文摘

Ca2 +/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CaMKII),由抑制剂1蛋白质磷酸酶1 (I1PP1),维持心血管体内平衡是至关重要的。然而,I1PP1的作用和机制对hypoxia-reoxygenation (H / R)在心肌细胞损伤仍然是一个问题。I1PP1后在我们的研究中,超表达腺病毒感染的新生儿心肌细胞缺氧4 h和再氧化12 h, CaMKIIδ可变剪接亚型、ATP含量和乳酸脱氢酶(LDH)释放的决定。在Thr17 CaMKII活性磷蛋白质磷酸化(p-PLB Thr17), CaMKII磷酸化(p-CaMKII)和CaMKII氧化(ox-CaMKII)。活性氧(ROS),线粒体膜电位,dynamin-related蛋白1 (DRP1),视神经萎缩1 (OPA1)表达式进行了评估。我们的研究证实,I1PP1过度减毒CaMKIIδ可变剪接障碍;抑制拉钮磷酸化在Thr17、p-CaMKII ox-CaMKII;减少细胞LDH释放;增加ATP内容;减毒ROS生产;增加了线粒体膜电位;和减少DRP1表达式,但增加OPA1表达后的心肌细胞H / R。相反,CaMKIIδ可变剪接障碍,LDH释放,减少ATP,活性氧积累加剧H / R损伤后I1PP1击倒。集体,I1PP1过度修正CaMKII的障碍δ可变剪接,抑制CaMKII磷酸化,抑制CaMKII氧化、抑制ROS生产,减弱心肌细胞H / R损伤。

1。介绍

心肌缺血再灌注损伤(米里)是一种现象,心肌功能不是提高而是加重缺血性心肌血液灌注恢复后立即(1- - - - - -4]。米里往往伴随着心脏和血管不良事件如心律失常、扩大梗死大小、持续性心室收缩功能障碍,甚至没有回流,严重损害心肌缺血的预后(5- - - - - -7]。美里是一个复杂的病理生理过程涉及多个因素,如氧自由基、钙超载、炎症、细胞凋亡、内皮细胞内稳态失衡(8- - - - - -10),过多的氧自由基是再灌注损伤的关键因素(11]。此外,美里是一个心脏手术后早期心脏功能障碍的常见原因,这是一个困难的问题限制缺血性心脏病的治疗和预后12]。

钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CaMKII)是一个serine-threonine蛋白激酶与产品描述,在心肌和其他丰富的组织(13,14]。四个亚型CaMKIIδ(α,β,γ,δ)现在已经被发现。CaMKIIδ心肌中最丰富的亚型(15]。在可变剪接的存在,CaMKIIδ能产生的三种剪接变体δ一个,δB,δC与拼接的作用因素(8- - - - - -10]。CaMKII的三个不同的亚型δ心血管系统扮演着不同的角色。CaMKIIδ一个是心脏收缩和舒张功能的关键16]。CaMKIIδB调节心肌肥大和祖细胞存活心肌17]。CaMKIIδC是心肌细胞凋亡在心肌重构密切相关(18]。

除了Ca2 +/钙调蛋白,CaMKII也可以被磷酸化激活和氧化19- - - - - -21]。持续过度CaMKII激活各种心脏病造成不利影响(22,23]。一些研究发现CaMKII盛开在米里的开始活动,促进肌浆网的钙离子外渗和加重心肌功能障碍和伤害(24,25]。减轻CaMKII的活动有利于减弱米里的程度,减少活性氧簇(ROS)的过度生产(26),抑制细胞凋亡和坏死,这是有利的对心肌功能的恢复(27]。此外,CaMKII也是心肌的关键调解人necroptosis [28]。因此,CaMKII通常被视为核心信号在心肌细胞(14]。虽然有几种常见CaMKII抑制剂如KN93或AIP,这些化合物的特异性和效价限制他们的应用程序由于一些其他影响无关CaMKII抑制(29日]。此外,CaMKII的抑制剂,KN93竞争性抑制绑定的钙调蛋白激酶,但不是CaMKII的自主活动(29日]。总之,CaMKII活动监管可能是一个潜在的方法来缓解美里。

