文摘
背景。转移和入侵在胃癌死亡率的主要原因。提高胃癌的治疗,有效的发展和创新抗肿瘤药物对入侵和扩散是必要的。α硫辛酸(ALA),一种天然的硫醇氧化,显示对几种癌症的抗增殖和细胞毒性的影响。所以它是可行的探索是否可以使用ALA抑制增殖和入侵人类胃癌。方法。MUC4的表达在人类胃癌组织被免疫组织化学化验。然后,我们执行在体外细胞增殖和入侵分析探讨使用AGS阿拉巴马州的抗肿瘤效果,bgc - 823和MKN-28细胞。进一步探索MUC4,差别ALA-mediated机制对这些我们cotransfected人类胃癌细胞蛋白STAT3 siRNA和STAT3超表达结构。芯片进行化验发现MUC4和STAT3的关系。结果。我们发现MUC4基因在人类胃癌组织强烈的表达。同时,阿拉巴马州减少核扩散和入侵人类胃癌细胞通过抑制MUC4表达式。我们还发现的抑制STAT3参与MUC4阿拉巴马州。阿拉巴马州的机械化抑制MUC4表达式通过抑制STAT3绑定到MUC4启动子区域。结论。阿拉巴马州抑制胃癌细胞的增殖和入侵的抑制STAT3-mediated MUC4基因表达。
1。介绍
胃癌是全世界第五大常见癌症,这是第三个与癌症相关的死亡率的主要原因(1]。大多数胃癌病人有邻近器官或远处转移,这是胃癌患者死亡的主要原因。虽然已经有很大的进步在胃癌治疗的诊所,胃癌患者的结果仍不满意(2]。因此,有必要寻找有效和创新的抗肿瘤药物可以抑制增殖和胃癌的入侵。
氧化还原的稳定性起着至关重要的作用在细胞的正常生长。然而,有连续和丰富生产活性氧(ROS)在肿瘤细胞,促进肿瘤的生长,导致DNA损伤和改变细胞代谢3]。生产过剩的活性氧没有适当的管理称为氧化应激。α硫辛酸(ALA)是丙酮酸脱氢酶的辅酶和甘氨酸脱羧酶合成在线粒体4]。阿拉巴马州作为一种强大的抗氧化剂,不仅能清除过量的活性氧直接还再生内源性抗氧化剂如维生素C,维生素E,辅酶Q10,谷胱甘肽,阿拉巴马州本身(5]。阿拉巴马州影响细胞内自由基清除的过程,比如增加谷胱甘肽合成和调节转录因子的活性(6]。如今,阿拉巴马州是广泛应用于临床治疗与过度氧化应激相关的疾病,如糖尿病周围神经病变(7]。近年来,阿拉巴马州被用作抗癌剂不同癌症的实验研究,取得了令人满意的结果(8,9]。然而,潜在的分子机制尚不清楚。
黏蛋白是高分子量糖蛋白,它能保持完整性和润滑和保护表面的上皮细胞(10]。到目前为止,至少有18个不同粘蛋白基因已经被鉴定(11]。粘蛋白4 (MUC4)包围的黏液,表示在正常胃粘膜和胃癌12]。最近的研究表明,MUC4参与肿瘤形成、分化、增殖,入侵和迁移的肿瘤,可以作为参考指标的评价肿瘤条件。据报道,激活蛋白-(美联社)2α抑制MUC4表达进而抑制胰腺癌细胞的扩散和入侵(13]。此外,MUC4的表达是通过upregulation介导信号传感器和激活的转录(STAT)在胰腺癌和胃癌10,14]。
目前的研究进行了识别ALA对人类胃癌进展的影响。我们发现MUC4调节胃癌与正常组织相比。阿拉巴马州减少STAT3绑定MUC4启动子区域,压抑MUC4表达式,因此抑制增殖和人类胃癌细胞的入侵。阿拉巴马州深入我们的数据提供了一种机制,通过这种机制抑制胃癌细胞的扩散和入侵,验证临床使用的阿拉巴马州作为一个潜在的代理来提高胃癌患者的治疗结果。
2。材料和方法
2.1。病人和样品
共有240名患者被诊断为胃腺癌和接受根治性胃切除术在武汉大学人民医院从2014年6月到2015年7月。没有人收到术前化疗或放疗。从每个病人术前得到书面同意。主要病变和相应的非癌变组织在操作,然后是嵌入在石蜡免疫组织化学。入侵的深度被外科医生手术期间观察到的。淋巴结转移是由病理观察检查。远处转移是根据影像学检查证实计算机断层扫描、正电子发射断层扫描等。所有患者随访直到2018年8月,共有12例(5%)患者在随访期。本研究通过武汉大学人民医院的伦理委员会。
2.2。细胞培养和试剂
人类胃癌细胞系如下:AGS, bgc - 823和MKN-28细胞。AGS细胞线从美国购买类型文化集合(美国马纳萨斯写明ATCC);bgc - 823和MKN-28细胞系是同济医学院的礼物,华中科技大学(武汉,中国)。细胞培养在罗斯威尔公园纪念研究所——(RPMI - 1640年)中补充10%胎牛血清的边后卫。细胞保持在37°C孵化器有限公司为5%2。所有的细胞系检测支原体为阴性。α硫辛酸和TNF -α买来Solarbio(中国,北京)。Anti-MUC4抗体,anti-STAT3抗体,是否从Sigma-Aldrich购买特定的主要抗体。
