p65主动脉。如数据所示3 (f)- - - - - -3 (n)主动脉的表情愤怒、Nox4和NF -κB p65显著增加DM组与对照组相比( , ,和 ,免疫印迹分析分别)。然而,愤怒的表情,Nox4和NF -κB DG组相比明显减少与DM组( , ,和 ,分别)。类似的结果也观察到在immunohistological分析。没有发现显著差异在CG组与对照组相比。

3.6。甘氨酸增加主动脉Glo1活动和蛋白表达

发现如果甘氨酸时代形成的抑制效应是由于Glo1系统的激活,我们测量了活动和主动脉Glo1的蛋白表达。如immunohistological分析(数据所示4(一)和4 (b)),更少的表情观察Glo1 DM组比对照组( ),而更大水平的染色的Glo1 DG组比DM组所示( )。如数据所示4 (c)和4 (d)的表达和活性,主动脉Glo1 DM组明显低于对照组( )。然而,Glo1蛋白质表达和活性都显著增加了DG组与糖尿病组( )。

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图4
Immunohistological和免疫印迹分析Glo1和Glo1活动测量主动脉不同组治疗后12周。(a)和(b)的immunohistological分析Glo1主动脉,放大400倍。比例尺显示20μm。 。(c)的表达Glo1大鼠主动脉取决于蛋白质印迹。 。(d)的活动Glo1大鼠主动脉。 。 , 与对照组相比。 , 相比之下,DM组。
3.7。甘氨酸还原的可行性和Glo1功能MG-Treated HUVECs

调查是否时代形成的抑制和下游年龄/愤怒信号通路引起的甘氨酸治疗由Glo1,我们研究HUVECs。我们增加了400μM MG HUVEC生长培养基模拟高血糖诱导二羰基压力。在72 h与MG孵化,一些HUVECs也接受0.5毫米,2毫米,或甘氨酸4毫米。如图5(一个)处理时,细胞生存能力下降了35%毫克72 h ( )。2毫米和4毫米甘氨酸防止毫克(造成的损害 )。治疗与0.5毫米甘氨酸对细胞生存能力没有明显的影响。

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细胞生存能力和HUVECs Glo1函数。与400年HUVECs治疗μ米MG和甘氨酸(0.5 mM-4毫米)72 h。(一)细胞生存能力取决于CCK-8。实验进行了一式三份,重复4次。(b)细胞内谷胱甘肽(GSSG HUVECs比率。实验进行了一式三份,重复三次。(c)在HUVECs Glo1的活动。实验进行了一式三份,重复4次。控制:在MEM细胞孵化。所有控制和实验样品的介质有5.5毫米的血糖水平。MG:丙酮醛。 Gly: glycine. , , 与对照组相比。 , , 与400年相比,细胞治疗μM毫克。

HUVECs的孵化与MG引起显著减少细胞内谷胱甘肽(GSSG比率与对照组相比( ,图5 (b)),但这种减少2毫米和4毫米甘氨酸治疗( )。

HUVECs的孵化与MG也导致细胞的活性明显降低Glo1与对照组相比( )。如图5 (c)2毫米和4毫米甘氨酸治疗显著升高Glo1活动剂量依赖性的方式( 和 ,分别)。未发现明显改变这些参数在细胞治疗0.5毫米甘氨酸。

3.8。甘氨酸抑制细胞形成和RAGE-Nox-NF——时代κB信号通路MG-Treated HUVECs

调查是否甘氨酸的有利影响对Glo1功能可能影响时代形成和下游时代/愤怒通路,我们年龄的水平决定,愤怒,Nox4, NF-κB中p65 MG-treated HUVECs。如数据所示6(一)和6 (c),孵化HUVECs毫克72 h显著增加年龄形成反映在免疫荧光分析和ELISA ( 和 ,分别)。免疫荧光研究表明年龄表达下降了0.5毫米,2毫米,或甘氨酸治疗(4毫米 , ,和 ,分别),而ELISA分析显示,只有治疗4毫米甘氨酸可以显著逆转年龄的增加形成( )。

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年龄/愤怒的表达分析在HUVECs轴。400年HUVECs被处理μ米MG和甘氨酸(0.5 mM-4毫米)72 h。(a)和(b)的免疫荧光分析显示年龄在HUVECs表达水平,放大400倍。比例尺显示20μm。图片是代表三个独立的实验。(c)细胞内年龄水平取决于ELISA。实验进行了一式三份,重复三次。愤怒(d)的表达水平,Nox4 (e)和NF -κB p65 HUVECs (f)是由免疫印迹。实验是在四个独立的实验。(g)和(h)显示细胞内ROS生成通过流式细胞术的估计。图片是代表四个独立的实验。控制:细胞治疗5.5毫米葡萄糖。MG:丙酮醛。g:甘氨酸。 , 与对照组相比。 , , 与400年相比,细胞治疗μM毫克。