蛋白磷酸酶1 (PP1)是由细胞内钙波动的心改变多个蛋白质的磷酸化水平(30.- - - - - -33]。研究表明,PP1调节中心的患者患有心脏肥大,心脏功能障碍和心力衰竭(34- - - - - -36]。缺乏PP1防止心律失常和心肌肥厚37]。此外,PP1提升CaMKIIδ拼接。当PP1增加,CaMKII的比率δ可变剪接的产品可能不平衡,导致CaMKII的增强δC变异但CaMKII的减少δB和CaMKIIδ一个变种33]。因此,药理PP1活动的目标被认为是有用的治疗和干预等各种心肌病米里(38- - - - - -41]。据我们所知,抑制剂1蛋白质磷酸酶1 (I1PP1)是一种内源性抑制剂减少PP1活动或抑制PP1表达式(42]。I1PP1 upregulation加速Ca2 +循环,改善心脏功能,减轻细胞损伤(43,44]。

因此,hypoxia-reoxygenation (H / R)心肌细胞体外的用于验证的效果I1PP1 CaMKII活动过度和可变剪接。的详细机制I1PP1超表达对H / R损伤也探索。它有利于提供米里的新战略。

2。方法和材料

2.1。细胞培养和Hypoxia-Reoxygenation损伤模型

新生儿心肌细胞提取Sprague-Dawley (SD)大鼠老化1 - 3天,胰蛋白酶(Beyotime、上海、中国)消化。培养2 - 3天之后,这些细胞被孵化的DMEM培养基(Gibco,卡尔斯巴德,CA)包含1 g / L葡萄糖和0.5%的边后卫(Gibco,卡尔斯巴德,CA)和培养在孵化器94% N2,1%的人啊2,5%的公司2引起组织缺氧。四小时后,中变成了5.5 g / L葡萄糖和10%的边后卫,在孵化器孵化有限公司为5%2和正常的空气。另一个12 h复氧后,心肌细胞进行进一步的实验。CaMKII抑制剂KN93 (1μ蒙茅斯结,M, MedChemExpress NJ) preincubated 1 h在缺氧和再氧化。

目前实验严格遵守指导方针的实验室动物保健和使用实验动物研究所,国家研究理事会,华盛顿特区,国家科学院出版社,2011年,任何更新。详细的协议也通过一个特定的委员会在南通大学(南大- 20161210)。

2.2。I1PP1腺病毒感染

老鼠I1PP1全长(基因身份证,58977, 空斑形成单位/毫升)或向量( 空斑形成单位/毫升)重组腺病毒解决方案(Hanbio生物技术有限公司,上海,中国)与莫伊100被感染心肌细胞的价值。4 h后,腺病毒解决方案被淘汰,DMEM培养基有10%的边后卫被取代。向量( 空斑形成单位/毫升)重组腺病毒作为一个消极的控制应用。受到immunofluorescent染色的细胞,免疫印迹或hypoxia-reoxygenation受伤。

2.3。RNA干扰

三个反义oligodeoxynucleotides对老鼠I1PP1 mRNA (# 1, 5 - - - - - -AGACAATGGTTGAACATCA-3 ;# 2、5 - - - - - -GCAGAATCCAAACCCAAGA-3 ;# 3、5 - - - - - -TCAGCGTCAAGGCCAGATA - - - - - -3 )小干扰rna(数控siRNA)和非特异性控制商业获得RiboBio,广州,中国。

血清剥夺24 h后,小干扰rna转染进入心肌细胞Lipofectamine 2000以上(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和受到hypoxia-reoxygenation受伤。

2.4。乳酸脱氢酶(LDH)测量

LDH水平在中发现了一个商业LDH-Cytotoxic分析工具包(Beyotime、上海、中国)。心肌细胞培养在一个24-well板密度约为80%。I1PP1重组腺病毒感染后紧接着缺氧4 h和再氧化12 h, 120年的上层清液μL被带进一个96孔板离心后,和60μL测试的解决方案是混合到每个。然后,板被没有光为30分钟25°C。LDH释放到介质根据吸光度计算在490 nm,规范化的对照组的价值。

2.5。ATP测定

心肌细胞ATP的含量是检测到一个商业ATP测定工具包(Beyotime、上海、中国)。在100年治疗和平衡μL的CellTiter-Lumi™发光测定试剂与介质完全混合。然后,发光强度得到了用分光光度计(BioTek仪器,Inc .)、美国)。ATP的水平计算在对照组和规范化的价值。

2.6。ROS测量

孵化后dihydroethidium(她2μM, Beyotime,上海,中国对30分钟)在37°C,过氧化物生产,认为是她荧光强度,在心肌细胞评估激光共焦显微镜(徕卡,位于德国)和量化使用ImageJ软件。