2.3。免疫组织化学
石蜡包埋组织样本切成4μ米厚的部分和安装在poly-L-lysine-coated幻灯片。样品在二甲苯脱蜡、水化使用乙醇分级系列解决方案。deparaffinization之后,内源性过氧化物酶活性被孵化peroxide-methanol 3%溶液在室温下(RT) 10分钟,然后,抗原检索执行在100°C的高压釜7分钟。样本然后在RT孵化了30分钟。之后,部分与磷酸盐(PBS)洗3次,每次5分钟。然后他们被孵化与兔子anti-MUC4抗体(美国Sigma-Aldrich)。与PBS然后进行彻底清洗,在显微镜下主要抗体绑定是可视化。
2.4。细胞转染
细胞被镀在6-well盘子rpmi - 1640中补充10%的中等的边后卫在转染前24小时。转染进行使用siRNAs和Lipofectamine RNAiMAX(热费希尔)转染试剂稀释rpmi - 1640年媒介。表明质粒转染使用Lipofectamine 2000(热费希尔)根据制造商的指示。
2.5。实时定量PCR(存在)
从组织总RNA提取使用试剂盒试剂(美国热费希尔)根据制造商的指示。然后,RNA是反向转录cDNA 1μg总RNA,用逆转录酶和益生元dT引物(豆类、日本)。那时的cDNA放大与特定PCR引物。使用的引物PCR在下面列出。中存在的条件如下:95°C 3分钟,其次是40周期10 s在95°C, 10 s 60°C和15 s在70°C,紧随其后的是加热从65°C到95°C。引物如下:列出了存在MUC4正向引物5 - - - - - -CTTCAGATGCGATGGCTACA-3和反向引物5 - - - - - -GTTTCATGCTCAGGTGCTCA-3 ,STAT3正向引物5 - - - - - -GGCCATCTTGAGCACTAAGC-3和反向引物5 - - - - - -CGGACTGGATCTGGGTCTTA-3 ,18 s rRNA正向引物5 - - - - - -CGGCTACATCCAAGGAA-3和反向引物5 - - - - - -GCTGGAATTACCGCGGCT-3 。
2.6。西方墨点法
总蛋白从细胞中提取及其浓度是衡量BCA蛋白质分析工具包(Solarbio,中国)。蛋白质样品被sds - page分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。阻塞后,一夜之间,膜被孵化与特定的抗体主要在4°C和二级抗体在室温下1 h。蛋白表达水平正常化β肌动蛋白。相对光密度扫描(Bio-Rad)是用于确定蛋白带强度。
2.7。麻省理工
细胞被消化成单个细胞悬液和被播种到96孔板每在200年5000个细胞μl . coincubating后表示的浓度ALA 24 h,麻省理工的解决方案(5毫克/毫升,用PBS, ,Solarbio,中国)添加到10点μL /。细胞被孵化为另一个4 h,文化是终止,上层清液是认真吸收和丢弃。100年μL DMSO溶液添加到每个好策略10分钟完全融化微晶。选择的波长490 nm的吸光度来确定每个。
2.8。基底膜基质入侵检测
细胞入侵检测进行了使用BioCoat™人工基底膜装置(美国康宁公司),介质的边后卫rpmi - 1640中补充了10%的化学引诱物降低室。AGS细胞(105)300年μL被添加到参议院,有或没有的阿拉巴马州或anti-MUC4,入侵了24小时的人工基底膜。Noninvading细胞表面上被移除,入侵细胞在低表面沾Diff-Quick污点工具包(Solarbio,中国)。入侵细胞的数量是相衬显微镜计数。
2.9。染色质免疫沉淀反应