如数据所示6 (d)和6 (f)愤怒的表达水平、Nox4和NF -κB p65 HUVECs时显著增加治疗MG 72 h ( )。然而,治疗2毫米到4毫米甘氨酸显著减少愤怒的表达水平( ),Nox4 ( ),和NF -κB p65 ( )。0.5毫米甘氨酸的治疗是有效的只有在抑制细胞Nox4表达式( )。

3.9。甘氨酸治疗变弱细胞内ROS生成

流式细胞仪分析显示与MG 72 h孵化后,细胞内的荧光DCFH-DA,这对细胞内ROS作为一个近似估算工具,显著增加了50%,与对照组相比 ,数据6 (g)和6 (h))。然而,治疗0.5毫米,2毫米,或甘氨酸4毫米,MG-induced DCFH-DA荧光信号明显减少( , ,和 ,分别)。

3.10。甘氨酸抑制时代形成的保护作用是由Glo1介导的

探讨甘氨酸对年龄的影响抑制是否由Glo1,我们cotreated HUVECs 4μM Glo1抑制剂S-bromobenzylglutathione环戊基二酯(BBGC)和甘氨酸72 h。我们的研究结果表明,增加Glo1活动由甘氨酸减少( 相比之下,控制图7(一))。此外,甘氨酸时代形成的抑制效应被BBGC ( 相比之下,控制图7 (b))。

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图7
孵化后改变Glo1活动和年龄水平与Glo1抑制剂BBGC 72 h。之前添加MG和甘氨酸培养基,细胞BBGC组是使用4μM BBGC 12 h。(一)在HUVECs Glo1的活动。实验进行了一式三份,重复4次。(b)细胞内年龄水平取决于ELISA。实验进行了一式三份,重复三次。BBGC: S-bromobenzylglutathione环戊基二酯。 与对照组相比。 , 与400年相比,细胞治疗μM毫克。

4所示。讨论

氧化应激过程中扮演着重要的角色在糖尿病血管并发症的发病机理。甘氨酸是谷胱甘肽合成的前体,众所周知,起到抗氧化作用在糖尿病并发症的模型17,19,25- - - - - -27]。研究表明,甘氨酸的作用在恢复老龄大鼠血管内皮功能18和与代谢综合征大鼠13),但甘氨酸的影响在diabetes-induced macrovascular伤害和任何此类效应的可能机制仍不清楚。在目前的研究中,我们发现结构损伤在糖尿病大鼠的主动脉,失真等弹性纤维,明显改善了甘氨酸治疗。此外,降低血清中没有代谢物水平和糖尿病大鼠主动脉匀浆由甘氨酸恢复,表明血管功能提高了甘氨酸治疗。由于氧化应激可以灭活没有(28),导致血管损伤,因此我们推测,甘氨酸可能通过改善氧化应激保护维管组织。

虽然营养不必要的,甘氨酸被报道在前驱糖尿病的不足,建立了糖尿病患者(29日,30.]。在目前的研究中,我们发现血清中甘氨酸含量的DM组与对照组相比,下降而DM组中甘氨酸的含量显著增加,而那些DM组。在正常情况下,甘氨酸的血清水平在人类200年和400年之间的变化μ米(26]。甘氨酸治疗后,人体的甘氨酸水平甚至可能飙升至942人μ米,但没有造成不利影响31日]。在我们的研究中,甘氨酸水平平均健康大鼠的血清 ,这是大约54%的人类健康报道的血清甘氨酸水平Sekhar et al。 )(12),但类似于甘氨酸的水平在健康人体报道Tulipani et al。( )(29日]。虽然甘氨酸的浓度可能不同大鼠模型和人体之间,大量的研究表明,在主题与糖尿病或代谢综合征,甘氨酸的水平降低与健康受试者相比,但这减少口服甘氨酸能够逆转治疗(12,13,29日,32]。

与甘氨酸水平的降低DM组血清中谷胱甘肽含量和主动脉匀浆在这组与对照组相比降低,但DG组显著增加。甘氨酸也降低血清MDA水平和倾向于改善糖尿病大鼠的血清SOD活性。甘氨酸也显著提高SOD活性,减少MDA的水平和3-nitrotyrosine主动脉匀浆。MDA是一个最终产品活性氧生成,造成的脂质过氧化和3-nitrotyrosine作为氧化应激的标记过氧亚硝基。减少在这些氧化生物标志物与甘氨酸治疗表明,糖尿病大鼠氧化应激引起的糖尿病显著改善了12周的口语甘氨酸治疗。