孵化后MitoTracker绿色(100 nM, Beyotime,中国上海)和MitoSOX (5μM, YEASEN,上海,中国对20分钟)在37°C,线粒体ROS,视为MitoSOX荧光强度,在心肌细胞评估490/516 nm波长的激光共焦显微镜MitoTracker绿色和510/580 nm波长MitoSOX,分别量化使用ImageJ软件。

2.7。线粒体膜电位(Δψ米)检测

孵化后JC-1染色溶液(Beyotime、上海、中国)20分钟,Δψm,视为荧光强度,在心肌细胞评估495/519 nm波长的激光共焦显微镜J-monomer和550/570 nm J-aggregates波长,量化使用ImageJ软件。

2.8。Immunofluorescent染色

与初级孵化后anti-optic萎缩1 (OPA1, 1: 50)或anti-dynamin-related蛋白1 (DRP1, 1: 50)抗体12 h在4°C,孵化了心肌细胞免疫球蛋白共轭Cy3或Alexa萤石488 (1:500;Beyotime、上海、中国)2 h。的蛋白表达的荧光强度进行评估。

2.9。实时聚合酶链反应

与试剂盒提取总RNA后心肌细胞的1μL核糖核酸样品,2μL 5 x反应缓冲区,和7μL DEPC RNase-free管水涨跌互现。反转录的过程:成立孵化在37°C 15分钟和5 s的85°C,在4°C和保存。加入一定量逆转cDNA SYBR绿色qPCR混合放大(美国ABI,卡尔斯巴德,CA)。引物序列(表1)CaMKII的δ和家政信使rna被Sangon合成生物技术有限公司(上海,中国)。三次定量实时PCR分析每组的DNA。计算的相对mRNA水平比较阈值δ周期(CT)的方法。

表1
实时PCR引物的序列。
2.10。免疫印迹

约50的蛋白质μg是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。接下来,膜被5%的牛奶没有脂肪2 h后通过孵化主要抗体(表2)[45- - - - - -47一夜之间)在4°C。洗后,膜被辣根过氧化物酶-孵化(合)共轭免疫球蛋白(Beyotime、上海、中国)2 h。增强化学发光(ECL,热费希尔科学Inc .,罗克福德,美国)被膜蛋白乐队形象化。

表2
的主要抗体免疫印迹。
2.11。统计分析

数据被表示为 由单向方差分析(SEM)分析了Bonferroni事后考验紧随其后。 值低于0.05被认为是一个重要的区别。

3所示。结果

3.1。CaMKIIδ在心肌细胞变异无序Hypoxia-Reoxygenation受伤

因为抗体CaMKIIδ变异是用时,CaMKIIδ,CaMKIIδB, CaMKIIδC表达式由定量实时PCR测定缺氧复氧后不同时期的开始。CaMKII没有显著变化δ变异后缺氧4 h。两个CaMKIIδ一个和CaMKIIδB表达减少,而CaMKIIδC表达增加复氧后6 h,这是最明显的在12 h。数据表明,心肌细胞H / R损伤诱导CaMKII的重大障碍δ变异(图1)。


图1
CaMKIIδ变体无序在心肌细胞H / R损伤。文化94% N2,1%的人啊2,5%的公司24 h,心肌细胞变成95%的空气和5%的公司2。CaMKII的mRNA水平δ,CaMKIIδB, CaMKIIδC的心肌细胞缺氧复氧后不同时间的开始被定量实时PCR检测。18岁是酒店式管家mRNA。图代表了 ; 。统计学意义: 相比之下,“缺氧的开始。”
3.2。I1PP1超表达减少LDH释放,但增加心肌细胞H / R损伤后ATP水平

然而,是否CaMKII的校正δ变体障碍是有利于减弱H / R损伤仍是未知的。接下来,腺病毒重组技术应用于诱导I1PP1超表达在我们的研究中。PP1抗体PP1α是申请检测PP1家族催化亚基。我们发现I1PP1表达重组腺病毒感染后增加而PP1表达减少(图2)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
重组腺病毒感染增加I1PP1但减少PP1心肌细胞中表达。(a)在携带I1PP1基因重组腺病毒的解决方案或向量被感染心肌细胞,I1PP1 PP1和免疫荧光染色使用Alexa萤石488 -(绿色)或Cy3(红色)共轭免疫球蛋白。细胞核是用DAPI染色(蓝色)。 。(b)的表达I1PP1 PP1蛋白质是量化心肌细胞的免疫印迹。β微管蛋白被用作加载控制。图代表了 ; 。统计学意义: 相比之下,控制。