染色质免疫沉淀反应试验(芯片)从Abcam购买装备,英国。简而言之,AGS ( )细胞被固定的1%的甲醛。基因组DNA是剪切长度从200年到1000年英国石油公司与声波Dismembrator(费舍尔科学):Ampl 80%, 3秒,10秒,10个周期。百分之一的细胞提取物作为输入,和其余的提取与anti-STAT3孵化或控制免疫球蛋白在一夜之间在4°C,紧随其后的是沉淀蛋白琼脂糖珠。免疫沉淀反应是按顺序用低盐缓冲,高盐缓冲,氯化锂的缓冲,TE缓冲。DNA蛋白质复杂的筛选了DNA和蛋白质被蛋白酶k消化被存在的分析,发现和获得的数据中存在特定的抗体是免疫球蛋白规范化控制和策划输入百分比。使用两种不同的引物中存在执行:引物组1:5 - - - - - -TCATAC AGCCCCAAGGTCGC-3(意义)和5 - - - - - -TAGCCGGGTTCCTGGGTCC-3(反义),对应MUC4启动子区域3251 - 3373 (NCBI序列,加入AF241535),和引物组2:5 - - - - - -GAAAAGGGTGATTAGCGTGG-3(意义)和5 - - - - - -TCCCCTCAGGCGGCTGGCC-3(反义),对应于3528 - 3632年MUC4启动子区域。
2.10。统计分析
统计差异取决于双尾 - - - - - -测试在两群比较。MUC4和肿瘤临床病理特征之间的关系由卡方检验进行了分析。 被认为是具有统计学意义。IBM SPSS统计21.0版本和GraphPad Prism 7.0版是用来分析数据。
3所示。结果
3.1。MUC4基因在人类胃癌组织强烈的表达
识别MUC4人类胃癌的表达和正常胃组织,我们对正常胃进行免疫组织化学染色样品位于远离癌症 )和胃癌( ),分别。如图1MUC4的表达,在正常胃样品是负数(图1(一)),的表达MUC4相比之下(在胃癌是正面人物1 (b)- - - - - -1 (d))。如表所示1MUC4的表达显示积极的184个县中的240个胃癌组织,而MUC4显示积极的表达在80年从240年正常胃组织。因此这些结果表明MUC4显著调节人类胃癌组织与正常胃组织相比(表1, )。此外,卡方测试证明重大MUC4和年龄的表达之间的相关性,入侵深度、TNM阶段,淋巴结转移和远处转移(表2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。α硫辛酸显著抑制内源性MUC4表达在人类胃癌细胞
识别MUC4阿拉巴马州的内源性表达的影响在人胃癌细胞,我们AGS孵化,bgc - 823和MKN-28细胞与0,0.5,1,或者2毫米ALA 24 h与10%的边后卫RPMI当细胞融合是60%。MUC4信使rna在细胞溶解产物被rt - pcr检测。如图2(一个)阿拉巴马州显著抑制了内源性MUC4以剂量依赖性的方式表达在胃癌细胞。互补,AGS细胞孵化与0,0.5,1,2,或2.5毫米ALA 24 h与10%的边后卫,RPMI然后MUC4蛋白质被西方墨点法测量。如图2 (b)阿拉巴马州显著抑制内源性MUC4在AGS细胞的表达。我们接下来试图检查阿拉巴马州的影响在人类胃癌细胞的生存能力;为此,AGS, bgc - 823和MKN-28细胞孵化与0,0.25,0.5,1,2,或者2.5毫米ALA 24 h MTT测定紧随其后。如图2 (c),显著减少癌细胞的生存能力被发现在细胞治疗1、2和2.5毫米。
(一)
(b)
(c)
3.3。α硫辛酸可以抑制肿瘤坏死因子-α全身MUC4在胃癌细胞
我们试图确定阿拉巴马州可以抑制肿瘤坏死因子-α全身MUC4人类胃癌;为此,我们AGS预处理,bgc - 823和MKN-28细胞浓度表示的阿拉巴马州24 h后暴露的细胞与20 ng / mL TNF -α4 h。后肿瘤坏死因子-α进行治疗,rt - pcr分析MUC4 mRNA。如图3(一个)肿瘤坏死因子-α显著诱导MUC4表达式,预处理ALA显著抑制肿瘤坏死因子-α全身MUC4在胃癌细胞的表达。互补、AGS bgc - 823和MKN-28细胞使用0,0.5,1,或者2毫米ALA 24 h与10%的边后卫RPMI治疗20 ng / mL TNF -有或没有α。然后,免疫印迹显示MUC4的表达明显减少在阿拉巴马州的存在(图3 (b))。此外,pGL3-MUC4发起人construct-transfected AGS细胞使用指定的浓度ALA 24 h,然后用20 ng / mL TNF -孵化α4 h。荧光素酶活性决心用光度计。如图3 (c),相对MUC4荧光素酶活性显著降低细胞治疗ALA浓度更高。综上所述,阿拉巴马州抑制TNF -α全身MUC4在胃癌细胞。