据报道,年龄和下游年龄/愤怒信号通路构成血管氧化应激的主要机制(5,33]。非酶的和不可逆转的形成年龄,许多这样的糖化反应特别发生在长寿等大分子胶原蛋白(34),发现在血管壁的高浓度。一旦形成,不仅年龄积聚在血管组织形态学异常但还激活下游RAGE-Nox-NF -κB通路,诱导持续氧化应激(7,23]。这个高血糖诱导的氧化应激可能反过来加剧年龄的积累和愤怒的表达1,16),从而形成一个恶性循环,会导致持续的损伤。因此,抑制年龄形成和氧化应激对预防糖尿病血管并发症至关重要。

探索是否甘氨酸改善氧化应激通过年龄的干预/愤怒轴,我们评估了甘氨酸对年龄的表达的影响和下游年龄/愤怒的途径。的年龄水平明显高于糖尿病大鼠的血清和主动脉与健康控制老鼠相比,但在糖尿病大鼠接受甘氨酸治疗显著降低。与此同时,愤怒的表达水平,Nox4和NF -κB在糖尿病大鼠的主动脉明显增加,与对照组相比,但这种增长是被甘氨酸治疗。这些结果表明,甘氨酸治疗显著地抑制年龄/愤怒通路,从而衰减血管氧化应激。Nox4是血管ROS生成的主要因素(35,36]。减少主动脉Nox4 DG组表达我们的研究表明,除了参与谷胱甘肽合成,甘氨酸也可能通过抑制氧化的酶的表达。这个结果也符合我们之前的研究报告的影响口腔甘氨酸治疗表达下调胰岛第22位phox表达和氧化标记在糖尿病大鼠模型37]。此外,我们最近报道,甘氨酸的细致谨慎治疗Nox4信使rna和蛋白质的水平降低和提高抗氧化防御STZ-induced糖尿病大鼠的肾脏21]。然而,在这项研究中,研究上游机制甘氨酸调节肾Nox4没有调查。基于这些发现在目前的研究中,人们很容易推测Nox4的减少可能是由于甘氨酸的抑制效应在年龄和愤怒的表情。

甘氨酸抑制主动脉时代形成的影响在我们的研究特别感兴趣。据我们所知,这是第一个研究提供证据表明,甘氨酸可以减弱年龄形成维管组织。据报道,某些生物活性的抗氧化剂,如乌索酸(38和山柰酚39),可以抑制时代形成,减少蛋白质的表达愤怒的年龄/轴,从而防止氧化应激和糖尿病血管损伤。先前的研究已经报道,甘氨酸可能抑制glucose-induced糖化镜头的功能作为一个清道夫的葡萄糖(27,40),而另一项研究推测,这种有益的影响可以归因于甘氨酸的高溶解度,防止沉淀(年龄41]。然而,形成的分子机制,甘氨酸抑制年龄显然尚未阐明。

毫克,高活性二羰基化合物,越来越被认为是一个非常重要的前体的形成(42]。MG-derived年龄可以绑定的愤怒与高亲和力和特异性(43),从而更有效地激活年龄/愤怒轴。在传统看来,时代形成的过程是一个缓慢的大型生物分子之间的反应,减少糖类如葡萄糖,但最近的研究指出,MG反应200 - 20000倍的年龄比葡萄糖形成[44,45]。与谷胱甘肽作为辅因子,Glo1有效解毒作用,从而防止形成时代。人体中谷胱甘肽是一个重要的抗氧化剂,但糖尿病患者的谷胱甘肽水平不足由于过度氧化应激(12,46]。此外,据报道,Glo1的活动在活的有机体内细胞浓度成正比的谷胱甘肽(11,14]。甘氨酸增加谷胱甘肽合成,抑制年龄形成我们的研究让我们假设甘氨酸可能对Glo1功能起到有益的作用,从而防止形成时代。因此,我们测量主动脉Glo1的表达和活性。我们的结果显示主动脉Glo1表达和活动减少DM组与对照组相比,表明Glo1降解毫克的能力受损。Glo1函数下降一定程度上也占了年龄的增加形成的糖尿病大鼠。与DM组相比,主动脉的表达和活动Glo1 DG组显著增加。因此,它是合理的推测,甘氨酸可能恢复Glo1函数通过增加谷胱甘肽水平和改善Glo1表达式和活动,从而抑制年龄的形成和随后的氧化应激。