感染后,执行hypoxia-reoxygenation心肌细胞。有更多的LDH在中后H / R,表明H / R诱发更严重的伤害。此外,I1PP1超表达心肌细胞显著减少LDH的释放(图3(一个))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
I1PP1超表达减少LDH释放,但增加ATP水平后心肌细胞H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。(一)培养基测定LDH释放。(b)心肌细胞ATP水平测定。图代表了 ; 。统计学意义: 与控制;# 和# # 相比之下,H / R。

能量代谢障碍是心肌缺血再灌注损伤的重要机制(48]。评估中也检测到ATP生产H / R损伤的心肌细胞。数据显示,ATP生产受阻后心肌细胞H / R,由I1PP1恢复超表达(图3 (b))。

3.3。I1PP1过度监管和CaMKII CaMKII活动δ可变剪接后心肌细胞H / R损伤

以前的研究证实拉钮磷酸化在Thr17是一个健壮的CaMKII活动的标志,这是通常用于CaMKII活动评估(33]。我们目前的研究证实,I1PP1超表达显著抑制拉钮磷酸化后Thr17 H / R,这表明CaMKII活动减弱由于高水平的I1PP1(图4(一))。它也指出,CaMKIIδ一个和CaMKIIδB剪接变异显著下降,而CaMKIIδC H / R后显著增加。此外,I1PP1 CaMKII过度增加δ一个和CaMKIIδB但是CaMKII下降δC表达式(数据4 (b)- - - - - -4 (d))。所有这些数据表明,CaMKII活动和CaMKIIδ可变剪接障碍被I1PP1纠正过度后H / R。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
I1PP1过度监管和CaMKII CaMKII活动δ可变剪接后心肌细胞H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。(a)表达p-PLB Thr17和拉钮心肌细胞被免疫印迹量化。β微管蛋白被用作加载控制。(罪犯)CaMKII的mRNA水平δ,CaMKIIδB, CaMKIIδC在心肌细胞被定量实时PCR检测。18岁是酒店式管家mRNA。图代表了 ; 。统计学意义: 与控制;# # 相比之下,H / R。
3.4。I1PP1过度抑制ROS但在心肌细胞线粒体膜电位升高H / R损伤

过多的活性氧的生产被认为是一个关键机制心肌I / R损伤(49,50]。因此,在全球细胞和线粒体ROS生产发现她和MitoSOX染色,分别。结果表明,有更强的荧光强度后她和MitoSOX H / R,显著减毒的I1PP1过度(数字5(一个)和5 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
I1PP1过度抑制ROS但在心肌细胞线粒体膜电位升高H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。心肌细胞(a)过氧化物生产使用她荧光探针的荧光显微镜检测和量化使用ImageJ分析软件。 。(b)线粒体ROS用MitoSOX测量。证实了线粒体定位MitoSOX信号colocalization MitoTracker绿色和量化使用ImageJ分析软件。 。(c)线粒体膜电位(Δψ米)是衡量JC-1染色和量化使用ImageJ分析软件。 。图代表了 ; 。统计学意义: 与控制;# # 相比之下,H / R。

研究表明,线粒体膜电位的降低(Δψ米)可能导致活性氧积累和细胞损伤。我们的研究发现,绿色JC-1单体的荧光强度,表明受损的线粒体膜电位,增加后H / R。同时,红色荧光强度JC-1骨料,建议正常的膜电位,降低了。此外,I1PP1过度抑制绿色但是红色荧光强度增强。数据表明,I1PP1过度后的心肌细胞线粒体膜电位升高H / R(图5 (c))。

3.5。I1PP1过度缓解CaMKII氧化和磷酸化后心肌细胞H / R损伤

CaMKII氧化和磷酸化两个主要激活CaMKII的形式,有利于加速后的心脏功能恶化美里(28]。研究证实,氧化和磷酸化CaMKII的高度H / R损伤后心肌细胞,而在心肌细胞减少CaMKII I1PP1超氧化和磷酸化后H / R损伤的数据6(一)和6 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
I1PP1过度缓解CaMKII氧化和磷酸化后心肌细胞H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。(一)表达式CaMKII氧化(ox-CaMKII)和总CaMKII心肌细胞H / R损伤后被免疫印迹量化。GAPDH是用作加载控制。(b)的表达CaMKII磷酸化(p-CaMKII)和总CaMKII心肌细胞H / R损伤后被免疫印迹量化。GAPDH是用作加载控制。图代表了 ; 。统计学意义: 与控制;# # 相比之下,H / R。
3.6。线粒体OPA1 I1PP1过度监管和DRP1表达在心肌细胞H / R损伤