(一)
(b)
(c)
3.4。α硫辛酸抑制AGS细胞入侵通过抑制MUC4表达式
然后我们测试是否ALA抑制胃癌细胞的入侵。基底膜基质入侵分析表明,相对入侵细胞的数量明显减少ALA-treated组与对照组相比,anti-MUC4显示类似的效果(图4(一))。有趣的是,肿瘤坏死因子-后效果也可以观察到α治疗(图4 (b))。此外,阿拉巴马州的浓度越高,数量越少的相对入侵细胞观察(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.5。的抑制STAT3参与MUC4α硫辛酸
据报道,STAT3在人类胃癌发展过程中发挥作用。确定是否参与抑制STAT3 MUC4阿拉巴马州在胃癌细胞,蛋白STAT3 siRNA是cotransfected pGL3-MUC4启动子构建成AGS细胞使用2毫米。孵化后20 ng / mL TNF -α4 h,荧光素酶的决心用光度计。相对MUC4荧光素酶活性显著降低STAT3-transfected AGS细胞与对照组相比(图5(一个))。互补,STAT3过度构建是cotransfected pGL3-MUC4启动子构建成AGS细胞。转染细胞使用或没有2毫米阿拉巴马州与20 ng / mL TNF -孵化α4 h,然后,用光度计MUC4荧光素酶活性测定。如图5 (b),相对MUC4荧光素酶活性明显高于STAT3超表达细胞比只有潜伏在阿拉巴马州。这两个化验表明,MUC4基因受STAT3的表达。此外,探索的作用的抑制STAT3 MUC4阿拉巴马州在胃癌细胞,AGS, bgc - 823和MKN-28细胞孵化了0,0.5,1,或者2毫米ALA 24 h与10%的边后卫RPMI当细胞融合是60%。孵化后,STAT3信使rna在细胞溶解产物被rt - pcr检测。之间没有显著差异的STAT3 mRNA水平细胞孵化表示浓度ALA(图5 (c))。此外,AGS, bgc - 823和MKN-28细胞使用0,0.5,1,2,或者2.5毫米ALA 24 h与10%的边后卫RPMI治疗20 ng / mL TNF -有或没有α。然后,进行免疫印迹分析p-STAT3和STAT3蛋白水平。没有显著区别p-STAT3和STAT3蛋白水平的细胞浓度表示的孵化α硫辛酸。综上所述,STAT3在阿拉巴马州MUC4的抑制,但其表达水平没有影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。α硫辛酸抑制STAT3绑定MUC4启动子区域
图6(一)显示MUC4启动子的示意图表示。这两个假定的STAT-binding网站以及引物用于染色质免疫沉淀反应实验(引物组1和引物组2)所示。AGS细胞治疗2毫米阿拉巴马州过夜,然后暴露于20 ng / mL TNF -α4 h或没有TNF -α治疗,其次是使用anti-p-STAT3芯片分析和PCR引物覆盖2 MUC4启动子的不同区域。如图6 (b)阿拉巴马州抑制STAT3在MUC4绑定网站2启动子区域。
(一)
(b)
4所示。讨论
在目前的研究中,我们证明了阿拉巴马州的抑制作用对人类胃癌细胞增殖和入侵。这种抑制作用的可能机制是通过抑制MUC4。阿拉巴马州抑制STAT3绑定到MUC4启动子区域,减少MUC4的表达,从而抑制胃癌细胞的增殖和入侵。据我们所知,这是第一个研究表明ALA对阻力的影响在胃癌细胞增殖和侵犯。
MUC4保护肿瘤细胞在血液传播和促进癌细胞转移的入侵和殖民的网站(15]。许多研究表明高MUC4表达在胃癌预后不良有关,如淋巴结转移和血管侵犯,这是胃癌患者死亡的主要原因(16]。我们进行免疫组织化学染色,结果显示积极MUC4表达在胃癌组织与正常组织相比(图1和表1, ),这是根据已知的研究结果。预后因素的免疫组织化学显示,MUC4表达有显著差异在不同条件下,如年龄、深度入侵,TNM阶段,淋巴结转移和远处转移(表。2, )。MUC4进一步研究作为目标治疗各种类型的癌症,如乳腺癌[17)和结肠直肠癌18]。因为MUC4胃癌密切相关,它可能会抑制胃癌通过调节MUC4表达式。