确认甘氨酸的抑制效果的年龄/愤怒轴与观察到的有关改善Glo1函数,我们孵化HUVECs直接与400年μ72毫克为h模仿二羰基应激引起的高血糖。我们的研究结果表明,MG-treated HUVECs,政府4毫米的甘氨酸显著增加Glo1的活性以及细胞内谷胱甘肽(GSSG比率,表明Glo1的功能是由甘氨酸恢复治疗。甘氨酸政府还导致了细胞的形成年龄和减少显著降低表达水平几岁/愤怒的下游信号通路蛋白,包括愤怒、Nox4和NF -κB p65。因此,MG-induced细胞内氧化应激显著减弱了甘氨酸。此外,我们发现Glo1抑制剂BBGC大大阻止了甘氨酸时代形成的抑制作用。因此,我们在体外实验中提供的证据的有利影响甘氨酸预防MG-induced激活年龄/愤怒的轴和后续增加氧化应激。

内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的早期事件的发展。损失的细胞内谷胱甘肽与扰动在内皮屏障功能47]。减少之间的平衡的谷胱甘肽(GSH)和氧化形式(GSSG)对细胞氧化还原状态的维护是至关重要的。当谷胱甘肽清除自由基氧化,氧化谷胱甘肽(GSSG)可以回收再生谷胱甘肽的途径,利用NADPH作为辅助因子。然而,在慢性氧化应激、NADPH被多元醇通路,从而削弱谷胱甘肽循环(1]。在我们的研究中,氧化应激引起的MG治疗明显减少减少谷胱甘肽(GSH)和HUVECs GSSG内容增加,从而减少谷胱甘肽(GSSG比率,从而削弱Glo1函数。当细胞内GSSG方法细胞毒性水平,这可能是运输以外的细胞(48),这可能最终导致一个总谷胱甘肽含量不足由于基质的不可用。支持这一假设总谷胱甘肽水平明显降低血清和主动脉组织匀浆的糖尿病大鼠在我们的研究中。然而,DG组,总谷胱甘肽含量在活的有机体内与谷胱甘肽(GSSG比率在体外显著增加,相比之下,那些在DM组。这种效应的甘氨酸补充维持谷胱甘肽平衡支持其他的研究报道,口服甘氨酸治疗恢复受损的谷胱甘肽水平在糖尿病或代谢综合征模型(12,13,37]。此外,甘氨酸甚至可能的病原因素组织谷胱甘肽合成,一项研究显示,穆罕默德et al。32)强调了甘氨酸的作用在维持抗氧化防御。

大量证据表明,可以调节Glo1生物活性的表达抗氧化剂(49- - - - - -52]。尽管的机制仍不清楚,核易位的核的作用因子erythroid-2-related因子2 (Nrf2)已经被越来越多的承认。Nrf2 redox-sensitive转录因子,调节各种抗氧化酶的表达水平,包括SOD、血红素加氧酶1,glutamylcysteine合成酶。最近报道,Nrf2还结合抗氧化反应元素(是)外显子1的Glo1 [53]。因此,Nrf2易位到核可能增加Glo1的表达和增强其活动。我们曾发现甘氨酸可以促进核易位Nrf2糖尿病大鼠肾脏的(未发表的数据),但是,甘氨酸对Nrf2激活血管组织的影响没有被调查。然而,这使得有可能,甘氨酸的有利影响血管Glo1函数可能归因于Nrf2核易位。

这项研究确实有一些局限性。MG水平不同的组没有在动物实验测量;因此,直接Glo1功能退化毫克并不确定。因此,在在vitro实验中,我们直接与MG HUVECs孵化研究甘氨酸MG-induced损伤血管细胞的影响,证实了甘氨酸能够保护Glo1函数。此外,在我们的研究中,甘氨酸用于细胞培养实验的浓度高于动物血清中甘氨酸的水平测量。HUVECs,我们从0.5毫米甘氨酸开始,因为这个浓度接近平均血清甘氨酸水平DG组中发现的动物实验。然而,0.5毫米甘氨酸是不足以防止MG-induced细胞损伤。因此,甘氨酸浓度增加到2毫米和4毫米。此外,在细胞实验中,我们只使用Glo1抑制剂干扰Glo1功能,这可能导致非特异性的影响。Glo1使用核的可拆卸的抑制剂的研究将提供一个补充和更好的演示效果的具体机制Glo1甘氨酸。

总之,我们的研究表明,甘氨酸变弱氧化应激在糖尿病大鼠的主动脉通过抑制年龄积累和随后RAGE-Nox-NF -κB信号通路。此外,甘氨酸抑制时代形成的有益作用可能与增加Glo1活动和有关谷胱甘肽合成。甘氨酸的精确机制作用防止糖尿病macrovascular受伤仍然需要进一步的调查,为了扩大治疗方案可用于临床实践。

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的利益冲突

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确认

这项工作得到了中国医疗协会资助的临床医学研究(批准号13040700455),中国国家重点研发项目在13日五年计划(批准号2016 yfc1305401和2016 yfc1305405),和北京市科技项目(批准号D17110000281701)。我们感谢LetPub (http://www.letpub.com)的语言帮助在准备这个手稿。