OPA1和DRP1线粒体融合- - - fission-associated蛋白质,分别为(51,52]。OPA1的动态平衡和DRP1维护线粒体结构和功能(53,54]。我们发现H / R损伤明显抑制OPA1但DRP1表达升高。I1PP1过度后的心肌细胞增加OPA1但减少DRP1 H / R损伤,这是有利于维护OPA1和DRP1(数据的平衡7(一)- - - - - -7 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
线粒体OPA1 I1PP1过度监管和DRP1表达在心肌细胞H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。(一)OPA1 DRP1和免疫荧光染色使用Cy3 -(红色)或Alexa萤石488(绿色)共轭免疫球蛋白和量化使用ImageJ分析软件。细胞核是用DAPI染色(蓝色)。 。(b, c)表达式OPA1和DRP1心肌细胞被免疫印迹量化。GAPDH是用作加载控制。图代表了 ; 。统计学意义: 与控制;# # 相比之下,H / R。
3.7。I1PP1超表达结合CaMKII抑制剂KN93减毒在心肌细胞H / R损伤后氧化应激

为了证实上述保护作用I1PP1超表达对氧化应激在H / R损伤是归因于CaMKII抑制,全球细胞活性氧和线粒体ROS进一步测量。研究发现,CaMKII抑制剂KN93 preadministration显著抑制活性氧积累后H / R损伤的数据8(一个)- - - - - -8 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图8
KN93减毒在心肌细胞H / R损伤后氧化应激。后CaMKII抑制剂KN93 (1μ米)preadministration 1 h,心肌细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。心肌细胞(a, b)过氧化物生产使用荧光显微镜检测到她荧光探针和量化使用ImageJ分析软件。 。(c, d)线粒体ROS用MitoSOX测量。证实了线粒体定位MitoSOX信号colocalization MitoTracker绿色和量化使用ImageJ分析软件。 。图代表了 ; 。统计学意义: 与控制;# # 相比之下,H / R。

此外,两个I1PP1过度和I1PP1超表达结合KN93同样减少LDH释放(图9(一个)(图)和增强ATP生产9 (b)生产(图),减弱活性氧10线粒体膜电位(图),并增加11)在心肌细胞H / R。此外,出现上述两组之间无显著差异。这些数据表明,I1PP1过度减轻细胞损伤,抑制活性氧的生产,在心肌细胞线粒体膜电位升高H / R损伤通过抑制CaMKII激活。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
影响I1PP1过度和KN93 LDH释放和H / R损伤后心肌细胞ATP水平。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞有或没有CaMKII抑制剂KN93孵化1 h受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。(一)培养基测定LDH释放。(b)心肌细胞ATP水平测定。图代表了 ; 。统计学意义: 和 与向量+ H / R。
(一)
(一)
(b)
(b)
图10
影响I1PP1过度和KN93氧化应激在心肌细胞H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞有或没有CaMKII抑制剂KN93孵化1 h受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。心肌细胞(a)过氧化物生产使用她荧光探针的荧光显微镜检测和量化使用ImageJ分析软件。 。(b)线粒体ROS用MitoSOX测量。证实了线粒体定位MitoSOX信号colocalization MitoTracker绿色和量化使用ImageJ分析软件。 。图代表了 ; 。统计学意义: 与向量+ H / R。

图11
影响I1PP1过度和KN93线粒体膜电位在心肌细胞H / R损伤。I1PP1重组腺病毒感染后,心肌细胞有或没有CaMKII抑制剂KN93孵化1 h受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。线粒体膜电位(Δψ米)是衡量JC-1染色和量化使用ImageJ分析软件。 。图代表了 ; 。统计学意义: 与向量+ H / R。
3.8。I1PP1击倒加剧CaMKIIδ可变剪接紊乱、细胞损伤和氧化应激在心肌细胞H / R损伤