据报道,ALA对胃溃疡大鼠有保护作用,因为其抗氧化和消炎作用[19]。阿拉巴马州的抑制作用在各癌细胞的扩散和转移6),我们治疗胃癌细胞阿拉巴马州和阿拉巴马州发现1毫米可以减少胃癌细胞(图的可行性2 (c))。其对胃癌细胞的抑制作用可能与抑制MUC4表达式(数字2(一个)和2 (b))。
肿瘤坏死因子-α和il - 6都可以诱发MUC4基因表达。探索机制,我们发现ALA对胃癌细胞的影响可能与STAT3。因此,我们希望药物或因素可以诱发外源性MUC4而不影响STAT3的表达水平。然而,据报道,il - 6可能激活STAT3,导致下游与生长有关的基因的转录upregulation [20.]。相反,肿瘤坏死因子-α诱发MUC4通过独立STAT3通路(如NF -κB通路)。因此,我们使用TNF -α增加外源性MUC4在我们的研究17]。肿瘤坏死因子-α全身MUC4显著降低mRNA和蛋白水平与阿拉巴马州接受治疗后,和效果呈正相关,ALA浓度(图3)。此外,我们也证明了阿拉巴马州抑制胃癌细胞入侵比anti-MUC4强烈得多,这表明ALA对胃癌的抑制作用部分是通过抑制MUC4(图4)。这些实验表明,阿拉巴马州抑制内源性MUC4和MUC4引起肿瘤坏死因子-α在胃癌细胞,这可能导致对胃癌的抑制。
MUC4 STAT3的下游靶基因,其表达受STAT3 (21]。在我们的研究中,两个可拆卸的STAT3和治疗的阿拉巴马州MUC4水平降低(图5(一个)),而过度的STAT3减少MUC4阿拉巴马州(图的影响5 (b)阿拉巴马州的),和治疗并没有改变STAT3的水平(图5 (c))。因此,我们推测,阿拉巴马州的机制抑制MUC4并不改变目标STAT3基因上游的水平,但影响STAT3的功能。
STAT3可以激活各种细胞因子,包括细胞因子白介素6 (il - 6)的家庭,粒细胞集落刺激因子,瘦素和表皮生长因子(22]。STAT3 redox-sensitive半胱氨酸在其结构和STAT3容易氧化还原调控(23]。半胱氨酸硫醇很不稳定,很容易被氧化成二硫键,导致中间在蛋白质构象的变化(24]。因此,在细胞外环境中氧化还原状态的改变会影响STAT3蛋白的空间构象,并进一步影响其功能(25]。阿拉巴马州能清除过量的活性氧和再生内源性抗氧化剂,这可能影响肿瘤细胞的氧化应激状态。细胞的氧化还原变化很可能影响STAT3蛋白结构稳定性和影响其功能。与我们的假设一致,我们证明了阿拉巴马州封锁了绑定的STAT3 MUC4启动子(图6)。然而,阿拉巴马州的机制抑制STAT3绑定MUC4需要进一步大规模调查的发起人。
5。结论
总之,阿拉巴马州抑制胃癌细胞的扩散和入侵的差别通过对这些MUC4。具体地说,阿拉巴马州抑制STAT3绑定MUC4的启动子。我们的研究表明,阿拉巴马州可用于胃癌的治疗,甚至在胃癌的早期抑制胃癌的进展。
缩写
| 阿拉巴马州: | α硫辛酸 |
| ROS: | 活性氧 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| MUC4: | 粘蛋白4 |
| STAT3: | 信号传感器和转录激活3 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| 存在: | 定量实时聚合酶链反应 |
| 芯片: | 染色质免疫沉淀反应。 |
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
没有对所有作者的利益冲突。
作者的贡献
羌族通设计研究,解释结果,并写了手稿。于杨,二胡,Jiajun罗,摘要,江越,刘英,Shilun通进行了实验。志华王、鲁伊·周参与本研究的设计和协调。于杨和二胡方同样这项工作做出了贡献。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金(81172186)(QT)、湖北省自然科学基金(2018号cfb504) (QT),由武汉大学人民医院的指导基础(没有。RMYD2018M67) (QT),由美国国家科学基金会优秀年轻学者(81722007)(ZHW)。