相反,我们也评估了小干扰rna技术I1PP1击倒效果,在心肌细胞H / R损伤。我们发现这三个核显著降低I1PP1表达式,并有至少I1PP1 siRNA # 2转染后的表情。因此,siRNA # 2是用于进一步研究(图12(一个))。接下来,我们发现CaMKIIδ可变剪接障碍(图12 (b))、LDH释放(图12 (c)(图),ATP减少12 (d)),和活性氧积累(图12 (e))在心肌细胞H / R后加重心肌细胞I1PP1击倒。然而,没有证据表明关于CaMKII在新生儿心肌细胞激活I1PP1was撞倒了。总之,I1PP1击倒加剧了CaMKIIδ可变剪接紊乱、细胞损伤和氧化应激在新生儿心肌细胞H / R损伤。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图12
影响CaMKII I1PP1击倒δ可变剪接紊乱、细胞损伤和氧化应激在心肌细胞H / R损伤。(a) I1PP1 siRNA或小干扰rna转染成数控后新生大鼠心肌细胞,表达式的I1PP1心肌细胞被免疫印迹量化。GAPDH是用作加载控制。(b) I1PP1 siRNA或小干扰rna转染成数控后新生大鼠心肌细胞,细胞受到缺氧4 h紧随其后12 h再氧化。CaMKII的mRNA水平δ,CaMKIIδB, CaMKIIδC复氧后心肌细胞被定量实时PCR检测。18岁是酒店式管家mRNA。(c)培养基测定LDH释放。(d)心肌细胞ATP水平测定。(e)线粒体ROS用MitoSOX测量。证实了线粒体定位MitoSOX信号colocalization MitoTracker绿色和量化使用ImageJ分析软件。 。图代表了 ; 。统计学意义: 相比之下,数控;# 和# # 而数控+ H / R。

4所示。讨论

尽管再灌注心肌血流量恢复是至关重要的,它可能导致严重损害心脏心肌缺血和再灌注期间。因此,如何减弱米里诊所的一个非常困难的问题。

CaMKII整合的能力β肾上腺素、活性氧、Gq-coupled受体、高血糖和proapoptotic细胞因子信号诱导的心肌氧化应激(14]。CaMKII的过度激活加重心肌细胞损伤和加速心血管疾病的进展。先前的研究表明,CaMKII至关重要在米里的发病机制55- - - - - -59],CaMKIIδ是最重要的同种型心肌。我们目前的结果表明,hypoxia-reoxygenation CaMKII的障碍引起的δ可变剪接的心肌细胞,以减少的表达δ一个和δB亚型,但增加的表达δc .另一方面,水平ox-CaMKII p-CaMKII,以及表达p-PLB Thr17代表CaMKII活动,也增加了。先前的研究发现,拉钮磷酸化I1PP1转基因小鼠的心脏增加基底状态。I1PP1高架拉钮磷酸化全球40分钟紧随其后的是缺血再灌注后,60分钟postreperfusion(而没有差异43]。I1PP1也增加了拉钮磷酸化的猪在基底状态(60]。在目前的研究中,我们发现I1PP1显著抑制拉钮磷酸化后心肌细胞H / R。发散对拉钮磷酸化的影响可能是由于不同类型的细胞或动物用于此类研究,不同的缺血或再灌注时间、不同时间测量,或这些因素的结合。据我们所知,活性氧氧化的蛋氨酸残渣Met281/282促进CaMKII氧化。CaMKII能够被磷酸化本身。然而,是否恢复上述异常CaMKII能够缓解H / R损伤不是众所周知的。

PP1能够改变剪接因子磷酸化和规范CaMKII可变剪接的心。先前的研究发现,缺氧(但没有再氧化)减少PP1在心肌细胞的活动(61年),在青蛙的骨骼肌(62年在真核细胞中,63年),在海马体(64年]。先前的研究发现,增强PP1活动参与了Ca2 +骑自行车,增加在成人心脏(H / R43]。此外,以往的研究发现,诱导过度的I1PP1增强基底心脏功能和防止缺血再灌注损伤43),这与我们的研究结果是一致的,I1PP1超表达减弱心肌细胞H / R损伤。我们的研究也证实I1PP1纠正CaMKII的障碍δ拼接,减少LDH释放,但加强ATP生产减轻细胞损伤。相反,I1PP1击倒加剧了CaMKIIδ可变剪接障碍和加重H / R损伤后细胞损伤。I1PP1过度的保护作用可能归因于CaMKII选择性剪接的调控和抑制CaMKII活动和ox-CaMKII p-CaMKII。这些数据表明,I1PP1负监管的影响H / R损伤的心肌细胞通过CaMKII的监管。

衰减效应的保护机制在H / R损伤I1PP1超表达可能与ROS抑制有关。据我们所知,过量的活性氧通常导致几种类型的病理损害包括心肌肥厚(65年,66年),肝损伤或纤维化67年,68年),肺损伤(69年),和神经细胞凋亡70年]。不饱和脂肪酸是至关重要的维持线粒体的完整性和功能,这是非常容易氧化损伤。氧化不饱和脂肪酸的增加直接受损的线粒体电子传递链的功能,从而进一步促进线粒体ROS生成更多[71年]。在H / R, ROS还诱导的线粒体通透性转换孔的几个小孔线粒体立即再灌注开始时(72年),导致线粒体基质肿胀和外膜完整性的破坏。此外,线粒体损伤也直接阻碍了细胞ATP的生产和存储。因此,保持正常的线粒体的结构和功能是细胞生存的关键73年,74年]。我们目前的结果表明,H / R降低线粒体膜电位和促进活性氧积累。I1PP1成功抑制PP1表达式后,CaMKII途径,细胞损伤,ATP生产,线粒体膜电位以及活性氧积累显著恢复。此外,CaMKII-specific抑制剂KN93进一步应用于阐明CaMKII的负调控之间的因果关系和心肌细胞的保护作用。我们的数据表明,KN93能够衰减后全球细胞和线粒体ROS H / R。我们还发现I1PP1超表达有或没有CaMKII抑制由KN93同样减少LDH释放,削弱了ROS生产,增加线粒体膜电位在心肌细胞H / R。完全,它建议I1PP1过度减毒通过抑制心肌细胞损伤应力条件下CaMKII激活。

动态聚变和裂变有利于维持线粒体的结构和功能,妥善应对频繁变化的环境条件(75年]。OPA1定位在线粒体内膜(IMM)和膜间隙控制IMM融合和痰结构(76年]。OPA1缺乏促进线粒体分裂和痰重塑异常抑制呼吸能力和抑制mitochondria-dependent细胞代谢(77年,78年]。此外,OPA1也阻止了细胞色素C再分配和释放抑制细胞损伤(54]。相反,DRP1验证调节线粒体分裂(79年]。在我们目前的研究中,hypoxia-reoxygenation OPA1和DRP1心肌细胞的不平衡引起的,这将导致致命的损伤线粒体的形态和功能。过度的I1PP1逆转之间的比例失衡OPA1和DRP1正常维持线粒体内稳态。

然而,有几个在我们当前研究的局限性。首先,人类心肌细胞的使用和测量CaMKII水平将大大受益扩展这项研究的意义,这将直接演示的真正影响I1PP1超表达为人类心肌细胞。然而,人类心肌细胞无法在目前的研究。其次,由于实验策略主要依赖于I1PP1的过度表达,目前尚不清楚内生I1PP1有一个重要的角色在新生儿H / R损伤心肌细胞。可拆卸的方法进行I1PP1除了超表达。然而,CaMKII的检测活动和CaMKII磷酸化以及PP1水平是无法在目前的研究中,这将是一个巨大的好处来验证的效果和机理I1PP1 H / R损伤的心肌细胞。

集体,I1PP1过度修正CaMKII的障碍δ可变剪接,抑制CaMKII磷酸化,抑制CaMKII氧化、抑制ROS生产,减毒H / R损伤的心肌细胞(图13)。本研究有助于提供新的生物目标心肌缺血再灌注损伤的预防和治疗诊所。


图13
I1PP1过度修正CaMKIIδ可变剪接紊乱,抑制CaMKII磷酸化,抑制CaMKII氧化、抑制ROS生产,减毒hypoxia-reoxygenation损伤心肌细胞。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

琴罗,陈蜀歌,云本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

工作资助81670243,81873470,和81770279中国国家自然科学基金资助BK20151276江苏省自然科学基金的一个主要项目的自然科学研究中国江苏高等教育机构(18 kja310005),江苏省六大人才高峰计划wsn -(2018 - 062),中国博士后科学基金会的拨款(2017 t120449 m610342和2019年),江苏计划项目博士后研究基金(1701050 a),江苏省研究生研究和创新项目(KYCX18_2401),和小分子化合物的南通大学合作创新项目的研发(NTU2016-1)。